Circ_0032821/miR-936/CEP55調控軸在胃癌組織中的表達及與臨床特征之間的關系

鄭嫻嫻,高 明

1.合肥市第一人民醫(yī)院南區(qū)濱湖醫(yī)院檢驗科,安徽合肥 230000;2.安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院急診外科,安徽合肥 230000

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤,起源于胃黏膜上皮,作為世界位列第五的惡性腫瘤,超過70%的新發(fā)病例出現(xiàn)在亞洲,尤以我國更為明顯[1-2]。目前,內鏡結合病理檢查是診斷胃癌的金標準,根治性手術切除是治療的主要方式,然而,有些患者發(fā)現(xiàn)時已屬晚期,姑息性切除嚴重影響患者生存時間。因此如何尋找胃癌的特異性血清標志物及在分子水平上為胃癌的治療提供靶點尤為重要。環(huán)狀RNA(circRNA)作為microRNA(miRNA)的“分子海綿”與miRNA互補結合,調控其生物學功能,與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、遷移及耐藥密切相關,已成為腫瘤領域研究的熱點[3-4]。本研究基于微陣列數(shù)據(jù),通過生物信息學和多個數(shù)據(jù)庫的聯(lián)合應用,構建胃癌相關競爭性內源RNA(ceRNA)調控網絡,在人胃癌組織中進行初步驗證,并分析其與臨床特征之間的關系,期待為胃癌治療提供潛在靶點。

1 資料與方法

1.1公共數(shù)據(jù)庫資料 本研究使用美國國立生物技術信息中心(NCBI)的基因表達圖譜數(shù)據(jù)庫(GEO)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中的基因芯片數(shù)據(jù)集構建ceRNA調控網絡,GSE78092(3個胃癌腫瘤標本、3個配對的正常組織標本)用于篩選差異表達的circRNA(DECs)[5];GSE23739(40個胃癌腫瘤標本、40個正常組織標本)用于篩選差異表達的miRNA(DEMs)[6];GSE65801(32個胃癌腫瘤標本、32個配對的正常組織標本)用于篩選差異表達的mRNA(DEGs)[7]。癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫中胃癌組織標本343個,正常組織標本30個,下載數(shù)據(jù)及臨床資料后用于ceRNA網絡中mRNA表達驗證及臨床資料分析。

1.2標本來源 標本來源于安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院急診外科2020年1月至2022年5月行手術治療的40例胃癌患者的胃癌組織及其配對的癌旁正常黏膜組織,入選標準為首次發(fā)現(xiàn)的胃癌患者,且術前未接受過化療、中藥等任何治療措施,所有標本離體后立即留取胃癌組織及其配對的癌旁正常黏膜組織,置于液氮中保存,余下標本送病理學檢查。所有入組患者均記錄完整病例資料,包括性別、年齡、腫瘤最大徑、腫瘤浸潤深度、有無淋巴結轉移及臨床分期。本研究經安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者均簽署知情同意書,自愿參與本研究。

1.3方法

1.3.1circRNA、miRNA和mRNA的差異表達分析 首先對基因芯片數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)進行背景校正和標準化處理,使用R語言(https://www.r-project.org/)“l(fā)imma”[8]包篩選差異表達的circRNA、miRNA及mRNA,“pheatmap”包繪制熱圖。使用表達倍數(shù)(FC)比較差異表達大小。circRNA篩選標準為|logFC|>2和adj.P<0.05。miRNA和mRNA篩選標準為|logFC|>1,adj.P<0.05。

1.3.2ceRNA調控網絡的構建 根據(jù)基因芯片數(shù)據(jù)集中circRNA差異表達分析結果,使用circBase(http:// www.circbase.org/)和CSCD數(shù)據(jù)庫(http://http://gb.whu.edu.cn/CSCD/)預測 circRNA與miRNA之間的調控關系并與DEMs取交集。取交集后的miRNA分別使用miRTarBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫預測mRNA,同時出現(xiàn)在兩個數(shù)據(jù)庫中的mRNA納入miRNA-mRNA調控對。同時滿足以下條件構建ceRNA網絡:(1)circRNA、miRNA、mRNA在各自數(shù)據(jù)集中均差異表達;(2)基于共享的miRNA構建circRNA-miRNA、miRNA-mRNA關系對;(3)circRNA-miRNA、miRNA-mRNA均成負向調控關系。最后利用Cytoscape軟件(版本3.9.0)對調控網絡進行可視化。

