養(yǎng)殖遷移對(duì)菲律賓蛤仔揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)組成變化的影響

楊 玲, 郭 賀, 許智慧, 邵倩文, 冉照收, 周成旭

養(yǎng)殖遷移對(duì)菲律賓蛤仔揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)組成變化的影響

楊 玲1, 郭 賀2, 許智慧2, 邵倩文3, 冉照收2, 周成旭1

(1. 寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院, 浙江 寧波 315211; 2. 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院, 浙江 寧波 315211; 3. 寧波海洋研究院 浙江 寧波 315832)

環(huán)境條件變化是造成貝類揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)(VOCs)組成變化的主要原因。菲律賓蛤仔養(yǎng)殖生產(chǎn)中, 常進(jìn)行從開(kāi)放式自然灘涂遷移至人工圍塘養(yǎng)殖的活動(dòng)。本文研究了這一過(guò)程前后菲律賓蛤仔()肌肉組織的VOCs組成特征、變化及其與環(huán)境因子相關(guān)性。結(jié)果顯示: 基于固相微萃取和氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù), 共鑒定出52種VOCs, 分別屬于醛、醇、酯、烴、呋喃、烷烴、烯、芳香烴、含硫和含氮化合物等。遷移前樣本中, 檢出41種化合物, 遷移至人工圍塘養(yǎng)殖20 d后, 檢出32種。遷移造成了化合物種類數(shù)量降低、種類發(fā)生變化。醛、醇類的相對(duì)含量最高、遷移前后的變化尤為顯著, 呈現(xiàn)由醛高醇低的組成逆轉(zhuǎn)為醇高醛低的特點(diǎn)。溶氧是影響VOCs組成變化及其醇、醛類差別的重要因子。餌料生物量、相對(duì)豐度和多樣性與VOCs的組成具有顯著相關(guān)性: 自然灘涂微型真核生物多樣性高但生物量和豐度相對(duì)低, 人工圍塘多樣性低但生物量和豐度高, 是VOCs組成差異的關(guān)鍵影響因子。本研究建立了貝類VOCs與關(guān)鍵環(huán)境因子的直接聯(lián)系, 為進(jìn)一步解析貝類品質(zhì)的環(huán)境關(guān)系、優(yōu)化和調(diào)控養(yǎng)殖環(huán)境等研究提供了參考。

菲律賓蛤仔; 揮發(fā)性有機(jī)物; 環(huán)境因子; 微型浮游生物; 養(yǎng)殖遷移

我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó), 南北海域都有不同適養(yǎng)水產(chǎn)品種及其適養(yǎng)水域。菲律賓蛤仔()是典型的灘涂貝類, 環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng), 在我國(guó)從南到北沿海灘涂中, 均有廣泛的分布[1]。在突破了菲律賓蛤仔人工育苗技術(shù)以后, 其人工養(yǎng)殖更是蓬勃發(fā)展, 成為灘涂養(yǎng)殖貝類產(chǎn)量最高和養(yǎng)殖規(guī)模最大的品種[2], 是人們喜聞樂(lè)見(jiàn)的以鮮美風(fēng)味著稱的大宗海鮮品[3]。隨著海水養(yǎng)殖科學(xué)和產(chǎn)業(yè)技術(shù)發(fā)展, 菲律賓蛤仔的養(yǎng)殖方式也實(shí)現(xiàn)了從傳統(tǒng)的區(qū)域化養(yǎng)殖, 轉(zhuǎn)向育苗、養(yǎng)成、育肥等區(qū)塊化特征, 并進(jìn)一步在我國(guó)形成了南北方不同水域聯(lián)動(dòng)的產(chǎn)業(yè)特征。并且, 除了在自然灘涂水域進(jìn)行養(yǎng)殖以外, 菲律賓蛤仔還在人工圍塘中作為適養(yǎng)貝類進(jìn)行增養(yǎng)殖或育肥。

生物和非生物環(huán)境與貝類的生化物質(zhì)組成和代謝密切相關(guān), 如其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味物質(zhì)特征等, 都因生長(zhǎng)和所處環(huán)境而不同[4]。揮發(fā)性有機(jī)物是貝類風(fēng)味品質(zhì)構(gòu)建的重要組成部分。研究表明, 不同微藻對(duì)雙殼貝類肉質(zhì)揮發(fā)性成分會(huì)產(chǎn)生影響[5-6]。不同微藻的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)存在差異, 因此貝類攝入不同種類的微藻后, 會(huì)對(duì)貝類本身的代謝產(chǎn)生影響, 從而在揮發(fā)性成分上也造成影響[7]。揮發(fā)性成分的產(chǎn)生與貝本身的代謝過(guò)程息息相關(guān), 很多醇類、含羰基的化合物由不飽和脂肪酸經(jīng)某些脂氧化酶作用衍生而來(lái)[8], 而酮類化合物是由氨基酸的降解和不飽和脂肪酸的自動(dòng)氧化所產(chǎn)生[9]。此外, 貝類的生長(zhǎng)環(huán)境也與貝類的代謝息息相關(guān), 例如, 劉朋超等[10]研究發(fā)現(xiàn), 溫度、鹽度、溶解氧等是影響生物群落的主要因素, 在分析了兩個(gè)不同海域的牡蠣后發(fā)現(xiàn), 其脂肪酸、糖原、揮發(fā)性成分均具有顯著差異, 并且大部分氨基酸成分與硅藻、甲藻呈正相關(guān), 與微球藻屬、微胞藻屬、鞭毛藻類、共甲藻目等呈負(fù)相關(guān)。菲律賓蛤仔是典型的濾食性貝類, 通過(guò)濾食水體中的微型藻類、有機(jī)碎屑、細(xì)菌、原生生物等顆粒有機(jī)物為生。在貝類的人工圍塘養(yǎng)殖中, 也通過(guò)調(diào)節(jié)水質(zhì)、藻相, 不僅提高貝類食物來(lái)源、促進(jìn)生長(zhǎng)或育肥, 其不同的藻相, 也構(gòu)造了養(yǎng)殖水產(chǎn)品不同的代謝過(guò)程, 在風(fēng)味特征上可能造成差異。

