基于HS-SPME-GC-MS 和多元統(tǒng)計分析三種紅茶特征揮發(fā)性成分

周 佳，蘇 丹，王志霞，任洪濤，黃 媛，于 娟，李亞莉，周紅杰,

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)院，云南昆明 650000；2.信陽農(nóng)林學(xué)院茶學(xué)院，河南信陽 464000；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)香料研究所，云南昆明 650000）

紅茶是世界上產(chǎn)量最高、消費區(qū)域最廣、貿(mào)易量最大的茶類[1-4]。我國紅茶按地域可分為祁紅、滇紅、川紅等[5]。香氣是決定茶葉品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是形成茶葉風(fēng)味與品質(zhì)特征的重要因子。香氣特征不僅影響茶葉的等級，也是大眾消費的重要導(dǎo)向之一[6-8]。紅茶中揮發(fā)性成分的種類和含量直接影響紅茶香氣及香型，因此對紅茶揮發(fā)性成分與香氣品質(zhì)關(guān)系的研究一直是茶葉科學(xué)的熱門領(lǐng)域，具有重要的實用價值和研究價值[9-11]。目前頂空固相微萃?。℉SSPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）方法已廣泛應(yīng)用于各種食品和藥品揮發(fā)性成分的研究[12-13]。HS-SPME 是一種綠色環(huán)保型樣品分析前處理技術(shù)，具有敏感、快速、操作簡單、樣品用量少、不用溶劑等優(yōu)點[6,14-18]。通過配置全自動頂空進(jìn)樣裝置的GC-MS，可實現(xiàn)復(fù)雜樣品檢測的高通量、自動化，大大降低人工操作誤差，同時提高工作效率[6,14]。

在我國眾多的紅茶種類中，滇紅和祁紅是很受歡迎的傳統(tǒng)特色紅茶[19-20]，近年興起的GABA 紅茶也受到了消費者的青睞。目前，對滇紅與祁紅揮發(fā)性成分已有研究報道，任洪濤等[21]對不同級別云南工夫紅茶香氣成分進(jìn)行了比較研究，劉盼盼等[22]對17 個國內(nèi)主產(chǎn)茶區(qū)工夫紅茶進(jìn)行了品質(zhì)分析與綜合評價，羅學(xué)平等[23]采用固相微萃?。⊿PME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用法對川紅、滇紅和祁紅香氣成分進(jìn)行分析。但是對GABA 紅茶揮發(fā)性成分的研究較少，缺少有力的風(fēng)味品質(zhì)研究的基礎(chǔ)理論支撐，因此尚需深入研究，同時也未見對這三種紅茶揮發(fā)性成分的綜合比較研究。

因此，本研究以這3 種紅茶為研究對象，采用HS-SPME-GC-MS 結(jié)合多元統(tǒng)計方法解析三種紅茶的關(guān)鍵香氣物質(zhì)及差異，以期為祁門紅茶、GABA 紅茶、滇紅香氣品質(zhì)差異奠定理論基礎(chǔ)，為科學(xué)客觀地評價GABA 紅茶香氣品質(zhì)和培育新型優(yōu)質(zhì)紅茶提供參考，并為構(gòu)建不同種類紅茶風(fēng)味品質(zhì)鑒別圖譜提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

祁門紅茶 安徽祁門祥源茶葉公司制備，品種為祁門櫧葉種；GABA 紅茶 云南省大理市云龍縣大栗樹茶廠利用厭氧處理技術(shù)制備，品種為云抗十號；滇紅 由云南滇紅集團(tuán)股份有限公司制備，品種為云抗十號。三種茶樣茶鮮葉均于2022 年4 月按一芽一二葉標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行采摘，基本制備流程為萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥。癸酸乙酯 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

CTC 自動進(jìn)樣器、HP7890A-5975C 型GC-MS聯(lián)用儀、HP-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）

