藻藍(lán)蛋白對(duì)博來(lái)霉素肺纖維化小鼠腸道菌群的影響

臧 帆, 李文軍, 秦 松, 林 劍

藻藍(lán)蛋白對(duì)博來(lái)霉素肺纖維化小鼠腸道菌群的影響

臧 帆1, 2, 李文軍2, 3, 秦 松2, 3, 林 劍1

(1. 煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264005; 2. 中國(guó)科學(xué)院煙臺(tái)海岸帶研究所, 山東 煙臺(tái) 264003; 3. 中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071)

博來(lái)霉素(bleomycin, BLM)是目前用于治療頭頸癌等多種癌癥的藥物之一, 但會(huì)產(chǎn)生一系列副作用, 例如肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF), 這大大降低了患者的生活質(zhì)量。藻藍(lán)蛋白(phycocyanin, PC)作為一種色素蛋白對(duì)包括PF在內(nèi)的多種疾病具有調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn), 慢性腸道疾病通常伴有肺部疾病, 患者的腸道菌群會(huì)發(fā)生紊亂。針對(duì)上述線(xiàn)索, 研究了PC對(duì)BLM誘導(dǎo)的PF小鼠腸道菌群的影響。通過(guò)尾靜脈將BLM注入小鼠體內(nèi), 以構(gòu)建肺纖維化模型。然后通過(guò)16S rRNA高通量基因測(cè)序技術(shù), 分析了PC對(duì)BLM引起的PF小鼠腸道菌群的影響。結(jié)果表明, PC降低了BLM誘導(dǎo)的PF程度并調(diào)節(jié)了小鼠的腸道菌群。通過(guò)尾靜脈注射BLM后, 小鼠肺部受到損傷, 腸道菌群發(fā)生紊亂?？诜逅{(lán)蛋白干預(yù)后, 小鼠的肺組織切片顯示其膠原蛋白沉積減少, 肺泡間隔和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少, 小鼠PF程度減輕。此時(shí), 小鼠腸道菌群中、等有益菌的豐度增加,等有害菌的豐度降低, 腸道菌群趨于正常。推測(cè)PC可以通過(guò)增加腸道中有益細(xì)菌的數(shù)量并減少腸道中有害細(xì)菌的數(shù)量來(lái)調(diào)節(jié)尾靜脈注射BLM引起的腸道菌群失調(diào), 從而降低小鼠的PF程度。

藻藍(lán)蛋白; 博來(lái)霉素; 肺纖維化小鼠; 腸道菌群

博來(lái)霉素(bleomycin, BLM)是從輪狀鏈霉菌中分離出的一類(lèi)抗生素[1], 可以用于治療頭頸癌、鱗狀細(xì)胞癌、睪丸癌和某些淋巴瘤等癌癥[2]。但是, 使用BLM可能誘使患者發(fā)生肺炎樣癥狀以及肺纖維化(fulmonary fibrosis, PF), 甚至造成患者死亡[3]。BLM通過(guò)靜脈注射后, 迅速與血液中的二價(jià)銅離子結(jié)合并被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞中, 引起DNA損傷[4]。這會(huì)產(chǎn)生一系列的毒副作用, 其中主要影響了患者的肺組織和皮膚組織。研究表明, BLM誘導(dǎo)的肺毒性與PF的病理過(guò)程非常相似[5], 其特征均為上皮修復(fù)異常和細(xì)胞外基質(zhì)沉積紊亂?；颊唠S著肺功能喪失、呼吸衰竭等病癥的出現(xiàn), 逐漸走向死亡[6]。目前吡非尼酮和尼達(dá)尼布等藥物已在臨床上用于PF的長(zhǎng)期治療中, 但這些療法無(wú)法有效地阻止其進(jìn)一步發(fā)展, 同時(shí)經(jīng)常會(huì)引起不良副作用[7]。為了減輕患病人員的痛苦以及經(jīng)濟(jì)壓力, 亟需尋找可以更好延緩甚至治療PF病程的藥物和方法。