“風(fēng)味物質(zhì)”是指一類能為人體感覺(jué)器官所感知的水溶性或揮發(fā)性的低分子量化合物。前者一般稱為呈味物質(zhì), 如氨基酸、核苷酸、肽, 種類相對(duì)固定, 可刺激人味蕾細(xì)胞產(chǎn)生酸、甜、苦、咸、鮮等感覺(jué), 目前對(duì)其研究較為透徹; 而后者又可稱為香氣物質(zhì), 通常屬于揮發(fā)性有機(jī)物質(zhì)(VOCs), 需在一定條件下, 如加熱、酶催化等, 由風(fēng)味前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來(lái), 例如萜烯化合物、脂肪族化合物、芳香族化合物[11]。對(duì)于貝類風(fēng)味物質(zhì)的研究較多地集中于不同區(qū)域之間的對(duì)比或不同儲(chǔ)藏保鮮方式, 而對(duì)于養(yǎng)殖遷移形成的生物和非生物環(huán)境綜合影響下, 養(yǎng)殖貝類的風(fēng)味構(gòu)建特征及相關(guān)機(jī)制的研究尚缺乏。

本研究以解析貝類風(fēng)味物質(zhì)組成和特征構(gòu)成與養(yǎng)殖區(qū)域變化的生物和非生物環(huán)境因子的綜合關(guān)聯(lián)性為目標(biāo), 利用典型的養(yǎng)殖活動(dòng), 即菲律賓蛤仔增養(yǎng)殖過(guò)程中的不同水域遷移, 聚焦貝類揮發(fā)性物質(zhì)的組成變化, 研究其構(gòu)建風(fēng)味物質(zhì)的組成及其與環(huán)境中微型浮游生物因子(餌料)和非生物環(huán)境因子之間的相關(guān)性, 一方面深化養(yǎng)殖生物的生理生態(tài)研究, 另一方面, 也為典型養(yǎng)殖方式影響下貝類海鮮品質(zhì)優(yōu)化以及養(yǎng)殖環(huán)境的人工調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 野外采樣、養(yǎng)殖遷移及養(yǎng)殖環(huán)境因子調(diào)查

養(yǎng)殖遷移前菲律賓蛤仔(LA組): 采自福建省連江縣定海灣開(kāi)放式自然灘涂養(yǎng)殖區(qū), 采樣點(diǎn)經(jīng)緯度E119°67′30.09″, N26°23′57.04″。鮮重為20.6 ± 1.7 g, 平均體長(zhǎng)26.2 ± 4.4 mm。取現(xiàn)場(chǎng)采樣的部分樣品于–20 ℃冷藏待測(cè)(LA組)?；钬惖蜏乩滏溵D(zhuǎn)移自浙江寧波橫碼海水養(yǎng)殖圍塘(E 121°46′28.53″, N 29°39′02.45″), 于圍塘水質(zhì)環(huán)境中養(yǎng)殖20 d后, 第二次取菲律賓蛤仔樣品(HM組), 于–20 ℃冷藏待測(cè)備用。

遷移養(yǎng)殖前后非生物環(huán)境因子檢測(cè): 兩處采樣點(diǎn)水質(zhì)參數(shù)以多參數(shù)水質(zhì)儀(EXO2, YSI, 美國(guó))測(cè)量, 檢測(cè)的環(huán)境參數(shù)包括水溫、鹽度、pH、溶解氧、總?cè)芙夤腆w、電導(dǎo)率和濁度。同時(shí), 以BBE熒光探測(cè)器(Moldaenke GmbH, 德國(guó))檢測(cè)水體中葉綠素(Chl)和藍(lán)綠藻(BGA)的總體水平。