美國Agilent 公司；65 μm 聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯（polydimethylsiloxane/divinylbenzene，PDMS/DVB）萃取頭 美國Supelco 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HS-SPME 條件 稱取磨碎茶樣1.00 g 放入20 mL 頂空瓶中，加入1.00 μg 癸酸乙酯作為內(nèi)標(biāo)，加入5 mL 沸水，密封瓶口。將CTC 自動進(jìn)樣器于60 ℃條件下穩(wěn)定10 min，保證進(jìn)樣穩(wěn)定性；并采用65 μm PDMS/DVB 萃取頭，在250 r/min、60 ℃條件下孵化50 min，所有樣品重復(fù)3 次，進(jìn)行數(shù)據(jù)采集[24]。

1.2.2 GC 條件 以氦氣（He，純度＞99.999%）為載氣。HP-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度230 ℃，脫吸附時間5 min；升溫程序：初始溫度50 ℃保持5 min，再以6 ℃/min升至250 ℃，保持15 min。

1.2.3 MS 條件 電子電離源：離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；四極桿溫度150 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)樣品總離子流圖，結(jié)合譜庫檢索（Wiley 和NIST 庫）和前人相關(guān)研究[24-25]，對三種紅茶揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，以癸酸乙酯為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法定量計算各組分含量，計算公式如下：采用Excel 2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理；TBtools 1.098對香氣組分進(jìn)行層次聚類和熱圖繪制；偏最小二乘判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）由代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站MetaboAnalyst進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種紅茶揮發(fā)性成分的定性及定量分析

采用GC-MS 對三種紅茶樣品的揮發(fā)性成分進(jìn)行檢測，通過譜庫檢索、保留指數(shù)、特征離子對比，共定性鑒定出78 種已知揮發(fā)性成分（表1：Q-祁門紅茶；G-GABA 紅茶；D-滇紅），按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)可分為8 類，包括萜烯類、碳?xì)浠衔铩⒋碱?、醛類、酮類、酯類、酚類、雜環(huán)化合物。其中，碳?xì)浠衔锏姆N類最多（24 種），以烷烴和萘為主，萜烯類（14 種）、醇類（9 種）、酯類（9 種）、酮類（8 種）、醛類（7 種）、雜環(huán)化合物（5 種）的種類次之，最少的是酚類（2 種）。祁門紅茶的揮發(fā)性成分共8 類58 種，GABA 紅茶的揮發(fā)性成分為8 類60 種，滇紅的揮發(fā)性成分為7 類58 種，滇紅中未檢測出酚類物質(zhì)。由此也可看出，除GABA 紅茶的揮發(fā)性成分?jǐn)?shù)量略多外，三種紅茶在總揮發(fā)性物質(zhì)種類數(shù)量方面差異較小。

三種紅茶的揮發(fā)性物質(zhì)中，碳?xì)浠衔锖洼葡╊惙N類數(shù)量較多，但含量偏低；醇類物質(zhì)種類偏少，但其含量最高（圖1）。三種紅茶在總揮發(fā)性物質(zhì)種類數(shù)量方面差異較小，但其含量差異較大。祁門紅茶揮發(fā)性物質(zhì)的總含量為14.45 μg/g，GABA 紅茶為18.7 μg/g，滇紅為21.3 μg/g，說明茶樹品種對揮發(fā)性物質(zhì)的含量高低有較大影響。相對而言，由云南大葉種所制紅茶，其揮發(fā)性物質(zhì)總含量更高；由中小葉種所制的祁門紅茶，其揮發(fā)性物質(zhì)總量則偏低。但就GABA 紅茶與滇紅，經(jīng)過厭氧處理的GABA 紅茶揮發(fā)性物質(zhì)總量低于滇紅，也說明厭氧處理的過程中會使部分揮發(fā)性物質(zhì)消失，最終成茶中揮發(fā)性物質(zhì)總量減少。

圖1 三種紅茶揮發(fā)性成分總含量對比Fig.1 Comparison of total volatile components in three kinds of black tea