藻藍(lán)蛋白(phycocyanin, PC)是藻類(lèi)生物中的一類(lèi)色素蛋白, 主要存在于藍(lán)藻、紅藻以及部分隱藻, 此外, 在極少數(shù)甲藻(如藍(lán)裸甲藻)中也發(fā)現(xiàn)了PC的存在[8]。學(xué)者們已經(jīng)研究了PC的多種活性, 包括抗氧化性以及抗炎性等[9]。據(jù)報(bào)道, PC可以通過(guò)在早期抑制TLR2-MyD88-NF-κB信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖和分化, 從而在減輕肺損傷和纖維化過(guò)程中發(fā)揮作用[10]。

隨著對(duì)PF研究的深入,“腸-肺”軸的概念開(kāi)始得到認(rèn)可, 肺組織與腸道微生物之間存在重要串?dāng)_, 腸道菌群與肺部的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)息息相關(guān)[11]。前期的研究表明, 當(dāng)肺部受到刺激時(shí), 腸道微生物的功能發(fā)生紊亂, 促使脂多糖(LPS)的產(chǎn)生[12]。LPS通過(guò)與Toll樣受體4結(jié)合進(jìn)一步誘導(dǎo)肺部疾病[13]。PC干預(yù)可以影響腸道菌群的組成, 通過(guò)增加腸道微生物中雙歧桿菌和乳酸菌等有益細(xì)菌的相對(duì)豐度, 提高菌群的免疫力[14]。同時(shí)證明了PC干預(yù)能夠增加與短鏈脂肪酸生產(chǎn)相關(guān)細(xì)菌的含量, 例如費(fèi)氏桿菌和拉氏梭菌, 其通過(guò)促進(jìn)短鏈脂肪酸的合成, 增強(qiáng)了對(duì)G蛋白偶聯(lián)受體的抑制作用, 從而引起肺部的免疫調(diào)節(jié)[15]。

基于以上研究, 本研究采用尾靜脈注射BLM誘導(dǎo)小鼠PF, 并通過(guò)肺部病理切片染色及腸道微生物水平來(lái)評(píng)估PC對(duì)PF的影響。

1 材料與方法

1.1 倫理聲明

該研究所涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法均按照濱州醫(yī)學(xué)院《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)保護(hù)指南》制定, 實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)了山東國(guó)際生物技術(shù)園動(dòng)物保養(yǎng)委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料和動(dòng)物

30只雄性ICR小鼠, 6～8周齡, 體重18～22 g, 購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育中心[許可證號(hào): SCXK(魯) 20140007]。動(dòng)物房嚴(yán)格控制12 h/12 h明/暗循環(huán), 環(huán)境溫度在(23±2) ℃, 環(huán)境濕度在50%～60%, 小鼠自由飲食, 適應(yīng)性培養(yǎng)1周。

PC從螺旋藻中提取, 購(gòu)自新大澤螺旋藻有限公司(中國(guó)福清)。小鼠飼料購(gòu)自濟(jì)南朋悅動(dòng)物繁育中心(中國(guó)濟(jì)南)。HE和masson染色試劑盒購(gòu)自solarbio (中國(guó)北京)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

小鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后, 根據(jù)體重按SPSS隨機(jī)分為3組: 對(duì)照組(Con組)、多次靜脈注射組(R組)、多次靜脈注射+藻藍(lán)蛋白組(RPC組), 每組10只。R組和RPC組小鼠經(jīng)尾靜脈注射博來(lái)霉素10 mg/kg, 每周2次, 共8次; RPC組每天灌胃50 mg/kg藻藍(lán)蛋白; Con組小鼠通過(guò)尾靜脈注射等量0.9% NaCl 溶液, 每周2次, 共8次。

在實(shí)驗(yàn)期間, 檢測(cè)小鼠的活動(dòng)狀態(tài)、飲食、體重和死亡情況。

1.4 樣品采集與處理

在第一次BLM處理后的第14、28 d, 每組隨機(jī)選取5只小鼠進(jìn)行處死, 取出其左肺置于4%多聚甲醛中固定48 h; 在第28 d時(shí), 早6點(diǎn)將每只小鼠置于單獨(dú)的無(wú)菌籠中, 同時(shí)采用無(wú)菌凍存管收集約150 mg新鮮的糞便樣品, 并立即保存在?80 ℃中直至使用。