采樣地微型真核浮游生物群落調(diào)查: 利用18s高通量測(cè)序分析研究手段, 對(duì)兩處水體中微型真核浮游生物群落和差異特征進(jìn)行了樣品采集和分析。在兩處采樣水域, 使用1 L采水器于水層中下部采集水樣?，F(xiàn)場(chǎng)用200 μm篩絹對(duì)水樣進(jìn)行過(guò)濾, 以去除大型浮游動(dòng)物等生物以后, 以0.45 μm濾膜過(guò)濾1 L水樣, 濾膜存儲(chǔ)于–80 ℃冰箱備用。采樣各3次重復(fù)。開(kāi)放式自然灘涂水樣(LA)為貝類采樣點(diǎn)被潮水淹沒(méi)后在同一經(jīng)緯度處的水樣; 圍塘水樣為同一圍塘采水水樣(HM)。

利用核酸序列(18S)高通量測(cè)序和分析方法, 對(duì)濾膜上微型真核浮游生物的組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。使用Power Soil? DNA試劑盒(MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA)提取DNA。使用連接有barcode的特殊引物擴(kuò)增18S V4高變區(qū), 引物序列為: 528F(5′-GCGGTAATTCCAGCTCCAA-3′)和706R(5′- AATCCRAGAATTTCACCTCT-3′)。PCR反應(yīng)體系: 15 μL Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs, 3 μL引物, 10 μL模板DNA, 2 μL無(wú)菌水。反應(yīng)條件: 98 ℃預(yù)變性1 min, 30個(gè)循環(huán)內(nèi)98 ℃變性10 s, 50 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 最終72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物檢測(cè)合格及回收純化后, 使用NEB Next?Ultra? DNA Library Prep 試劑盒(New England Biolabs)構(gòu)建文庫(kù), 在Qubit@ 2.0 Fluorometer (Thermo Scientific)上檢測(cè)文庫(kù), 合格后通過(guò)Ion S5TM XL平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序(北京諾禾致源科技股份有限公司)。

使用Cutadapt 對(duì)原始reads進(jìn)行過(guò)濾, 去除嵌合體序列后獲得有效reads。基于有效reads進(jìn)行OTU(操作分類單元)聚類和物種注釋分析, 使用Uparse軟件對(duì)序列進(jìn)行分析, 相似性>97%的序列作為同一個(gè)OTU?；赗DP Classifier分類算法, 與Silva 128數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)并結(jié)合NCBI更新序列進(jìn)行物種注釋, 去除結(jié)果為Unclassified和Metazoa的序列, 使用最少序列樣本的序列數(shù)作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣本進(jìn)行抽平處理, 最終得到均一化數(shù)據(jù), 形成分析使用的OTU表。

1.2 菲律賓蛤仔揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

1.2.1 樣品前處理

將冷凍菲律賓蛤仔樣品置于冰面上維持低溫, 稍解凍以后, 取肌肉樣品置于50 mL離心管內(nèi), 各樣品濕重為17～18 g。配置飽和食鹽水, 按照貝肉與食鹽水1∶1的比例, 將食鹽水倒入離心管中, 增加揮發(fā)性成分的鹽析效應(yīng)以提高揮發(fā)性成分的提取效果[12]。使用T25高速分散機(jī)(德國(guó)IKA公司)進(jìn)行勻漿處理后, 取5 mL勻漿, 倒入15 mL頂空進(jìn)樣瓶中, 進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)采樣。兩處采樣點(diǎn)的樣品各5個(gè)平行處理。

1.2.2 頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜條件

頂空固相微萃取條件: 利用全自動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣系統(tǒng)(德國(guó)Gerstel公司)。樣品首先在60 ℃下振蕩平衡15 min, 再將預(yù)先老化30 min的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭(美國(guó)Supelco公司)深入到樣品頂空處吸附20 min。此過(guò)程中, 溫度仍為60 ℃并持續(xù)振蕩。吸附完成后, 將萃取頭插入到GC進(jìn)樣口, 在210 ℃溫度下解吸7 min。

色譜條件: 利用7890B-7000C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司), 使用VOCOL 毛細(xì)管柱(60 m×0.32 mm×1.8 mm, 德國(guó)CNW公司)進(jìn)行分析。進(jìn)樣采用不分流模式, 柱溫箱起始溫度35 ℃, 保持2 min, 以15 ℃/min, 升溫至125 ℃, 保持1 min, 再以2 ℃/min升溫至200 ℃, 保持12 min。載氣為高純氦氣, 流速為1.6 mL/min; 進(jìn)樣口溫度210 ℃。

質(zhì)譜條件: EI離子源; 電子能量70 eV; 燈絲發(fā)射電流為200 μA, 離子源溫度為230 ℃; 掃描質(zhì)量范圍, 50～500 m/z。

將測(cè)得的各化合物譜圖與計(jì)算機(jī)譜庫(kù)(NIST/ Wiley)中的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)比, 輔以人工圖譜解析, 并結(jié)合正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間進(jìn)行定性分析。按面積歸一化法進(jìn)行定性定量分析, 求得各化合物的相對(duì)百分含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Simca軟件對(duì)各組揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(PCA); 用Excel繪制百分比堆積圖分析揮發(fā)性物質(zhì)含量變化; 微型真核浮游生物群落的Alpha多樣性分析使用QIIME進(jìn)行, Beta多樣性分析、組間差異、物種與環(huán)境因子的相關(guān)性均使用R軟件(vegan package)進(jìn)行分析和可視化。

