某院金黃色葡萄球菌耐藥性分析及毒素基因與耐藥基因檢測

劉 玲,陳曉聰,李 璟,范 蕾,李卓禧,侯竹如,楊婭男,嚴榮榮,徐本錦▲

1.山西醫(yī)科大學汾陽學院醫(yī)學檢驗系,山西汾陽 032200;2.山西省汾陽醫(yī)院檢驗科,山西汾陽 032200;3.山西醫(yī)科大學汾陽學院基礎醫(yī)學部,山西汾陽 032200

金黃色葡萄球菌是造成感染性疾病和食物中毒的主要原因,可引起皮膚和軟組織感染、壞死性肺炎、敗血癥、中毒性休克綜合征和血液感染等多種疾病[1-3]。近年來,各類抗菌藥物的廣泛使用及濫用導致金黃色葡萄球菌耐藥性增強,并出現(xiàn)超級耐藥菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)。MRSA比甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)毒性更強。MRSA不僅對絕大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥,而且對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類、四環(huán)素類及喹諾酮類等抗菌藥物產(chǎn)生多重耐藥,目前已成為臨床抗感染治療的棘手問題,常導致治療失敗、醫(yī)療費用和病死率增加[4]。其中,苯唑西林敏感的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(OS-MRSA),因其對苯唑西林的敏感性,常導致藥敏試驗的錯誤識別,可能被錯誤地歸類為MSSA,導致潛在的治療失敗,目前有關山西地區(qū)OS-MRSA感染現(xiàn)狀的數(shù)據(jù)仍然有限。金黃色葡萄球菌的感染能力與其攜帶的毒素基因種類和數(shù)量有關。這些毒素基因編碼腸毒素(SEs)、腸毒素樣毒素(SEls)、殺白細胞素(PVL)、剝脫毒素(Ets)和中毒休克毒素-1(TSST-1)等多種毒力因子。除早期報道的5種經(jīng)典腸毒素基因(sea～see)外,還鑒定到十余種新型腸毒素基因(seg～sej、sel～seq、ser～set)[5]。殺白細胞素是由lukS-PV和lukF-PV兩個基因編碼的蛋白復合體,可引起皮膚、軟組織感染和嚴重的壞死性肺炎[6]。剝脫毒素主要引起皮膚散熱功能失調(diào),對嬰幼兒和兒童危害嚴重,目前已知的剝脫毒素基因主要有4種(eta～etd),其中剝脫毒素ETA和ETB與人類皮膚損傷關系密切[7]。中毒休克毒素-1是中毒休克綜合征的關鍵致病因子,可引起發(fā)熱、皮疹、低血壓、皮膚脫皮,并累及身體多個臟器[8]。掌握金黃色葡萄球菌的分子特征對于鑒別菌株間的親緣關系、分析傳播因素、查找傳染源并有效控制感染意義重大。本研究測定了山西省汾陽醫(yī)院20株金黃色葡萄球菌對15種常見抗菌藥物的耐藥性,利用PCR 技術檢測了菌株致病基因的攜帶情況,確定了菌株的耐藥譜、耐藥基因譜和毒素基因譜,旨在深入了解山西省汾陽醫(yī)院金黃色葡萄球菌的流行特點、毒力和耐藥機制,為有效防治該菌感染提供了科學依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1標本來源 2021年4-9月在山西省汾陽醫(yī)院分離到金黃色葡萄球菌20株(編號39～58),主要來自分泌物12株(編號40～45、47、49、51、52、57、58)和膿液8株(編號39、46、48、50、53～56),其中耳鼻咽喉科5株(編號39、45、46、50、57),新生兒科7株(編號40、42、44、47、52、55、56),兒科3株(編號41、53、58),骨科2株(編號49、51),內(nèi)分泌科(編號43)、普外科(編號54)和肛腸科(編號48)各1株。標準菌株ATCC25923和ATCC29213由本實驗室保存。

1.2儀器與試劑 dNTPs、Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer及DL1 000 DNA 標志物(大連寶生物),PCR引物(上海生工),6×DNA Loading buffer、Trans2K Plus DNA標志物及EasyPure?bacteria genomic DNA kit(北京全式金),NA-Green及TBE(碧云天),瓊脂糖(BIOWEST),PCR儀(Bio-Rad),NanoDrop One超微量紫外分光光度計(賽默飛世爾),VITEK2-Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析儀及配套藥敏卡GP67(法國生物梅里埃股份有限公司),BACTECFX全自動血培養(yǎng)系統(tǒng)及配套的血培養(yǎng)瓶(碧迪公司),血瓊脂平板(鄭州安圖生物)。