1.5 肺組織的病理學(xué)觀察

肺部組織進(jìn)行石蠟包埋, 制成切片后分別進(jìn)行HE和masson染色; 使用BX-51M熒光顯微鏡(Olympus, Japan)觀察切片。參照ashcroft評(píng)分來(lái)確定肺泡炎及肺間質(zhì)纖維化的程度[16]。

1.6 腸道微生物的高通量測(cè)序

1.6.1 糞便中DNA的提取和測(cè)序

從小鼠糞便樣本中分離細(xì)菌基因組DNA, 采用TransStart Fastpfu DNA聚合酶反應(yīng)體系在V3-V4可變區(qū)內(nèi)使用特異性引物338F和806R進(jìn)行PCR擴(kuò)增(ABI GeneAmp? 9700型PCR儀)(表1)。通過(guò)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物并進(jìn)行回收(axygen公司)。使用DNA樣品制備試劑盒(illumina公司)構(gòu)建MiSeq文庫(kù), 并根據(jù)測(cè)序流程利用illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)美吉生物云平臺(tái)(https:// cloud.majorbio.com)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列

1.6.2 序列數(shù)據(jù)分析

對(duì)原始序列進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾, 并使用QIIME平臺(tái)的默認(rèn)參數(shù)根據(jù)其條形碼將其分配給樣品, 使用usearch軟件平臺(tái)提取優(yōu)化序列的非重復(fù)序列, 取出不重復(fù)的單個(gè)序列。在97%的相似性下, 對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類(lèi)。

通過(guò)alpha多樣性分析, 反應(yīng)腸道菌群的豐富度和多樣性, 包括以下幾種統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù): sobs、chao、shannon、simpson、coverage。使用R語(yǔ)言PCoA統(tǒng)計(jì)分析和作圖軟件進(jìn)行UniFrac PCoA分析, 基于所選距離矩陣進(jìn)行作圖, 分析不同組之間的差異, 并通過(guò)SPSS分析LPS與腸道菌群的相關(guān)性。

進(jìn)行組件顯著性差異檢驗(yàn), 根據(jù)得到的群落豐度數(shù)據(jù), 對(duì)不同組微生物群落之間的物種進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)。評(píng)估物種豐度差異的顯著性水平, 并獲得各組之間具有顯著性差異的物種。

2 結(jié)果與討論

2.1 一般情況及小鼠體質(zhì)量變化

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 每周對(duì)小鼠稱(chēng)重兩次。如圖1所示, Con組小鼠的平均體重呈上升趨勢(shì), 在第22 d時(shí), 平均體重達(dá)到最大39.44 g, 而后平均體重降低至38.76 g, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中小鼠的平均體重增長(zhǎng)了4.83 g。與Con組比較, R組和RPC組體重明顯下降(*<0.05)。R組小鼠的體重呈緩慢降低再升高的趨勢(shì), 在給藥第15 d時(shí), 平均體重降至最低31.37 g, 這可能是由于多次靜脈注射BLM后對(duì)小鼠的腸、胃等器官造成了影響, 而后平均體重有所上升, 增長(zhǎng)至33 g, 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 體重降低了0.87 g。與R組相比, RPC組平均體重的變化趨勢(shì)與其相似, 但最終結(jié)束時(shí), 小鼠平均體重降低了1.75 g, 略低于R組。

圖1 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后各組小鼠的平均體重變化

2.2 PC干預(yù)可以減輕BLM誘導(dǎo)的PF

為了驗(yàn)證PC的抗纖維化水平, 本課題組采用尾靜脈注射BLM的方法建立PF模型。而后通過(guò)組織學(xué)分析, 包括masson染色和HE染色, 評(píng)估PC的抗纖維化作用。