2 結(jié)果

2.1 不同養(yǎng)殖區(qū)的水質(zhì)、葉綠素a及藍(lán)綠藻生物量

利用多參水質(zhì)儀以及BBE熒光探測(cè)器, 對(duì)兩個(gè)養(yǎng)殖水域的水質(zhì)及葉綠素和藍(lán)綠藻生物量進(jìn)行了測(cè)定, 結(jié)果如表1所示。

表1 開(kāi)放式灘涂區(qū)(LA)和圍塘區(qū)(HM)水質(zhì)及葉綠素a和藍(lán)綠藻生物量

從調(diào)查的結(jié)果可以看出, 非生物環(huán)境因子方面, 開(kāi)放式灘涂區(qū)水溫和鹽度均較圍塘區(qū)高, pH水平相近, 溶氧水平在開(kāi)放式灘涂區(qū)較圍塘區(qū)較低?？?cè)芙夤腆w在開(kāi)放式灘涂區(qū)顯著高于圍塘區(qū), 說(shuō)明其水質(zhì)的礦化程度高于圍塘區(qū)。微藻生物因子方面可以看出, 圍塘區(qū)水中的藻類總體水平遠(yuǎn)大于開(kāi)放式灘涂區(qū), 其中藻類生物量(Chl含量)是開(kāi)放式灘涂區(qū)的20倍, 藍(lán)綠藻水平是開(kāi)放式灘涂區(qū)的16倍。因此, 圍塘區(qū)的養(yǎng)殖貝類處于食物生物量相對(duì)豐富的水域中。

2.2 不同養(yǎng)殖區(qū)的微型真核浮游生物組成結(jié)構(gòu)特征

本研究利用18S高通量測(cè)序和分析技術(shù), 重點(diǎn)比較了兩個(gè)養(yǎng)殖區(qū)真核微型浮游生物的群落組成和結(jié)構(gòu)特征及其差異性。開(kāi)放式灘涂區(qū), 基于連江的三個(gè)樣本LA1、LA2、LA3的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 18S文庫(kù)經(jīng)聚類得到1 474個(gè)OTU, 分別隸屬于32個(gè)門, 295個(gè)屬, 豐度最高的前十個(gè)門分別是Diatomea、Ciliophora、Dinoflagellata、Protalveolata、Cryptophyta、Cercozoa、Chlorophyta、Ochrophyta、unidentified_Eukaryota、Chytridiomycota。豐度最高的前十個(gè)屬分別是(Diatomea)、(Diatomea)、(Ciliophora)、(Dinoflagellata)、(Diatomea)、(Protalveolata)、(Dinoflagellata)、(Protalveolata)、(Diatomea)、(Ciliophora)。

圍塘養(yǎng)殖區(qū), 基于橫碼的HM1、HM2、HM3的有效數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 18S文庫(kù)經(jīng)聚類得到138個(gè)OTU, 分別隸屬于24個(gè)門, 79個(gè)屬, 豐度最高的前6個(gè)門分別是Ciliophora、Cercozoa、unclassified Eukaryota、Dinoflagellata、Ochrophyta、Stramenopiles。豐度最高的前6個(gè)屬分別是(Ciliophora)、(Ciliophora)、、unclassified Eukaryota、(Dinoflagellata)、(Ochrophyta)?？梢?jiàn), 圍塘水域的微型真核浮游生物物種類數(shù)顯著低于開(kāi)放式灘涂水域。

圖1為兩組樣本分別在門和屬水平上的相對(duì)豐度圖。從圖中可以看出, 開(kāi)放式灘涂養(yǎng)殖區(qū)中, 硅藻門(Diatomea)相對(duì)豐度最高, 約占47%, 其次為甲藻門(Dinoflagellata)和纖毛蟲(chóng)門(Ciliophora), 兩者占比都近16%。而圍塘養(yǎng)殖區(qū), 纖毛蟲(chóng)門(Ciliophora)占有相對(duì)最高豐度(約67%), 其次為絲足蟲(chóng)類(Cercozoa), 占14%, 圍塘中, 甲藻和雜色藻(Ochrophyta)占比分別為6%和3%。

圖1 基于18S核酸序列檢測(cè)的微型真核浮游生物物種相對(duì)豐度(A為門水平, B為屬水平)

對(duì)兩個(gè)水域微型真核浮游生物群落結(jié)構(gòu)的alpha多樣性分析結(jié)果顯示(表2), 圍塘區(qū)(HM)樣本的Goods coverage 指數(shù)略高于開(kāi)放式灘涂區(qū)(LA), 說(shuō)明其測(cè)序深度相對(duì)高。從分析群落多樣性均勻度和穩(wěn)定性等相關(guān)的幾種指數(shù)來(lái)看, Shannon、Simpson、Chao1、ACE、PD等各指數(shù)的值, 在開(kāi)放式灘涂區(qū)均大于圍塘區(qū)。因此, 結(jié)果顯示了開(kāi)放式灘涂區(qū)較圍塘水域具有更高的群落多樣性, 物種分布更均勻, 群落內(nèi)物種的親緣關(guān)系更為復(fù)雜。

