高毒力肺炎克雷伯菌的臨床特征及分子流行病學(xué)研究

幸 運(yùn),袁其米,覃曉宇,魯衛(wèi)平,李 進(jìn),唐 霜

中國(guó)人民解放軍陸軍特色醫(yī)學(xué)中心檢驗(yàn)科,重慶 400042

肺炎克雷伯菌是醫(yī)院及社區(qū)感染的重要條件致病菌,也是我國(guó)腸桿科細(xì)菌中排名第二的條件致病菌,近年來(lái)耐藥性也不斷上升[1]。在20世紀(jì)90年代,有研究報(bào)道了一種獨(dú)特的社區(qū)獲得性、組織侵襲性肺炎克雷伯菌感染的臨床綜合征,主要表現(xiàn)為化膿性肝膿腫,感染灶可出現(xiàn)在多個(gè)部位并可能發(fā)生轉(zhuǎn)移性傳播[2],臨床上,該菌相比于經(jīng)典肺炎克雷伯菌,感染性更強(qiáng)、轉(zhuǎn)移程度更高、預(yù)后也較差,因此將其定義為高毒力肺炎克雷伯菌。高毒力肺炎克雷伯菌感染特征是其主要是社區(qū)獲得性的,能感染任何年齡的健康個(gè)體,對(duì)抗菌藥物敏感,且傾向于在感染后發(fā)生轉(zhuǎn)移[3],肺炎克雷伯菌在高毒力和多重耐藥基因上并沒(méi)有重疊[4],即高毒力不一定高耐藥。但隨著抗菌藥物的廣泛使用及耐藥質(zhì)粒的傳播,高毒力肺炎克雷伯菌耐藥性不斷提高,逐漸出現(xiàn)了碳青霉烯的耐藥株,給臨床治療帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn),相關(guān)數(shù)據(jù)顯示高毒力肺炎克雷伯菌可能正在逐漸代替經(jīng)典肺炎克雷伯菌成為臨床主要的致病類型[5]。因此,亟待進(jìn)一步提高治療質(zhì)量,快速做出診斷,為臨床治療提供幫助,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集2021年1—3月本院住院及門(mén)診132名患者臨床分離的肺炎克雷伯菌145株,根據(jù)臨床資料剔除同一患者同一部位菌種,其中高毒力肺炎克雷伯菌56株,經(jīng)典肺炎克雷伯菌89株?；颊咧饕獮橹欣夏耆?50歲以上患者人數(shù)116人(占80.0%),最小患者年齡為11歲。

1.2儀器與試劑 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào)ST8R)、IKA干浴鍋、混勻器(型號(hào)Votex3)、賽多利斯電子天秤(型號(hào)BSA223S)、 PCR儀(Applied Biosystems公司,型號(hào)2720)、BIO-RAD化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號(hào)ChemiDoc XRS+)、BIO-RAD電泳儀。引物由北京六合華大基因有限公司合成,其他試劑包括核酸染料(北京鼎盛生物有限公司)、BBI瓊脂糖粉、DL2000 DNA 標(biāo)志物、GoTaq?Green Master Mix、無(wú)菌水。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌核酸提取 145株細(xì)菌轉(zhuǎn)種血平板,37 ℃培養(yǎng)24 h后,選取拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性的菌種;即用接種環(huán)在血平板上垂直向上挑起1～2個(gè)菌苔,若有拉絲,其拉絲長(zhǎng)度≥5 mm的菌種為拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性[6]。本實(shí)驗(yàn)提取核酸的方法是煮沸法。用接種環(huán)刮取1～2環(huán)菌苔加入約150 μL無(wú)菌水中,混勻,100 ℃煮沸10 min,及時(shí)取出,在12 000 r/min,4 ℃離心10 min,分離取出上清,提取的核酸-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2細(xì)菌核酸擴(kuò)增 本實(shí)驗(yàn)采用PCR對(duì)細(xì)菌核酸進(jìn)行擴(kuò)增。PCR設(shè)置條件:95 ℃預(yù)變性2 min,72 ℃變性15 s,55 ℃退火15 s,30次循環(huán),72 ℃延伸5 min,4 ℃保持。PCR反應(yīng)體系:總體積25.0 μL,2×TaqFrogga Mix 12.5 μL,上游引物1.0 μL,下游引物1.0 μL,DNA模板1.5 μL,無(wú)菌水9.0 μL。本實(shí)驗(yàn)各引物、產(chǎn)物長(zhǎng)度和PCR條件見(jiàn)表1。