HE染色和ashcroft評(píng)分[16]用于評(píng)估PF程度。如圖2a所示, PF建模第14 d, R組小鼠的肺組織有明顯的淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(如圖2a橙色箭頭), 肺泡隔和肺泡出現(xiàn)炎性滲出增加, 肺泡隔增寬, 此時(shí)PC給藥組肺泡隔毛細(xì)血管擴(kuò)張且肺泡巨噬細(xì)胞稍微增加。ashcroft評(píng)分顯示, 與Con組相比, R組的肺纖維化評(píng)分顯著升高(<0.05), 纖維化等級(jí)處于1和2之間; 口服PC后, RPC組小鼠肺纖維化程度減輕(<0.05)。在建模第28 d, R組小鼠肺組織的肺泡隔和肺泡中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)有所減少, 但肺泡隔進(jìn)一步增寬, 并出現(xiàn)大量成纖維細(xì)胞增生結(jié)節(jié)(圖2b綠色箭頭), 此時(shí)RPC組小鼠的肺泡隔寬度稍微增加。ashcroft評(píng)分顯示, 與Con組相比, R組小鼠肺纖維化評(píng)分顯著增加(<0.01), 為5±0.5, 小鼠肺部受累面積大于50%, 肺泡系統(tǒng)紊亂, 與R組相比, RPC組的肺纖維化評(píng)分顯著降低(<0.05), 小鼠肺部的受累面積在20%～50%(圖2c)。結(jié)果表明, 小鼠經(jīng)過(guò)尾靜脈注射BLM后, 肺組織受到了嚴(yán)重破壞, 而PC給藥顯著保護(hù)了肺泡組織的結(jié)構(gòu)并改善了炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn), 肺纖維化程度降低。

圖2 PC對(duì)尾靜脈注射BLM誘導(dǎo)的肺組織損傷和纖維化的影響

注: Con: 對(duì)照組; R: 多次靜脈注射BLM組; RPC: 多次靜脈注射BLM加PC干預(yù)組。比例尺長(zhǎng)度為100 μm。=5, *<0.05, **<0.01

Masson三色染色顯示, BLM靜脈注射第14 d, R組小鼠有少量膠原纖維沉積, 肺泡隔成纖維細(xì)胞局限性增生且結(jié)節(jié)增多, 同時(shí)結(jié)節(jié)內(nèi)有少量膠原纖維沉積(圖2b黑色箭頭), PC給藥組的肺組織結(jié)節(jié)增多但無(wú)明顯膠原纖維沉積(圖2b)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第28 d, R組小鼠在肺血管外膜的外部區(qū)域觀察到藍(lán)色染色逐漸增加, 肺泡隔和結(jié)節(jié)內(nèi)有大量膠原纖維沉積, 表明膠原蛋白在肺組織和周?chē)姆置诤统练e逐漸增加, 此時(shí)PC給藥組明顯減少了膠原纖維的沉積(圖2b)。結(jié)果表明BLM誘導(dǎo)導(dǎo)致大量膠原蛋白沉積在肺組織, 通過(guò)PC給藥可以抑制膠原沉積, 進(jìn)而減輕BLM引起的PF。

2.3 PC對(duì)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)

2.3.1 多樣性分析

對(duì)15只小鼠的糞便樣品(每組5個(gè))進(jìn)行16S rRNA測(cè)序, 總共得到359 970個(gè)序列。其中包括345個(gè)操作生物分類(lèi)單位(OTU), 共分為9個(gè)門(mén)和85個(gè)屬。隨著樣本數(shù)量的增加, Pan(圖3a)/Core(圖3b)曲線(xiàn)趨于平緩, 說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)量足夠反映出小鼠腸道微生物組成的真實(shí)情況。