表2 開(kāi)放式灘涂區(qū)和圍塘區(qū)的微型真核浮游生物群落的alpha多樣性指數(shù)

2.3 不同養(yǎng)殖區(qū)菲律賓蛤仔VOCs化合物組成及定量特征

經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)比對(duì)和人工手動(dòng)解譜, 獲得了菲律賓蛤仔揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的定性定量結(jié)果(表3, 圖2)。所有樣品中, 共鑒定出52種揮發(fā)性物質(zhì), 其中醛類11種、醇類7種、烷烴類5種、烯類4種、酯類4種、呋喃類3種、芳香烴3種、含硫化合物2種、含氮化合物2種, 其他11種。醛類中, 開(kāi)放灘涂區(qū)樣品苯乙醛占比最高(約10%), 圍塘區(qū)樣品正己醛占比最高(約7%); 醇類中, 蘑菇醇在兩個(gè)區(qū)域的樣品中均占比最高(約9%～18%)。

表3 開(kāi)放式灘涂區(qū)(LA)和圍塘區(qū)(HM)中菲律賓蛤仔VOCs化合物的組成含量(%)

續(xù)表

圖2 開(kāi)放式灘涂區(qū)(LA)和圍塘區(qū)(HM)菲律賓蛤仔揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成變化

對(duì)兩組揮發(fā)性物質(zhì)組成進(jìn)行PCA分析結(jié)果顯示, 從開(kāi)放式灘涂遷移至圍塘區(qū)養(yǎng)殖20 d后, VOCs組成結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化(圖3): 其中第一主成分的貢獻(xiàn)率為62.1%, 第二主成分的貢獻(xiàn)率為16.2%, 兩者累積貢獻(xiàn)率為78.3%, 說(shuō)明該分析模型形成的主成分可以真實(shí)反映樣本的整體信息, 兩者存在顯著差異(<0.05)。

圖3 開(kāi)放式灘涂區(qū)(LA)和圍塘區(qū)(HM)養(yǎng)殖后菲律賓蛤仔VOCs化合物PCA分析

比較VOCs各類化合物的相對(duì)含量可以看出(圖4), 總體而言, 醛類和醇類物質(zhì)是菲律賓蛤仔中相對(duì)含量最高的VOCs化合物(18%～36%), 芳香烴和含硫、含氮化合物類群相對(duì)含量較低(0.35%～3%)。從開(kāi)放灘涂區(qū)遷移至圍塘區(qū)養(yǎng)殖20 d后, 醛類、醇類、酯類和烯類化合物發(fā)生了顯著變化(<0.05), 其中, 醛類顯著降低, 醇類顯著升高, 酯類和烯類化合物也顯著升高。開(kāi)放灘涂區(qū)貝類中, 醛類的相對(duì)含量最高(35.55%±1.76%), 醇類相對(duì)含量為9.39%±0.43%; 圍塘區(qū)養(yǎng)殖后, 醇類相對(duì)含量成為最高(29.52%±2.45%), 而醛類降低為18.06%±8.39%。

對(duì)兩個(gè)區(qū)域化合物種類數(shù)的統(tǒng)計(jì)顯示(表4), 開(kāi)放灘涂區(qū)遷移至圍塘區(qū)養(yǎng)殖20 d后, 檢出的化合物種類數(shù)總體上降低, 其中醛類物質(zhì)變化最大, 檢出的醛類由10種降低為4種, 其中7種化合物在圍塘區(qū)未檢出, 但相對(duì)增加了1種化合物。檢出的醇類由5種降低為4種。兩組中沒(méi)有種類數(shù)量變化的各類VOCs中, 均存在化合物的變化(表3)。

相對(duì)含量發(fā)現(xiàn)顯著變化的幾種化合物來(lái)看(表3, 圖2), 同為C8化合物, 苯乙醛在LA組相對(duì)含量最高, 達(dá)10%, 但在圍塘區(qū)養(yǎng)殖后未被檢出; 而蘑菇醇在HM組中含量較LA組顯著增加(<0.05), 是HM組中占比最高的一種化合物, 也是構(gòu)成HM組中醇類顯著大于醛類的主要化合物; 烯類物質(zhì)中, 含量明顯變化的是1-乙基-2-甲基環(huán)戊烯, LA組中僅占0.93%±0.78%, 而HM組中其含量顯著增加(6.97%± 2.05%)。

圖4 開(kāi)放式灘涂區(qū)(LA)和圍塘區(qū)(HM)養(yǎng)殖后菲律賓蛤仔VOCs化合物相對(duì)含量變化

表4 開(kāi)放式灘涂區(qū)(LA)和圍塘區(qū)(HM)養(yǎng)殖后菲律賓蛤仔VOCs化合物種類數(shù)

2.4 養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境因子與菲律賓蛤仔VOCs組成的相關(guān)性