三種紅茶中共有揮發(fā)性成分43 種（圖2），主要包括芳樟醇、香葉醇、壬醛、水楊酸甲酯、氧化芳樟醇等，這也是三類紅茶花果香、甜香突出的物質(zhì)基礎(chǔ)。已有研究表明，芳樟醇及其氧化物、香葉醇、水楊酸甲酯等是紅茶特征性香氣物質(zhì)，與本研究結(jié)果相符[26-27]。

圖2 三種紅茶共有和特有揮發(fā)性香氣成分種類分布圖Fig.2 Distribution map of common and unique volatile aroma components in three kinds of black tea

祁門紅茶特有揮發(fā)性成分9 種，主要有苯乙醇、法呢醇、苯甲醛、癸醛等。苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰香，法呢醇呈淡的白檸檬似香味，癸醛具有似甜橙油與檸檬油以及玫瑰的香氣[28]，這些香氣物質(zhì)有利于祁門紅茶在花香的基礎(chǔ)上，玫瑰香型和檸檬香型的提升。GABA 紅茶特有揮發(fā)性成分6 種，主要有茉莉酮、1-甲基雙環(huán)[6.4.0]十二烷-11-酮等。茉莉酮呈優(yōu)雅的茉莉花香[29]，有利于GABA 紅茶茉莉香型的呈現(xiàn)。滇紅特有揮發(fā)性成分8 種，主要有萜品油烯、順式-β-羅勒烯、α-萜品烯等，其中α-萜品烯具有柑橘和檸檬似香氣[30]，有助于滇紅果香的體現(xiàn)。

2.2 多元統(tǒng)計分析三種紅茶揮發(fā)性成分

2.2.1 基于三種紅茶揮發(fā)性成分的聚類及熱圖分析

為進(jìn)一步探究揮發(fā)性成分與三種紅茶的關(guān)系，對其揮發(fā)性成分進(jìn)行層次聚類分析，結(jié)果如圖3A 顯示。通過聚類分析可將其分為兩類，分別為組1 和組2，第一組包括GABA 紅茶和滇紅，第二組包括祁門紅茶。因此，根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)的不同可以區(qū)分GABA紅茶、滇紅、祁門紅茶，也進(jìn)一步印證了茶樹品種的不同對成茶的揮發(fā)性物質(zhì)會產(chǎn)生重要影響。

圖3 三種紅茶揮發(fā)性成分的層次聚類（A）及熱圖（B）Fig.3 Hierarchical clustering (A) and heat map (B) of volatile components in three black tea

除聚類分析外，還進(jìn)行了熱圖分析（圖3B），以表征三種紅茶中揮發(fā)性成分的差異。熱圖結(jié)果顯示，祁門紅茶中α-古巴烯、δ-杜松油烯、α-白菖考烯、香葉醇、橙花醇、β-環(huán)檸檬醛、順式-香葉基丙酮、反式-β-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、醋酸橙花酯等揮發(fā)性物質(zhì)的含量普遍較高，明顯高于其他兩類，而這些物質(zhì)大多具有較好的香型，對成品茶香氣的貢獻(xiàn)較大。滇紅中D-檸檬烯、反式-β-羅勒烯、二十烷、十六烷、正十七烷、萘、壬醛、3-十一酮、氧化芳樟醇、芳樟醇氧化物（順式吡喃型）、2-（2-呋喃基）-5-呋喃甲醛等揮發(fā)性物質(zhì)的含量要更高，除部分萜烯類與雜環(huán)化合物外，烷烴類揮發(fā)性物質(zhì)對香氣貢獻(xiàn)很小。GABA 紅茶中2-甲基十八烷、壬基環(huán)戊烷、反式-3-丁酸己烯酯、順-3-己酸己烯酯等揮發(fā)性物質(zhì)的含量普遍較高，以烷烴和酯類為主，除順-3-己酸己烯酯外，都對香氣貢獻(xiàn)很小。由此也可看出，經(jīng)厭氧處理后的GABA 紅茶，有利于順-3-己酸己烯酯含量的增加。