圖3 OTU水平的Pan(a)和Core(b)曲線(xiàn)圖

注: Con: 對(duì)照組; R: 多次靜脈注射BLM組; RPC: 多次靜脈注射BLM加PC干預(yù)組

2.3.1.1 alpha多樣性

通過(guò)alpha多樣性分析反映小鼠腸道微生物群的豐富度和多樣性。sobs指數(shù)顯示了菌群豐富度的實(shí)際觀測(cè)值。與Con組相比, BLM誘導(dǎo)顯著降低了菌群豐富度的實(shí)際觀測(cè)值?？诜C后, RPC組菌群豐富度的實(shí)際觀測(cè)值增加(圖4a)。chao和ace指數(shù)被用于反應(yīng)群落豐富度。如圖4b和c所示, 與Con組相比, BLM誘導(dǎo)顯著降低了chao和ace指數(shù), 而口服PC改善了這些指標(biāo), chao和ace指數(shù)相對(duì)于Con組和R組均顯著升高(<0.05), 進(jìn)一步印證BLM靜脈注射后降低了小鼠糞便群落的豐富度, 而服用PC使糞便中的菌群豐富度增加。在群落多樣性分析中, Shannon和Simpson指數(shù)被用作反映群落的多樣性, 它們的變化趨勢(shì)成反比。相較于R組, RPC組的Shannon指數(shù)顯著增加, Simpson指數(shù)顯著降低(圖4d和e), 這表明口服PC對(duì)腸道菌群多樣性產(chǎn)生正面影響, 相比于其他兩組均能增加小鼠糞便中的群落多樣性(<0.05)。腸絨毛是位于腸上皮上的手指狀突起, 腸絨毛長(zhǎng)度增加有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。因此推測(cè)口服PC后, RPC組的腸絨毛的長(zhǎng)度增加, 保護(hù)了腸黏膜, 從而促進(jìn)食物的吸收和利用, 同時(shí)增加了到達(dá)下消化道的可微生物利用的物質(zhì)的數(shù)量, 從而增加了小鼠腸道菌群的豐富度和多樣性[14]。

2.3.1.2 beta多樣性

beta多樣性分析用于比較各組樣品之間的物種多樣性差異[17]。為了評(píng)估各組小鼠細(xì)菌的差異, 本課題組進(jìn)行了beta多樣性中的主坐標(biāo)分析(weighted_ unifrac_full_free距離算法的PCoA分析)[18]。結(jié)果顯示Con、R和RPC組沿著主縱坐標(biāo)軸形成明顯的微生物種類(lèi)群集, R組小鼠糞便中的菌群類(lèi)型主要聚集在對(duì)照組的右側(cè), 而PC給藥后, 差異向Con組的左側(cè)方向發(fā)展, 口服PC后RPC組的腸道菌群向Con組左側(cè)偏移(圖4f)。由此本課題組推測(cè), 口服PC后, PF小鼠的腸道菌群中的物種分布趨于正常, PC對(duì)PF的干預(yù)是起積極作用的。

圖4 各組小鼠腸道菌群的alpha和beta多樣性指數(shù)

注: Con: 對(duì)照組; R: 多次靜脈注射BLM組; RPC: 多次靜脈注射BLM加PC干預(yù)組。*<0.05

2.3.2 PC對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)venn圖統(tǒng)計(jì)Con、R和RPC三組樣品中共有和獨(dú)有的物種數(shù)目, 選用相似水平為97%的OTU作為樣本表進(jìn)行分類(lèi), 如圖5所示, Con組、R組和RPC組共有的OTU數(shù)為379個(gè), 其中, Con組獨(dú)有的OTU數(shù)為35個(gè), R組獨(dú)有的OTU數(shù)為9個(gè), RPC組獨(dú)有的OTU數(shù)為68個(gè)。結(jié)果表明, BLM誘導(dǎo)后, 會(huì)降低小鼠腸道菌群的物種數(shù), 而口服PC后小鼠腸道菌群中物種數(shù)目增加。

為了進(jìn)一步研究PC對(duì)于PF小鼠的作用, 本課題組在門(mén)和屬水平上對(duì)Con、R和RPC三個(gè)組腸道菌群的組成情況進(jìn)行了比較。

在門(mén)水平上, 小鼠糞便中的主要菌群組成如圖6a所示。Con、R、RPC三組小鼠的優(yōu)勢(shì)菌依次是厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidota)、彎曲桿菌門(mén)(Campylobacterota), 但各菌群的相對(duì)豐度存在差異。其中Firmicutes和Bacteroidota是小鼠腸道菌群中含量最多的菌門(mén), 占細(xì)菌總數(shù)的80%以上[19]。兩者比例的變化與宿主健康息息相關(guān), 與正常組相比, 經(jīng)BLM誘導(dǎo)后, Firmicutes的占比降低, Bacteroidota的占比增加; 而口服PC后, Firmicutes的占比增加, Bacteroidota的占比降低(表2)。研究認(rèn)為, Bacteroi-dota門(mén)的細(xì)胞表面含有豐富的脂蛋白BtuG2, 其可以與維生素B12結(jié)合, 通過(guò)關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-內(nèi)在因子來(lái)吸收維生素B12, 因此Bacteroidota門(mén)的菌群爭(zhēng)奪腸道中的關(guān)鍵維生素[20]。