對(duì)開(kāi)放灘涂區(qū)(LA)和圍塘水域(HM)兩組的VOCs與環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析(Redundancy Analysis, RDA), 以挖掘影響菲律賓蛤仔VOCs構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)境因子(圖5, 表5)。結(jié)果顯示, LA組VOCs的組成結(jié)構(gòu)與非生物因子中鹽度(SAL)、溫度(T)、總?cè)芙夤腆w(TDS)及pH等正相關(guān), 與溶氧(DO)負(fù)相關(guān)(圖5a); 與微型浮游生物群落多樣性指數(shù)正相關(guān), 與藻類生物量(葉綠素和藍(lán)綠藻豐度)負(fù)相關(guān)(圖5b)。與LA組相反, HM組的VOCs的構(gòu)建與溶氧和藻類生物量指標(biāo)正相關(guān), 與多樣性指數(shù)和其他非生物環(huán)境因子負(fù)相關(guān)。從各類化合物與環(huán)境因子相關(guān)性特征來(lái)看, 醛類化合物(Q)與溶氧呈現(xiàn)負(fù)相關(guān), 醇類(C)和烯類化合物(X)與溶氧正相關(guān)。Mantel檢驗(yàn)分析顯示, 環(huán)境因子中, 餌料總體生物量指標(biāo)(葉綠素和藍(lán)綠藻)與菲律賓蛤仔VOCs具有顯著相關(guān)性(<0.05)。

圖5 開(kāi)放灘涂區(qū)(LA)和圍塘區(qū)(HM)養(yǎng)殖后菲律賓蛤仔VOCs各化合物與環(huán)境因子RAD分析(各物質(zhì)代碼編號(hào)所對(duì)應(yīng)化合物同表3)

表5 LA和HM環(huán)境參數(shù)矩陣對(duì)VOCs組成矩陣的Mantel分析

3 討論

菲律賓蛤仔在我國(guó)沿海南北海域均有大量養(yǎng)殖, 且生產(chǎn)過(guò)程基本形成了自然灘涂與人工圍塘相輔相成的格局, 進(jìn)行養(yǎng)殖區(qū)域遷移的現(xiàn)象廣泛存在。養(yǎng)殖系統(tǒng)變遷影響下, 貝類的生長(zhǎng)及生化代謝響應(yīng)的不同, 成為了其品質(zhì)變化的誘因。從多元環(huán)境因子中挖掘關(guān)鍵作用因子、解明作用機(jī)制, 對(duì)貝類的科學(xué)養(yǎng)殖、生產(chǎn)和管理以及優(yōu)化水產(chǎn)品品質(zhì)具有重要的作用。

利用菲律賓蛤仔養(yǎng)殖生產(chǎn)的典型遷移過(guò)程, 對(duì)比研究開(kāi)放灘涂區(qū)遷移至圍塘區(qū)養(yǎng)殖后, VOCs組成結(jié)構(gòu)特征及其環(huán)境關(guān)系, 可以看出: 養(yǎng)殖遷移會(huì)造成菲律賓蛤仔的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的重構(gòu), 其VOCs種類數(shù)、物質(zhì)組成和相對(duì)含量均發(fā)生顯著變化。開(kāi)放灘涂區(qū)生長(zhǎng)的菲律賓蛤仔, 其VOCs種類較圍塘區(qū)豐富。圍塘區(qū)養(yǎng)殖后, 不僅物質(zhì)種類數(shù)降低, 相對(duì)物質(zhì)比例也發(fā)生了變化。尤以醛、醇類產(chǎn)生了顯著變化、相對(duì)含量出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)逆轉(zhuǎn)。開(kāi)放灘涂區(qū)遷移至圍塘區(qū)養(yǎng)殖后, 菲律賓蛤仔的醛類相對(duì)含量顯著降低, 醇類的相對(duì)含量顯著增加。從環(huán)境因子與VOCs的多元相關(guān)性分析結(jié)果來(lái)看, 溶氧是影響兩個(gè)區(qū)域差別以及醛、醇類優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)換的主要因子。開(kāi)放灘涂區(qū)菲律賓蛤仔醛類物質(zhì)含量相對(duì)高, 說(shuō)明相對(duì)處于低氧化環(huán)境, 且環(huán)境相關(guān)性分析也顯示, 開(kāi)放灘涂區(qū)及醛類物質(zhì)與溶氧呈負(fù)相關(guān)關(guān)系, 說(shuō)明, 相對(duì)于圍塘區(qū)而言, 開(kāi)放灘涂區(qū)菲律賓蛤仔受到的低氧脅迫壓力較大。而圍塘區(qū)菲律賓蛤仔中, 醇含量顯著增加, 醛的種類數(shù)和含量均顯著下降, 說(shuō)明在圍塘區(qū)養(yǎng)殖貝類受到的低氧脅迫壓力相對(duì)小。這也與兩類化合物的氧化還原性質(zhì)一致。RAD分析結(jié)果也顯示, 醇類與溶氧正相關(guān)。貝類在圍塘區(qū)養(yǎng)殖, 可能因?yàn)轲B(yǎng)殖過(guò)程中維持了曝氣增氧, 改變了原來(lái)在自然灘涂受到的低氧脅迫。自然灘涂養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境中, 埋棲性貝類易受到低氧脅迫[13]。菲律賓蛤仔在運(yùn)輸遷移過(guò)程中, 也面臨對(duì)脅迫環(huán)境下響應(yīng), 但其自身具有快速調(diào)節(jié)恢復(fù)的功能[14]。為了適應(yīng)低氧環(huán)境, 貝類也進(jìn)化出了在有氧和厭氧呼吸中的相對(duì)靈活的轉(zhuǎn)換[15], 具有了相對(duì)高效的能量代謝能力, 以產(chǎn)生低毒或更多揮發(fā)性有機(jī)化合物以利于廢物排出[16], 這可能與開(kāi)放灘涂區(qū)養(yǎng)殖的菲律賓蛤仔具有更多的VOCs相關(guān)。在圍塘區(qū)養(yǎng)殖菲律賓蛤仔以增肥過(guò)程中, 養(yǎng)殖過(guò)程的溶氧條件, 不僅是貝類存活與生長(zhǎng)關(guān)鍵因子, 通過(guò)對(duì)貝類揮發(fā)性物質(zhì)代謝的影響, 在風(fēng)味特征構(gòu)建方面也具有重要的作用。