表1 各基因引物、產(chǎn)物大小、PCR反應(yīng)條件

1.3.3瓊脂糖凝膠電泳 緩沖液為0.5×TBE,瓊脂凝膠配比為0.5 g瓊脂糖粉加入到50 mL預(yù)配緩沖液,在微波爐中加熱,每分鐘旋轉(zhuǎn)1次,直至瓊脂糖完全溶解。冷卻一段時(shí)間后向其中加入核酸染料0.5 μL,輕輕混勻,避免產(chǎn)生氣泡。冷卻至60 ℃,準(zhǔn)備好凝膠托盤(pán)以倒入凝膠,使其在凝固前不會(huì)流出,將梳子置于凹槽中,并將托盤(pán)置于平坦水平位置。慢慢倒入瓊脂糖溶液,使其均勻地分布在托盤(pán)內(nèi),在室溫下固化。取出梳子,將凝膠轉(zhuǎn)移到電泳槽,加入0.5×TBE緩沖液,直到凝膠被緩沖液覆蓋。用移液槍將擴(kuò)增產(chǎn)物及DNA 標(biāo)志物加入孔中,上樣量均為0.5 μL,蓋上電泳槽蓋,連接電源,調(diào)整電壓120 V,電泳時(shí)間為30 min。電泳完畢將凝膠轉(zhuǎn)移至凝膠成像儀,獲取凝膠圖像,DNA 標(biāo)志物及陽(yáng)性樣本可顯示有亮帶。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用WHONET 5.6軟件對(duì)菌株的臨床分布和耐藥特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因陽(yáng)性率比較 收集的145株菌種中初篩陽(yáng)性的高毒力肺炎克雷伯菌56 株,陽(yáng)性率為38.62%(56/145),經(jīng)典肺炎克雷伯菌89株經(jīng)典肺炎克雷伯菌,陽(yáng)性率為61.38%(89/145)。對(duì)56株初篩陽(yáng)性的高毒力肺炎克雷伯菌核酸擴(kuò)增和凝膠電泳,檢測(cè)結(jié)果顯示,56株初篩陽(yáng)性菌株中,iucA基因陽(yáng)性菌53株(94.64%),iroB基因陽(yáng)性菌54株(96.42%),terB基因陽(yáng)性菌51株(91.07%),peg-344基因陽(yáng)性菌55株(98.21%),peg-589基因陽(yáng)性菌51株(91.07%),p-rmpA基因陽(yáng)性菌51株(91.07%),p-rmpA2基因陽(yáng)性菌51株(91.07%),c-rmpA基因陽(yáng)性菌僅有4株(7.14%)。除c-rmpA外,其余高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因陽(yáng)性率均在90%以上,peg-344陽(yáng)性率最高,為98.21%。同一基因兩種引物的結(jié)果相關(guān)性也較為明顯,見(jiàn)圖1。

圖1 高毒力肺炎克雷伯菌毒力基因陽(yáng)性率比較

2.2菌株標(biāo)本來(lái)源 145株菌株標(biāo)本主要分離自痰液91株,其次為尿液15株、血液12株、分泌物8株、膿液7株、灌洗液6株、膽汁3株、腹水2株、腦脊液1株。

2.3菌株感染患者年齡段分布 145株菌株感染患者年齡分布依次為11～<20歲 1人(占0.69%),20～<30歲6人(占4.14%),30～<40歲8人(占5.51%),40～<50歲14人(占9.66%),50～<60歲35人(占24.14%),60～<70歲44人(占30.34%),70～<80歲27人(占18.62%),80～<90歲5人(占3.45%),≥90歲5人(占3.45%),其中60～<70歲患者人數(shù)最多,11～<20歲患者人數(shù)最少,50歲以上患者人數(shù)明顯增多。