圖5 小鼠糞便腸道菌群的venn圖

注: Con: 對(duì)照組; R: 多次靜脈注射BLM組; RPC: 多次靜脈注射BLM加PC干預(yù)組

表2 三組小鼠的主要腸道菌群在門(mén)水平的相對(duì)豐度

注: Con: 正常對(duì)照組; R: 多次靜脈注射組; RPC: 多次靜脈注射+口服PC組

在屬水平, 根據(jù)豐度排名前十的細(xì)菌如表3所示, 占總菌群的70%左右。PC干預(yù)后顯著調(diào)節(jié)了幾種細(xì)菌的豐度, 如圖6b所示, 3組按照Con、R、RPC的順序, 菌群的平均占比較大的有明確命名的菌屬依次為、、、等。與對(duì)照組相比, BLM誘導(dǎo)組中的等細(xì)菌的豐度降低, 而口服PC后增加了這些細(xì)菌群落的豐富度。與此同時(shí), 相比于對(duì)照組, BLM組中、等菌群的豐富度增加, 口服PC后抑制了它的上升趨勢(shì)。

為了進(jìn)一步評(píng)估PC干預(yù)后優(yōu)勢(shì)菌群的變化, 對(duì)從門(mén)到屬水平的物種進(jìn)行LEfSe多級(jí)物種差異判別分析。如圖6c所示, 線(xiàn)性判別分析得分(LDA>4)的結(jié)構(gòu)總共發(fā)現(xiàn)了15個(gè)具有統(tǒng)計(jì)意義的分類(lèi)單元,其中R組中差異豐富的分類(lèi)單元的數(shù)量是Con組的4倍, 其顯著增加了Bacilli、Lactobacillaceae等有害菌群。而口服PC后, 增加了包括Oscillospiraceae、Lachnospiraceae等有益菌的含量, 該結(jié)論與上述門(mén)和屬水平上的小鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)。

圖6 不同組小鼠腸道菌群的比較

注: Con: 對(duì)照組; R: 多次靜脈注射BLM組; RPC: 多次靜脈注射BLM加PC干預(yù)組。通過(guò)LEfSe分析生成的線(xiàn)性判別分析, LSA閾值>4

表3 三組小鼠的主要腸道菌群在屬水平的相對(duì)豐度

注: Con: 正常對(duì)照組; R: 多次靜脈注射組; RPC: 多次靜脈注射+口服PC組

PC可以通過(guò)增加有益細(xì)菌并減少有害細(xì)菌的含量來(lái)改善由于尾靜脈注射BLM造成的小鼠腸道菌群失衡。主要的有害細(xì)菌包括, 其含量增加通常發(fā)生在腸炎類(lèi)疾病的發(fā)展過(guò)程中, 這表明BLM靜脈注射過(guò)程中不僅對(duì)肺部造成了損傷, 還可能影響腸組織的功能, 而口服PC可以減輕BLM引起的腸損傷[21]。同時(shí)研究表明, 有益菌可以通過(guò)殺死病原細(xì)菌, 定植和拮抗有害細(xì)菌, 與有害細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)氧氣和營(yíng)養(yǎng), 為腸道提供微生物屏障以及維持或恢復(fù)宿主與腸道微生物之間的平衡[18]。是一類(lèi)有益細(xì)菌, 它可以通過(guò)賴(lài)氨酸發(fā)酵產(chǎn)生丁酸, 在鼠模型和人類(lèi)中已分別顯示出與結(jié)腸炎和肝病密切相關(guān)[22]。它是具有與雙歧桿菌相似功能的益生菌, 可以調(diào)節(jié)小鼠的能量代謝并幫助其適應(yīng)周?chē)h(huán)境[23]。和均屬于Lach-nospiraceae科, 研究認(rèn)為L(zhǎng)achnospiraceae科細(xì)菌在腸道中用于丁酸鹽的生產(chǎn), 其中丁酸酯可以與其他短鏈脂肪酸(SCFA)通過(guò)不同的機(jī)制抑制腸道炎癥, 維持腸道屏障并調(diào)節(jié)腸蠕動(dòng)[24-25]。