1.3.3GO和KEGG富集分析 采用R語言“clusterProfiler”[9]對DEGs進行基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)通路富集分析,并用“enrichplot”包對富集結果進行可視化,篩選條件為P<0.05。

1.3.4ceRNA網絡中mRNA的表達驗證及生存分析 下載TCGA數(shù)據(jù)庫中胃腺癌臨床資料及RNA轉錄組數(shù)據(jù),利用“survival”包對數(shù)據(jù)進行生存分析,“survminer”包進行生存曲線的繪制。

1.3.5circ_0032821-miR936-CEP55調控軸在胃癌組織中的表達 (1)RNA提取:稱取組織50～100 mg,剪碎,液氮研磨成粉末狀,收集粉末,加入1 mL TRIzol(由Life technogies公司提供)裂解,裂解完全后,加入0.2 mL氯仿,劇烈振蕩15 s,室溫放置5 min,余下步驟按說明書進行。(2)cDNA第一鏈合成:根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒(由TaKaRa公司提供)步驟進行,各監(jiān)測指標及內參引物見表1,引物由上海生工生物工程(上海)股份有限公司合成,其中β-actin為circ_0032821和CEP55的內參基因,U6為miR936的內參基因。(3)實時熒光定量聚合酶鏈反應:依據(jù)Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus熒光定量試劑盒(由近岸蛋白公司提供)步驟進行,循環(huán)參數(shù)如下:95 ℃ 1 min 預變性,95 ℃ 20 s、60 ℃ 1 min,擴增40個循環(huán),應用2-ΔΔCt方法計算結果。

表1 各監(jiān)測指標及內參引物信息

1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析,計數(shù)資料采用百分比(%)表示,組間比較采用Fisher確切概率法;計量資料的組間比較采用獨立標本t檢驗;連續(xù)性變量之間的相關性分析采用Pearson相關性分析,Graphpad prism 9軟件用于圖表的繪制,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1circRNA、miRNA和mRNA的差異表達結果及ceRNA調控網絡的構建 數(shù)據(jù)集GSE78092篩選得到DECs 32個,其中上調circRNA 6個,下調circRNA 26個(圖1A);數(shù)據(jù)集GSE23739篩選得到DEMs 127個,其中上調miRNA 66個,下調miiRNA 61個(圖1B);數(shù)據(jù)集GSE65801篩選得到DEGs 2 222個,其中上調mRNA 1 082個,下調mRNA 1 140個(圖1C)。

注: A、B、C分別為差異表達circRNA、miRNA、mRNA熱圖,紅色代表上調,藍色代表下調;D為目標miRNA選取韋恩圖(diff miRNA為GSE23739中差異表達的miRNA;MRE為DECs預測的miRNA);E為目標mRNA選取韋恩圖(diff mRNA為GSE65801中差異表達的mRNA;miRNA target為DEMs預測的mRNA);F為circRNA-miRNA-mRNA調控網絡,菱形、三角形、圓形分別代表circRNA、miRNA、mRNA;紅色表示上調,黃色表示下調。

32個DECs經circBase和CSCD數(shù)據(jù)庫預測后,circRNA與miRNA之間共有1 745個調控關系對,包含1 131個miRNA,與DEMs取交集后得到交叉miRNA 12個,見圖1D。取交集后的miRNA經miRTarBase和TargetScan在線預測并取交集后得到mRNA 1 973個,與GSE65801數(shù)據(jù)集中的DEGs取交集,得到交叉mRNA 156個,見圖1E?；赾eRNA構建理論,篩選出21個circRNA-miRNA-mRNA調控軸,其中circRNA 6個、miRNA 4個、mRNA 21個,Cytoscape軟件可視化后見圖1F。