1.3方法

1.3.1菌株的分離鑒定及藥敏試驗 嚴格按照第4版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進行,將臨床送檢的各種分泌物、尿液等標本直接接種到血瓊脂平板,培養(yǎng)18～24 h,挑取可疑的菌落進行分純鑒定;血液標本注入血培養(yǎng)瓶上機培養(yǎng),待儀器檢測到細菌生長信號后再轉(zhuǎn)種到血瓊脂平板上培養(yǎng)18～24 h,挑取可疑的菌落進行鑒定;采用VITEK2-Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析儀檢測細菌的最低抑菌濃度(MIC)。

1.3.2基因組DNA提取 將分離株接種至血平板,37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取單菌落于8 mL LB液體培養(yǎng)基,37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h;取1 mL培養(yǎng)的菌液,用革蘭陽性菌基因組DNA提取試劑盒抽提菌株基因組DNA,NanoDrop One超微量紫外分光光度計定量后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,其余樣品置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3PCR反應體系及擴增條件 PCR體系為25.0 μL:滅菌超純水17.5 μL,10×PCR緩沖液2.5 μL,dNTPs 2.0 μL,DNA模板1.0 μL,正、反向引物各1.0 μL,Taq DNA聚合酶0.125 μL。外排泵基因、耐藥基因和毒素基因的引物序列和擴增條件分別參照文獻[9-11]執(zhí)行。

2 結(jié) 果

2.1耐藥率測定 金黃色葡萄球菌對青霉素的耐藥率最高(100%),其次是紅霉素和克林霉素(70%)。所有菌株對米諾環(huán)素、呋喃妥因、阿米卡星、萬古霉素和利奈唑胺敏感。見表1。

表1 金黃色葡萄球菌的耐藥率(n=20,%)

2.2耐藥譜分析 所有菌株對青霉素耐藥,有14株多重耐藥菌(耐藥譜≥3種抗菌藥物),占比為70%,其中四重耐藥菌、五重耐藥菌和六重耐藥菌各有2株(10%)。見表2。

表2 金黃色葡萄球菌的耐藥譜

2.3基因組DNA提取 金黃色葡萄球菌是革蘭陽性菌,細胞壁較厚,瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示,DNA條帶清晰、單一,相對分子質(zhì)量大小符合預期。見圖1。

注:M表示Trans2K Plus DNA標志物,1～10泳道表示編號39～48菌株。

2.4耐藥基因檢測 所有菌株共檢出9個耐藥基因和3株MRSA,其中1株為OS-MRSA(編號58菌株)。gyrA和grlA檢出率最高,均為100%;其次是ermC和tet(k),檢出率分別為95%和80%;再次是blaZ,檢出率為60%;Lin(A)和ermB檢出率分別為30%和20%;52、57和58號菌株為mecA陽性;aacA-aphD檢出率為5%;所有菌株均不攜帶ermA、fexA、tet(L)、tet(M)、tet(O)、optrA和cfr。部分檢測結(jié)果見圖2。

2.5耐藥基因譜分析 所有菌株至少攜帶3種及以上耐藥基因,占比最高的耐藥基因譜是ermC-gyrA-grlA-tet(k),占比為25%,其次是blaZ-ermC-gyrA-grlA-tet(k)-Lin(A),占比為20%。見表3。

表3 金黃色葡萄球菌的耐藥基因譜

2.6外排泵基因檢測 所有菌株共檢出6個外排泵基因,其中norB和mepA檢出率最高,均為100%;其次是norC和mdeA,檢出率分別為95%和90%;再次是norA,檢出率為70%;sepA檢出率為40%;所有菌株均不攜帶qacA/B和smr,部分檢測結(jié)果見圖3。

注:A表示nuc～smr基因電泳結(jié)果,M為DL1 000 DNA 標志物,1為nuc,2為mecA,3為norA,4為norB,5為norC,6為sepA,7為mepA,8為mdeA,9為qacA/B,10為smr;B表示外排泵基因mepA電泳結(jié)果,M為DL1 000 DNA 標志物,1～20泳道為mepA基因,菌株編號39～48。