總而言之，祁門紅茶雖揮發(fā)性物質(zhì)總含量較低，但其揮發(fā)性含量普遍較高的物質(zhì)中具有較多芳香氣息的物質(zhì)，種類豐富且含量較高。GABA 紅茶雖在含量總量明顯高于祁門紅茶，但其含量普遍較高的揮發(fā)性物質(zhì)對成茶香氣貢獻(xiàn)不大。而滇紅總揮發(fā)性物質(zhì)含量在三者之中最高，且部分對香氣貢獻(xiàn)度較高的萜烯類與雜環(huán)化合物也明顯高于其他兩類。

2.2.2 基于PLS-DA 分析三種紅茶關(guān)鍵揮發(fā)性成分

PLS-DA 是一種新的多因變量到多因變量回歸建模的多元統(tǒng)計方法，可以準(zhǔn)確地確定影響群體的關(guān)鍵變量[28,31]。利用PLS-DA 進(jìn)一步篩選影響三種紅茶香氣特征的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)，其中，變量重要性因子（VIP）可以量化每個變量對分類的貢獻(xiàn)。當(dāng)VIP 值＞1 時，對應(yīng)變量可定義為判別模型的關(guān)鍵變量[32]。

PLS-DA 的得分圖表明茶葉樣品有明顯的分離，PC1 和PC2 分別解釋了總方差的74.8%和25.2%（圖4A）。這些結(jié)果表明，三種紅茶中揮發(fā)性成分有較大差異。根據(jù)VIP 值（VIP＞1）和P值（P＜0.05）篩選出關(guān)鍵揮發(fā)性成分，結(jié)果顯示共篩選出12 種差異揮發(fā)性物質(zhì)（圖4B），其中酯類5 種、醇類2 種、酚類2 種、醛類1 種、萜烯類1 種、碳?xì)浠衔? 種，分別為醋酸橙花酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、棕櫚酸甲酯、順-3-己烯基異戊酸酯、水楊酸甲酯、異龍腦、芳樟醇、3-甲基-4-氨基苯酚、4-氨基-2-甲基苯酚、檸檬醛、蒈烯、5-甲基十四烷。

圖4 三種紅茶揮發(fā)性成分偏最小二乘-判別分析Fig.4 Partial least squares discriminant analysis of volatile components in three black tea

根據(jù)VIP 值（VIP＞1）篩選出的12 種差異揮發(fā)性物質(zhì)中，通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)6 種具有明顯香氣特征的物質(zhì)（表2），通過分層聚類熱圖可將這六種香氣成分完全劃分為三類，分別為I 類、II 類、III 類（圖4C）。

表2 三種紅茶中主要差異性香氣成分及其特征Table 2 Main differential aroma components and their characteristics in three kinds of black tea

I 類共2 種揮發(fā)性成分，包括醋酸橙花酯、檸檬醛。醋酸橙花酯一般呈橙花和玫瑰香氣及蜂蜜和覆盆子甜香味，檸檬醛則呈濃郁檸檬香味，這些香氣物質(zhì)有助于祁門紅茶花果香的體現(xiàn)，尤其體現(xiàn)為玫瑰香型和檸檬香型的提升。結(jié)果還表明（圖5），祁門紅茶中這兩種物質(zhì)含量明顯高于GABA 紅茶與滇紅，并且滇紅中不含有這兩類香氣物質(zhì)，但經(jīng)過厭氧處理方式加工而成的GABA 紅茶中這兩類香氣物質(zhì)顯現(xiàn)，說明厭氧處理在一定程度上能促進(jìn)醋酸橙花酯和檸檬醛的產(chǎn)生，對形成GABA 紅茶花果香具有一定作用。

圖5 六種香氣物質(zhì)在三種紅茶中的含量對比情況Fig.5 Comparison of six aroma substances in three kinds of black tea