PC對(duì)肺纖維化小鼠的腸道菌群起到恢復(fù)作用, 本課題組猜測(cè)可能是由于PC經(jīng)過(guò)消化道被胃、腸內(nèi)的消化酶降解, 進(jìn)而產(chǎn)生了氨基酸、小肽、藻膽素等小分子, 這些小分子參與調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu), 增加了有益細(xì)菌的數(shù)量, 并起到增強(qiáng)SCFA合成提高機(jī)體免疫力的作用[26]。同時(shí)這些益生細(xì)菌可能通過(guò)抑制病原微生物對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附和侵襲并在腸道定植后與病原微生物競(jìng)爭(zhēng)而有效地抑制病原微生物的生長(zhǎng)。

2.4 LPS與優(yōu)勢(shì)菌群之間的相關(guān)性

通過(guò)相關(guān)性熱圖分析LPS含量與RPC組糞便中優(yōu)勢(shì)菌群的相關(guān)性, 在屬水平上評(píng)估分類(lèi)水平在總豐度前20的物種, 以找到在PF疾病發(fā)生過(guò)程中起作用的關(guān)鍵性微生物群。如圖7所示這些菌屬與至少一項(xiàng)LPS的指標(biāo)呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。

大量研究表明, 腸道菌群中的許多細(xì)菌與炎癥相關(guān)。例如, Muribaculaceae代表的擬桿菌門(mén)中的菌群, 一般情況下它的含量與LPS含量成正比, 它可以參與自然殺傷細(xì)胞和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo), 同時(shí)其可以通過(guò)IgA與先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)相互作用[27]。、、等有益菌與小鼠肺組織、腸組織以及血清中的LPS含量成反比?？梢栽鰪?qiáng)腸壁屏障, 其通過(guò)在腸壁屏障中攝取黏蛋白并將其轉(zhuǎn)變?yōu)镾CFA, 包括乙酸鹽[28]。因此猜測(cè)PC口服后經(jīng)過(guò)胃、腸內(nèi)的消化酶降解, 產(chǎn)生了氨基酸、小肽、藻膽素等小分子, 這些小分子促進(jìn)了有益菌生長(zhǎng)并進(jìn)一步生成丁酸、丙酸鹽等SCFA的生物合成。本課題組推測(cè)口服PC后可能通過(guò)抑制LPS的含量來(lái)抑制TLR4途徑的活化, 同時(shí)增加腸道菌群中有益細(xì)菌的含量, 降低有害細(xì)菌的含量。與此同時(shí), 本課題組的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)小鼠口服PC后觀察到的LPS的降低可能與毛螺菌科細(xì)菌的水平有關(guān), 這與2.3.2節(jié)的結(jié)論相符。因此猜測(cè)腸道菌群可能與小鼠的炎癥有關(guān), 而PC的抗炎作用在一定程度上與特定的腸道菌群有關(guān)。PC可以促進(jìn)腸道細(xì)菌的生長(zhǎng), 相反, 腸道細(xì)菌也可以利用未消化的蛋白質(zhì), 然后通過(guò)發(fā)酵這些飲食營(yíng)養(yǎng)以產(chǎn)生代謝產(chǎn)物, 例如SCFA, 它們可以用作結(jié)腸上皮細(xì)胞的養(yǎng)料并誘導(dǎo)腸道細(xì)胞增殖。因此, PC有益于人體健康。

3 結(jié)論

本研究采用多次靜脈注射BLM的方式誘導(dǎo)ICR小鼠肺纖維化, 證實(shí)了口服PC可以減輕小鼠肺纖維化程度。PF小鼠口服PC后, 增加了腸道菌群的豐富度和多樣性, 這可能是由于PC能夠促進(jìn)腸道絨毛的生長(zhǎng), 這對(duì)腸黏膜起到了保護(hù)作用, 進(jìn)而增強(qiáng)了小鼠本身對(duì)食物的消化吸收能力, 從而增加了腸道菌群可利用的營(yíng)養(yǎng)。同時(shí)BLM誘導(dǎo)后, 小鼠腸道菌群中的有益菌群減少, 有害菌群增加, PC處理可以通過(guò)增加腸道菌群中,等有益細(xì)菌的數(shù)量并減少有害細(xì)菌的數(shù)量來(lái)調(diào)節(jié)腸道菌群, 這為研究疾病和微生態(tài)學(xué)提供了一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。為PC減輕小鼠PF的潛在功能和機(jī)制提供了新的線(xiàn)索(圖8)。隨后的研究需要進(jìn)一步闡明PC的活性是由蛋白質(zhì)本身還是由其代謝產(chǎn)物決定的, 以及蛋白質(zhì)的代謝產(chǎn)物如何在體內(nèi)不同的菌群中發(fā)揮不同的作用。