貝類VOCs差異與兩個(gè)海區(qū)的微型浮游生物組成結(jié)構(gòu)具有顯著相關(guān)性。從生化代謝角度而言, 貝類VOCs的醇和醛類物質(zhì), 一般來(lái)源于不飽和脂肪酸和氨基酸的代謝分解[17]。貝類脂肪酸的組成結(jié)構(gòu)受到其攝食餌料微藻的重要影響, 環(huán)境中不同微藻類群決定了貝類脂肪酸的不同組成結(jié)構(gòu)[18-19]。開(kāi)放灘涂區(qū)中, 微型生物多樣性高, 相對(duì)生物量低; 而圍塘養(yǎng)殖區(qū), 生物多樣性低, 但相對(duì)生物量高。定海灣灘涂區(qū)(LA)的微藻以硅藻和甲藻為優(yōu)勢(shì), 是典型的沿海水域微藻結(jié)構(gòu)特點(diǎn), 橫碼圍塘養(yǎng)殖區(qū)(HM)中, 從真核微型生物結(jié)構(gòu)而言, 缺乏硅藻類群, 但其藍(lán)綠藻生物量和微藻總生物量(Chl)相對(duì)高, 反應(yīng)了圍塘區(qū)貝類有相對(duì)充足的但是相對(duì)單一的餌料環(huán)境。醛類和醇類是菲律賓蛤仔中相對(duì)含量最高的VOCs。溶氧是造成醛、醇類VOCs顯著變化的主導(dǎo)因子。溶氧水平影響了菲律賓蛤仔的氨基酸代謝途徑, 在低氧脅迫時(shí), 菲律賓蛤仔利用體內(nèi)各類氨基酸等物質(zhì)的代謝調(diào)控, 實(shí)現(xiàn)機(jī)體在低氧脅迫時(shí)的保護(hù)和調(diào)節(jié)[20]。由此可見(jiàn), 溶氧和餌料“質(zhì)量”是菲律賓蛤仔VOCs化合物構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)境因子, 與貝類脂肪酸和氨基酸等重要品質(zhì)構(gòu)建環(huán)境因子相一致。Ran等[21]對(duì)縊蟶在鹽度變化影響下?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析發(fā)現(xiàn), 隨著鹽度的升高, 縊蟶鮮肉的VOCs中, 醇類物質(zhì)相對(duì)含量降低, 醛類物質(zhì)相對(duì)含量增加。本研究對(duì)菲律賓蛤仔的分析結(jié)果也顯示, 其VOCs的醇類相對(duì)含量與鹽度呈負(fù)相關(guān), 醛類相對(duì)含量與鹽度呈正相關(guān), 兩個(gè)物種具有相同的特征。但是, Ran等[23]的研究中, 將縊蟶蒸煮過(guò)以后, 這種規(guī)律消失, 說(shuō)明貝類生長(zhǎng)環(huán)境因子是構(gòu)成這種規(guī)律的直接因素, 因此反應(yīng)的是環(huán)境因子影響的直接結(jié)果。從分析檢測(cè)技術(shù)而言, 基于頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS技術(shù)分析VOCs的樣品處理簡(jiǎn)潔、檢出效率相對(duì)高效, 利用養(yǎng)殖貝類VOCs組成結(jié)構(gòu)特征、及其與多元環(huán)境因子綜合關(guān)聯(lián)分析的方法, 可能與利用檢測(cè)分析VOCs實(shí)現(xiàn)對(duì)食品品質(zhì)變化和微生物變化一樣[22], 有助于比較和評(píng)價(jià)養(yǎng)殖環(huán)境質(zhì)量以及貝類水產(chǎn)品品質(zhì)[23]。