2.2GO和KEGG富集分析結果 對156個交叉得到的DGEs進行功能分析。GO 分析顯示mRNA參與腺體發(fā)育、膠原激活信號通路、異種刺激反應等生物過程;KEGG富集注釋表明差異基因主要參與p53、PI3K-Akt、細胞黏附分子等信號通路,見圖2A、B。

注:A、B分別為排名前5的GO分析及KEGG分析結果;C、D分別表示CCDC80及CEP55在TCGA數(shù)據(jù)庫中的生存分析結果;E、F分別表示CCDC80及CEP55在TCGA數(shù)據(jù)庫中差異表達;與正常組織比較,*P<0.05。

2.3ceRNA網絡中mRNA表達驗證及生存分析 TCGA數(shù)據(jù)庫中有關胃癌腫瘤標本343個,正常組織標本30個,數(shù)據(jù)下載集整理后對ceRNA網絡中的21個mRNA進行生存分析發(fā)現(xiàn)CCDC80和CEP55能夠影響胃癌患者生存時間,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2C、D。對以上兩個基因再次進行表達量的驗證后發(fā)現(xiàn)CCDC80在胃癌腫瘤標本及正常組織標本中比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),而CEP55在胃癌腫瘤標本中的表達顯著高于正常組織標本中的表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2E、F,最終確定circ_0032821-miR936-CEP55調控軸可能在疾病的發(fā)生、發(fā)展中具有調控作用。

2.4circ_0032821-miR936-CEP55調控軸在人胃癌組織中的表達及相關性分析 應用實時熒光定量聚合酶鏈反應的方法對40例胃癌組織及其癌旁正常黏膜組織中circ_0032821、miR936及CEP55的表達量進行檢測,結果顯示circ_0032821及CEP55在胃癌組織中高表達,而miR936在胃癌組織中低表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3 A、B、C。相關性分析發(fā)現(xiàn)circ_0032821與miR-936、CEP55分別呈負相關和正相關(均P<0.05),而miR-936與CEP55之間無相關性(P=0.057)。見圖3 D、E、F。上述結果驗證了通過生信分析的方法篩選出的circ_0032821-miR936-CEP55調控軸在胃癌組織中的初步表達情況。

注:A～C表示 circ_0032821、miR-936、CEP55在胃癌組織及癌旁正常黏膜組織中表達;與癌旁正常黏膜組織比較,*P<0.05;D～F 表示circ_0032821、miR-936、CEP55相關性分析。

2.5circ_0032821與胃癌患者臨床特征之間的相關性 根據(jù)circ_0032821分子表達水平的中位數(shù),將40例胃癌患者分為高表達組和低表達組,每組各20例,分析circ_0032821與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、腫瘤浸潤深度、有無淋巴結轉移及臨床分期之間的關系。經Fisher確切概率法檢驗后發(fā)現(xiàn)circ_0032821的表達與患者年齡、性別及腫瘤最大徑無相關,與臨床分期、浸潤深度和有無淋巴結轉移呈顯著相關,見表2。

表2 circ_0032821的表達水平與臨床特征之間的關系

3 討 論

環(huán)狀RNA在分類上歸屬于非編碼RNA,通過反向剪接方式形成既沒有5′帽子也沒有3′尾部的共價閉合環(huán)狀結構,不易被核酸外切酶降解,因此結構穩(wěn)定且高度保守[10]。作為競爭性內源RNA,circRNA可以充當miRNA的“分子海綿”與其互補結合,從而影響miRNA對其靶基因的調控功能。目前,國內外研究表明circRNA與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后密切相關[11-14]。本研究首先通過生物信息學技術和GEO數(shù)據(jù)庫的聯(lián)合應用構建了胃癌中由circRNA介導的原始 ceRNA調控網絡,并對GEO數(shù)據(jù)庫中差異表達mRNA進行功能富集分析,以判斷其行使的生物學功能,接著通過TCGA數(shù)據(jù)庫對DEGs進行生存分析,挖掘胃癌預后相關基因,通過表達驗證提取關鍵子網,確定可能影響胃癌患者預后的關鍵網絡,最后通過人胃癌組織標本初步驗證ceRNA調控網絡的表達及與臨床特征之間的關系。