2.7外排泵基因譜分析 所有菌株至少攜帶3個及以上外排泵基因,占比最高的外排泵基因譜是norA-norB-norC-sepA-mepA-mdeA(35%),其次是norA-norB-norC-mepA-mdeA,占比為30%。見表4。

2.8毒素基因檢測 所有菌株共檢出18個毒素基因,包括耐熱核酸酶基因nuc、殺白細胞素基因pvl、表皮剝脫毒素基因eta及15種腸毒素基因。其中nuc基因的檢出率(100%)最高;其次是腸毒素基因sei和selo,檢出率分別為55%和50%;再次是腸毒素基因seg和selp,檢出率分別為45%和40%;selk檢出率為35%;pvl、eta、seln、selq檢出率均為30%;seb、see、seh、sell、selm檢出率均為20%;sea和selu檢出率均為10%;sec檢出率為5%;所有菌株均不攜帶中毒休克癥毒素基因tst、表皮剝脫毒素基因etb及腸毒素基因sed、selj、ser。部分毒素基因檢測結(jié)果見圖4。

注:M表示DL1 000 DNA 標志物,1～24泳道為seg,1為ATCC29213-1,2為ATCC29213-2,3為ATCC25923-1,4為ATCC25923-2,5～24泳道為編號49～58菌株。

2.9毒素基因譜分析 所有菌株至少攜帶3種及以上毒素基因,nuc-see-selp和nuc-pvl-sell-selp在所有毒素基因譜中占比最高,均占比為10%,其他毒素基因譜均占比為5%。見表5。

表5 金黃色葡萄球菌的毒素基因譜

3 討 論

中國細菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(CHINET)顯示,中國MRSA分離株的檢出率在近五年逐年下降,從2005年的69.0%降低至2020年的31.0%(http://www.chinets.com/)。與CHINET數(shù)據(jù)相比,本研究MRSA檢出率(15%)比中國2020年的檢出率降低了16.0%。相比之下,2016年美國和南非的MRSA流行率分別為44%和27%,2017年澳大利亞和英國的MRSA流行率分別為19%和7%(https://resistancemap.cddep.org/)。以上結(jié)果表明,不同國家和省份MRSA的流行情況不同。

本研究所有菌株對青霉素耐藥(100%),對紅霉素、克林霉素的耐藥率為70%,這與LIU等[12]的報道基本一致。菌株對青霉素極高的耐藥率可能是其作為一種常用藥物,長期以來廣泛應用于葡萄球菌感染治療,并在金黃色葡萄球菌中建立了相當穩(wěn)定的耐藥性。然而耐藥基因檢測結(jié)果顯示,青霉素酶編碼基因blaZ的檢出率只有60%,這一差異提示可能存在其他青霉素耐藥機制。

本研究中,70%的菌株表現(xiàn)出多重耐藥,且大多數(shù)對青霉素、紅霉素和克林霉素表現(xiàn)出共同耐藥,這與PAHLAVANZADEH等[13]報道結(jié)果差異不大,但比LIU等[12]報道結(jié)果低10%。20株樣本中共檢出3株MRSA,其余17株為MSSA,其中多重耐藥株包括所有MRSA(100%,3/3)和11株MSSA(64.7%,11/17),MRSA中多重耐藥菌株的比例是MSSA的1.5倍,低于GAN等[14]報道的結(jié)果。這表明MRSA耐藥嚴重,可能是由于MRSA在獲得可移動遺傳元件方面的親和力增加,如轉(zhuǎn)座子或攜帶耐藥基因的接合質(zhì)粒[15]。值得注意的是,編號41菌株對苯唑西林的MIC為2 μg/mL,但未檢測到mecA基因,這可能mecA基因發(fā)生了點突變或缺失或由于抑制劑存在而導致PCR反應的假陰性[16],也可能是該菌攜帶其他耐藥基因如mecC[17],這一現(xiàn)象還在進一步研究中。菌株對利福平和慶大霉素的耐藥率僅為5.0%,且所有菌株對米諾環(huán)素、呋喃妥因、阿米卡星、萬古霉素及利奈唑胺敏感。這與文獻[18-19]報道結(jié)果相一致,表明這些藥物可能會成為臨床抗感染治療的首選。對耐藥譜進行分析后發(fā)現(xiàn),PEN-ERY-CLI(占比為40%)是最流行的耐藥譜,20%的菌株為五重和六重耐藥。因此,臨床治療應合理選用抗菌藥物以控制耐藥菌的出現(xiàn)和傳播。