圖7 口服PC后腸道菌群在屬水平的豐度與小鼠肺組織、腸組織和血清中LPS含量的相關(guān)性分析

注: 紅色表示正相關(guān), 藍(lán)色表示負(fù)相關(guān), 屬豐度與環(huán)境因子之間的相關(guān)程度由顏色的強(qiáng)度表示。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD(=5); *<0.05, **<0.01, ***<0.001

圖8 藻藍(lán)蛋白對(duì)BLM誘導(dǎo)的肺纖維化的潛在機(jī)制

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Effect of phycocyanin on the intestinal flora of mice with bleomycin-induced pulmonary fibrosis

ZANG Fan1, 2, LI Wen-jun2, 3, QIN Song2, 3, LIN Jian1

(1. College of Life Sciences, Yantai University, Yantai 264005, China; 2. Yantai Institute of Coastal Zone Research, Chinese Academy of Sciences, Yantai 264003, China; 3. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Bleomycin (BLM) is currently used to treat various cancers, but it induces several side effects, such as pulmonary fibrosis (PF). Thus, the quality of life of patients is considerably reduced. Phycocyanin (PC), a pigment-protein complex, has been proven to be effective for many diseases, including PF. Studies have found that chronic intestinal diseases are usually accompanied by lung diseases, and the intestinal flora of patients is disordered. Based on the above findings, this article studied the effect of PC on intestinal flora in mice with BLM-induced PF. BLM was injected into mice through the tail vein to construct a model of PF. Combined with 16S rRNA high-throughput gene sequencing technology, the influence of PC on the intestinal flora of mice with BLM-induced PF was analyzed. Results showed that PC reduced the degree of PF induced by BLM and regulated the intestinal flora of mice. After mice were injected with BLM through the tail vein, lung injury was observed, and the intestinal flora was disturbed. Following oral PC intervention, lung tissue sections from mice showed the amelioration of PF, decreased collagen deposition, and reduced alveolar septum and inflammatory cell infiltration. At this time, the abundance of beneficial bacteria, such asand, was increased in the feces of mice, the abundance of harmful bacteria, such as, decreased, and the intestinal flora tended to be normal. We speculate that PC can resolve the intestinal flora disorder caused by intravenous BLM injection by increasing the abundance of beneficial bacteria and reducing the abundance of harmful bacteria in the intestines, thereby reducing the degree of PF in mice.

phycocyanin; bleomycin; pulmonary fibrosis mice; intestinal flora

Feb. 6, 2021

Q93

A

1000-3096(2023)6-0042-10

10.11759/hykx20210206001

2021-02-06;

2021-02-27

煙臺(tái)市重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目(2019XDHZ101, 2020MSGY084); 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)專(zhuān)項(xiàng)(2018YFD0901102)

[Yantai Key R&D Project, Nos. 2019XDHZ101, 2020MSGY08; National Key Research and Development Project of China, No. 2018YFD0901102]

臧帆(1995—), 女, 漢族, 山東煙臺(tái)人, 碩士研究生, 研究方向?yàn)楹Ｑ笤孱?lèi)學(xué), E-mail: zf1458355@163.com; 秦松(1968—),通信作者, 男, 漢族, 山東煙臺(tái)人, 研究員, 博士生導(dǎo)師, 研究方向?yàn)楹Ｑ笤孱?lèi)學(xué)、海岸帶生物工程, E-mail: sqin@yic.ac.cn; 林劍(1963—), 通信作者, 男, 漢族, 山東煙臺(tái)人, 教授, 碩士導(dǎo)師, 研究方向?yàn)樯锕こ獭⑽⑸锇l(fā)酵, E-mail: linjian3384@163.com

(本文編輯: 楊 悅)