2.4菌株來(lái)源科室分布情況 145株菌株來(lái)源于24個(gè)科室,菌株來(lái)源最多科室是重癥監(jiān)護(hù)室,其次是神經(jīng)外科、神內(nèi)科監(jiān)護(hù)室和胸外科。見(jiàn)表2。

表2 菌株來(lái)源科室分布情況

2.5經(jīng)典肺炎克雷伯菌與高毒力肺炎克雷伯菌耐藥率比較 89株經(jīng)典肺炎克雷伯菌與56株高毒力肺炎克雷伯菌耐藥性分析見(jiàn)表3?？死撞鷮賹?duì)氨芐西林和替卡西林天然耐藥,因此未在表3中列出。

表3 經(jīng)典肺炎克雷伯菌與高毒力肺炎克雷伯菌耐藥率比較[n(%)]

3 討 論

高毒力肺炎克雷伯菌已經(jīng)被報(bào)道多年,但高毒力肺炎克雷伯菌并無(wú)統(tǒng)一明確的定義,在對(duì)其進(jìn)行劃分時(shí)也有多種不同的分類方法,目前分類方法如下:(1)基于臨床特征的分類,即造成嚴(yán)重感染如肝膿腫、腦膜炎、肺炎等;(2)基于細(xì)菌學(xué)表型的分類,高毒力肺炎克雷伯菌的細(xì)菌學(xué)特征之一是其具有高黏液表型[7],這種特征表現(xiàn)在拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性,即用用接種環(huán)豎直向上輕輕挑起單個(gè)菌落,若挑起的黏液絲長(zhǎng)度≥ 5 mm,則為拉絲試驗(yàn)陽(yáng)性,稱其為具有高黏液表型,在血瓊脂平板上,高毒力肺炎克雷伯菌通常呈高黏稠性,并與鄰近菌株相互融合[8],但其在發(fā)病率低的地區(qū),高黏液表型的特異性并不高,因此學(xué)者們更多地把它作為一種初篩方法,也是最為簡(jiǎn)便的方法;(3)基于細(xì)菌標(biāo)志物的定義,研究發(fā)現(xiàn)高毒力肺炎克雷伯菌存在一種毒力質(zhì)粒 PLVPK,可編碼一系列毒力相關(guān)因子,缺乏該質(zhì)?？蓪?dǎo)致高毒力肺炎克雷伯菌菌株毒力降低[9],可用于分類高毒力肺炎克雷伯菌,但對(duì)于怎么進(jìn)行分類,用哪些毒力基因進(jìn)行分類,尚無(wú)明確定義,不過(guò)針對(duì)此分類,可以用于研究快速檢測(cè)高毒力肺炎克雷伯菌核酸的方法,可以不需借助臨床特征判斷是否是高毒力肺炎克雷伯菌,應(yīng)用范圍較廣[10]。

目前研究發(fā)現(xiàn),高毒力肺炎克雷伯菌相對(duì)于經(jīng)典肺炎克雷伯菌,具有更強(qiáng)的毒力和致病力,高毒力肺炎克雷伯菌在全球范圍內(nèi)都有病例出現(xiàn)[11]。馮相銘等[12]對(duì)廣東省102株肺炎克雷伯菌臨床分離株病原特征分析發(fā)現(xiàn),47.06%為高毒力肺炎克雷伯菌。有研究報(bào)道,導(dǎo)致患者血流感染、肺部感染及腹腔感染的230株肺炎克雷伯菌的多中心研究發(fā)現(xiàn),37.8%為高毒力肺炎克雷伯菌[13]。本院初篩陽(yáng)性的高毒力肺炎克雷伯菌56 株,陽(yáng)性率為38.62%,與上述報(bào)道比例吻合。