本研究所有菌株都攜帶氟喹諾酮類耐藥基因grlA和gyrA,共檢出6個外排泵基因,其中norB和mepA檢出率最高(100%),其次是norC(95%)和mdeA(90%),再次是norA(70%),這與張行等[9]報道結(jié)果基本一致。然而菌株對喹諾酮類藥物諾氟沙星和左氧氟沙星的耐藥率僅為10%,這種高外排泵基因攜帶率與較低耐藥性之間的差異還有待深入研究。所有紅霉素耐藥菌除1株攜帶ermB基因外,其余菌株均攜帶ermC基因,說明在本研究中ermC基因是紅霉素耐藥的主要決定子,這與文獻[20]研究結(jié)果相一致。所有菌株的克林霉素耐藥基因Lin(A)檢出率為30%,遠低于克林霉素耐藥率(70%),提示菌株對克林霉素的耐藥可能是多基因聯(lián)合作用的結(jié)果。

本研究還鑒定到1株來自兒科分泌物的OS-MRSA,該菌對苯唑西林和頭孢西丁敏感但攜帶mecA基因。OS-MRSA早在多個國家和地區(qū)已有報道[21]。文獻[22-23]報道的OS-MRSA流行率僅為1.6%和1.8%,遠低于本研究的5%,這可能是本研究樣本量較小導致的。OS-MRSA對苯唑西林的敏感性容易導致常規(guī)藥敏試驗的錯誤識別,從而造成潛在的治療失敗[24],因此這種非典型MRSA值得高度關注。最近有研究報道,mecA基因的啟動子區(qū)、gryA/grlA基因和femA基因的突變與邊緣耐苯唑西林金黃色葡萄球菌和OS-MRSA有關[25],mecA基因的序列不穩(wěn)定性和bla表達調(diào)控系統(tǒng)的突變導致苯唑西林和頭孢西丁敏感MRSA產(chǎn)生[26-27]。筆者將在后續(xù)研究中對這株OS-MRSA進行全基因組測序分析,以深入揭示其遺傳和分子特征。耐藥基因譜統(tǒng)計結(jié)果顯示,所有菌株至少攜帶3個及以上耐藥基因,ermC-gyrA-grlA-tet(k)在所有耐藥基因譜中占比最高(25%),其次是blaZ-ermC-gyrA-grlA-tet(k)-Lin(A),占比為20%。

毒力因子與細菌的致病性密切相關,毒素基因檢測對于金黃色葡萄球菌的流行病學控制具有重要價值。eta和etb在金黃色葡萄球菌臨床株中的攜帶率較低,為0.5%～2.0%[28],而本研究eta基因的攜帶率高達30%,但未檢測到etb,提示剝脫毒素相關基因的全球流行趨勢可能具有時空和區(qū)域差異性。對毒素基因譜進行統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn),所有菌株至少攜帶3個及以上毒素基因,其中編號46、50、41菌株分別攜帶8、9、10個毒素基因,后續(xù)將對這3株菌進行深入研究,以揭示其毒力和致病機制。

綜上所述,本院金黃色葡萄球菌臨床分離株攜帶多種外排泵基因、耐藥基因和毒素基因,菌株的耐藥譜、耐藥基因譜和毒素基因譜廣,并出現(xiàn)MRSA菌株。最主要的耐藥譜和耐藥基因譜分別是PEN-ERY-CLI和ermC-gyrA-grlA-tet(k),norA-norB-norC-sepA-mepA-mdeA是最主要的外排泵基因譜,nuc-see-selp和nuc-pvl-sell-selp是最主要的毒素基因譜。臨床治療金黃色葡萄球菌引起的感染應優(yōu)先考慮米諾環(huán)素、呋喃妥因、阿米卡星、萬古霉素、利奈唑胺、復方磺胺甲噁唑及慶大霉素。此外,應繼續(xù)加強醫(yī)源性金黃色葡萄球菌的監(jiān)測和基礎研究,以深入揭示其致病性和耐藥機制。下一步將對編號41、44、46和50菌株進行深入研究,用這些菌株感染小鼠,篩選合適的抗菌藥物進行治療,并觀察治療前后小鼠各項指標的變化,從而揭示菌株的毒力和致病機制,以及通過全基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序和蛋白質(zhì)組學分析,揭示菌株的分子特征、差異表達基因和關鍵信號通路,可為開發(fā)靶向藥物和有效預防金黃色葡萄球菌感染提供科學依據(jù)。