菲律賓蛤仔從開(kāi)放灘涂區(qū)遷移到圍塘區(qū)養(yǎng)殖后, 蘑菇醇的相對(duì)含量顯著升高。同時(shí), 苯乙醛在開(kāi)放灘涂區(qū)菲律賓蛤仔中有最高的相對(duì)含量, 但遷移至圍塘區(qū)養(yǎng)殖后未能檢出。苯乙醛具有玫瑰香和果香, 被認(rèn)為是水產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)好的關(guān)鍵物質(zhì)之一[24], 可能也是自然灘涂水域養(yǎng)殖貝類風(fēng)味優(yōu)于圍塘水質(zhì)的原因。蘑菇醇為脂類代謝來(lái)源的不飽和醇類, 在多種動(dòng)植物及海產(chǎn)品中均可檢測(cè)到[25-27], 具有類似蘑菇的氣味特征。相對(duì)于其他飽和醇類, 具有較低的風(fēng)味閾值, 易于被感知。蘑菇醇通過(guò)亞油酸或花生四烯酸過(guò)氧化而來(lái)[28]。在魚(yú)類中肌肉被氧化[29-30]、在豆類產(chǎn)品被水浸泡加工時(shí)[31], 蘑菇醇產(chǎn)生量會(huì)顯著提高[31]。單就分子結(jié)構(gòu)的相關(guān)性而言, 兩者的增減似乎暗示著某種代謝關(guān)聯(lián)。蘑菇醇的顯著增加是否與苯乙醛的顯著降低有相關(guān)代謝的關(guān)聯(lián)性, 有待進(jìn)一步開(kāi)展研究。

4 結(jié)論

菲律賓蛤仔在養(yǎng)殖遷移影響下, 其VOCs化合物的種類數(shù)、組成和相對(duì)含量均發(fā)生顯著變化。開(kāi)放灘涂區(qū)生長(zhǎng)的菲律賓蛤仔, 其VOCs種類比圍塘區(qū)豐富。圍塘區(qū)養(yǎng)殖后以醛、醇類產(chǎn)生的變化尤為顯著, 相對(duì)含量變化明顯。開(kāi)放灘涂區(qū)遷移至圍塘區(qū)養(yǎng)殖后, 菲律賓蛤仔的醛類相對(duì)含量顯著降低, 醇類的相對(duì)含量顯著增加。RDA分析結(jié)果來(lái)看, 溶氧是影響VOCs中醇醛類差別的主要因子, 顯示了菲律賓蛤仔對(duì)低氧脅迫和增氧措施的響應(yīng)特征。作為餌料重要來(lái)源的微型生物豐度和多樣性, 對(duì)VOCs的構(gòu)建具有顯著影響, 其多樣性和豐度是菲律賓蛤仔VOCs構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)境因子。

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Effect of aquaculture site transfer on the composition of volatile organic compounds in

YANG Ling1, GUO He2, XU Zhi-hui2, SHAO Qian-wen3, RAN Zhao-shou2, ZHOU Cheng-xu1

(1. College of Food and Pharmaceutical Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 2. College of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China; 3. Ningbo Institute of Oceanography, Ningbo 315832, China)

Environmental factors play critical roles in creating volatile organic compounds (VOCs). In the present study, sampling was conducted during transfer activity at a Manila clam () aquaculture site. The muscle tissue of the clams was used to analyze how VOCs changed and to what extent they were affected by environmental factors. Fifty-two VOCs were identified in the musclesamples by headspace solid-phase micro-extraction/gas chromatography-mass spectrometry. The VOCs were mainly aldehydes, alcohols, ester hydrocarbons, furans, alkanes, alkenes, aromatic hydrocarbons, and sulfur-containing and nitrogen-containing compounds. Forty-one VOCs in the samples were detected from the natural tidal flats. Thirty-two VOCs were detected ～20 d after transferring the clams to an enclosed aquaculture pond. The diversity and types of VOCs changed because of the site transfer. The relative amounts of aldehydes and alcohols were the highest in both groups of samples, and these two compound types varied significantly. The relative amount of aldehydes was higher than that of alcohols in samples from the natural tidal flats. This relationship was reversed after the 20-d culture period (the relative amount of alcohols became higher than that of aldehydes). Dissolved oxygen was the main factor. The abundance and biodiversity of microeukaryotic plankton were significantly correlated with the VOC composition. The biodiversity of the microorganisms was relatively higher in the natural tidal flats, whereas biomass and relative abundance were relatively lower. The abundance was relatively high, but biodiversity was relatively low in the enclosed aquaculture ponds. This study established direct associations between critical environmental factors and the VOC composition of Manila clams. This study provides a reference to further research the mechanism of the correlations and optimize the aquaculture management of Manila clams.

; volatile organic compounds; environmental factors; microeukaryotic plankton; aquaculture site transfer

Feb. 24, 2022

S966

A

1000-3096(2023)6-0079-12

10.11759/hykx20220224002

2022-02-24;

2022-09-05

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)課題(2018YFD0900702); 國(guó)家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-49)

[Special Fund for National Key Research and Development Project of China, No. 2018YFD0900702; National Shellfish Industry Technology System, No. CARS-49]

楊玲(1996—), 女, 碩士研究生, 研究方向?yàn)樨愵惡ｕr品風(fēng)味構(gòu)建的環(huán)境溯源, E-mail: 17805803137@163.com; 周成旭(1968—), 女,通信作者, 研究員, 研究方向?yàn)樨愵愷D料營(yíng)養(yǎng)與微藻資源利用, E-mail: zhouchengxu@nbu.edu.cn

(本文編輯: 康亦兼)