89株經(jīng)典肺炎克雷伯菌與56株高毒力肺炎克雷伯菌耐藥性分析結(jié)果顯示,兩者對(duì)β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性較高;具體比較而言,氨基糖苷類(慶大霉素)的耐藥率(14.6%vs.31.5%);喹諾酮類(左氧氟沙星)的耐藥率(14.3%vs.29.2%);頭孢類的耐藥率[頭孢他啶(17.9%vs.31.5%)、頭孢曲松(19.6%vs.44.9%)、頭孢吡肟(10.7%vs.42.7%)]。高毒力肺炎克雷伯菌與經(jīng)典肺炎克雷伯菌對(duì)碳青霉烯類(亞胺培南)抗菌藥物較為敏感,耐藥率分別為3.6%和27.0%,可以看出此類抗菌藥物高毒力肺炎克雷伯菌耐藥率明顯較低。2021年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南耐藥率為23.4%[14],與此數(shù)據(jù)比較,本院肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南的耐藥率17.9%(26/145)低于相關(guān)報(bào)道結(jié)果,這與本院結(jié)合病情合理利用抗菌藥物,以及采取限制超廣譜抗菌藥物的經(jīng)驗(yàn)用藥等策略有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示,50歲以上患者人數(shù)明顯增多,可以認(rèn)為中老年人更容易感染肺炎克雷伯菌,而且菌株來(lái)源最多科室是重癥監(jiān)護(hù)室,肺炎克雷伯菌在重癥患者中更為常見(jiàn),可能與患者收治時(shí)間長(zhǎng)、病情危重,抗菌藥物使用的劑量較大相關(guān);而患者標(biāo)本的采集部位,62.76%來(lái)自痰液,痰液是相對(duì)簡(jiǎn)便的采集標(biāo)本的方式,對(duì)于細(xì)菌檢查十分重要,痰液標(biāo)本占比較高也說(shuō)明與肺炎克雷伯菌定植呼吸道有關(guān)[15]。

雖然有研究表明,肺炎克雷伯菌多重耐藥與高毒力并不存在聯(lián)系,即高毒力肺炎克雷伯菌雖然具有高致病力但對(duì)抗菌藥物的耐藥性并不高,推測(cè)有可能是因高毒力肺炎克雷伯菌菌株不能獲得相關(guān)的耐藥質(zhì)粒,或者某些耐藥基因在菌株轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨玖赀^(guò)程中丟失[16];經(jīng)典肺炎克雷伯菌致病力相對(duì)不高,但因其耐藥基因攜帶率高使得對(duì)抗菌藥物敏感的概率增加,但隨著抗菌藥物的不斷使用和耐藥質(zhì)粒的傳播,高毒力肺炎克雷伯菌的耐藥性不斷提高,多重耐藥在高毒力肺炎克雷伯菌中也有病例出現(xiàn)。有研究報(bào)道,碳青霉烯類抗菌藥物是臨床治療多重耐藥菌的重要手段,但隨著抗菌藥物的不合理使用,肺炎克雷伯菌對(duì)多種抗菌藥物均出現(xiàn)了耐藥[17]。因此,如何應(yīng)對(duì)耐藥性的提高,提高治療質(zhì)量和效率,如何合理的用藥,對(duì)臨床已經(jīng)成為新的挑戰(zhàn)。由于本研究的菌株數(shù)并不大,所得結(jié)果可能存在局限性和偶然性,后續(xù)可以收集更多樣本進(jìn)行進(jìn)一步研究,也可以據(jù)毒力基因的檢測(cè)對(duì)現(xiàn)有檢測(cè)方法做出改進(jìn),提供更快速靈敏的檢測(cè)方式。

綜上所述,高毒力肺炎克雷伯菌在本院肺炎克雷伯菌的中比例并不低,數(shù)據(jù)也提示50歲以上中老年人感染肺炎克雷伯菌概率更大,并且重癥患者中分離出的肺炎克雷伯菌比例較高,因此及時(shí)就診治療是預(yù)防高毒力肺炎克雷伯菌感染轉(zhuǎn)移、病情加劇的重要方式。