miRTarBase和TargetScan數(shù)據(jù)庫中同時出現(xiàn)的mRNA與GSE65801數(shù)據(jù)集中的DEGs取交集后經富集分析發(fā)現(xiàn)其中一些mRNA參與腺體發(fā)育、膠原激活信號通路、異種刺激反應等生物過程;KEGG富集注釋表明差異基因主要參與p53、PI3K-Akt、細胞黏附分子等信號通路,而這些通路均在以往的研究中被證實在分子水平上參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展[15-17]?；赾eRNA構建理論,篩選出 6個circRNA、4個miRNA 、21個mRNA用于構建circRNA-miRNA-mRNA調控網絡,結合TCGA數(shù)據(jù)庫中有關胃癌的數(shù)據(jù)資料,經生存分析及表達驗證后最終確定circ_0032821-miR-936-CEP55調控軸可能是影響疾病發(fā)生、發(fā)展及預后的關鍵子網。

JIANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)Circ_0032821通過激活MEK1/ERK1/2信號通路誘導人胃癌細胞增殖、上皮間質轉化、遷移、侵襲和自噬抑制,表明circ_0032821在胃癌中具有致癌作用。LIU等[19]研究則證實過表達后的miR-936通過Akt相關信號通路靶向調控ERBB4抑制胃癌細胞增殖和侵襲并促進細胞凋亡,為miR-936/ERBB4調控軸治療胃癌提供了新的見解。CEP55作為卷曲螺旋蛋白質家族中的一員,對細胞周期過程有重要的調控作用,加強了多種腫瘤細胞的遷移、侵襲能力[20-21],同時,TAO等[22]和HUANG等[23]團隊的研究均證實CEP55與胃癌的不良預后密切相關。為了進一步證實生物信息學技術挖掘的科學性、可行性,收集了40例胃癌患者的胃癌組織及其配對的癌旁正常黏膜組織標本,利用實時熒光定量聚合酶鏈反應的方法檢測兩組標本中circ_0032821、miR936及CEP55的表達水平,結果顯示circ_0032821及CEP55表達水平在胃癌組織中顯著升高,而miR936明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),初步驗證了生信挖掘結果的科學性、可行性。目前有關circ_0032821、miR-936、CEP55與胃癌之間的關系已見報道,但三者之間是否存在circ_0032821-miR-936-CEP55調控關系尚未被證實,進一步通過相關性分析發(fā)現(xiàn),circ_0032821與miR-936、CEP55分別呈負相關和正相關,差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),然而miR-936與CEP55之間無相關性(P=0.057),究其原因可能與標本量偏小有關。結合生信分析及相關性分析結果,推斷circ_0032821、miR-936、CEP55之間存在競爭性調控關系,未來擬通過細胞功能實驗、裸鼠成瘤實驗等進一步驗證circ_0032821、miR-936、CEP55三者之間的分子調控機制。除此以外,還初步分析了circ_0032821與胃癌患者臨床特征之間的關系,根據(jù)circ_0032821在胃癌組織中表達水平的中位數(shù),將40例胃癌患者分為circ_0032821高表達組及低表達組,經Fisher確切概率法檢驗后發(fā)現(xiàn)circ_0032821的表達與患者年齡、性別及腫瘤最大徑無相關性,與臨床分期、浸潤深度和有無淋巴結轉移呈顯著相關,而臨床分期、浸潤深度及淋巴結轉移情況均是影響胃癌患者預后的因素,因此,circ_0032821的表達水平可能在分子水平上影響胃癌患者的預后。

本研究首先利用生物信息學技術分析了GEO數(shù)據(jù)庫中有關circRNA、miRNA和mRNA的芯片數(shù)據(jù),構建了circRNA-miRNA-mRNA調控網絡,隨后通過TCGA數(shù)據(jù)庫驗證并發(fā)現(xiàn)circ_0032821可能通過吸附hsa-miR-936上調CEP55促進胃癌發(fā)生發(fā)展。其次初步驗證了circ_0032821-miR936-CEP55調控軸在人胃癌組織標本中的表達,并發(fā)現(xiàn)circ_0032821與影響胃癌預后密切相關,這可能為胃癌的早期診斷提供新的分子標志物,為分子治療提供潛在靶點。