II 類共2 種揮發(fā)性成分，包括異龍腦、鄰苯二甲酸二異丁酯。其中，異龍腦有近似樟腦的氣味，這兩類物質(zhì)在祁門紅茶中并未檢測出（圖5），滇紅中含量最高，在GABA 紅茶中則有所降低，由此可看出厭氧處理一定程度上對抑制異龍腦的增加有影響。

III 類共2 種揮發(fā)性成分，包括芳樟醇、水楊酸甲酯。芳樟醇具有甜嫩新鮮的花香，似鈴蘭香氣，水楊酸甲酯具有冬青葉香味。這兩類物質(zhì)在GABA 紅茶與滇紅中的含量明顯高于祁門紅茶且實際含量很高（圖5），有助于GABA 紅茶與滇紅甜香、花香的富集。還可看出芳樟醇經(jīng)過厭氧處理后含量有所降低。

3 結(jié)論

本文對GABA 紅茶、滇紅、祁門紅茶的揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，共定性鑒定出78 種已知揮發(fā)性成分，三種紅茶香氣成分具有一定的相似性，根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)的香氣特征，均有利于紅茶甜香與花果香的體現(xiàn)。三種紅茶總揮發(fā)性物質(zhì)種類數(shù)量接近，但三種紅茶揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)又有明顯差異，主要體現(xiàn)在揮發(fā)性物質(zhì)含量的高低和香型的不同。

祁門紅茶香氣物質(zhì)種類豐富且含量較高，特有苯乙醇、法呢醇、苯甲醛、癸醛等，再者祁門紅茶中醋酸橙花酯、檸檬醛明顯高于其他兩類，這些香氣物質(zhì)有助于祁門紅茶花果香的體現(xiàn)，尤其體現(xiàn)為玫瑰香型和檸檬香型的提升；GABA 紅茶和滇紅總揮發(fā)性物質(zhì)含量相比祁門紅茶更高，GABA 紅茶除順-3-己酸己烯酯外，含量普遍較高的揮發(fā)性物質(zhì)對成茶香氣貢獻(xiàn)不大，特有茉莉酮、1-甲基雙環(huán)[6.4.0]十二烷-11-酮等，有利于GABA 紅茶花香中茉莉香型更顯；滇紅總揮發(fā)性物質(zhì)含量在三者之中最高，且部分對香氣貢獻(xiàn)度較高的萜烯類與雜環(huán)化合物明顯高于其他兩類，特有萜品油烯、順式-β-羅勒烯、α-萜品烯等，再者芳樟醇含量也明顯高于其他兩類，有助于滇紅甜香、花果香的富集。通過PLS-DA 分析明確了醋酸橙花酯、水楊酸甲酯、異龍腦、芳樟醇、檸檬醛等關(guān)鍵揮發(fā)性成分，可以明顯區(qū)分三種紅茶。

此外發(fā)現(xiàn)茶樹品種對紅茶揮發(fā)性成分有重要影響，由云南大葉種所制紅茶其揮發(fā)性物質(zhì)總含量更高，這與曹曉念等[35]研究結(jié)果一致。同時厭氧工藝的處理會促進(jìn)醋酸橙花酯、檸檬醛、順-3-己酸己烯酯等香氣物質(zhì)的顯現(xiàn)與增加，但一定程度上會抑制異龍腦、芳樟醇等物質(zhì)的升高。

本文通過對三種紅茶揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行研究，確定其關(guān)鍵揮發(fā)性成分，為三種紅茶品質(zhì)差異奠定理論基礎(chǔ)，并為構(gòu)建不同種類紅茶風(fēng)味品質(zhì)鑒別圖譜提供數(shù)據(jù)支撐，也為科學(xué)客觀地評價GABA 紅茶香氣品質(zhì)提供理論支持。同時厭氧等工藝的處理為培育新型優(yōu)質(zhì)紅茶提供參考，為進(jìn)一步豐富紅茶品類、開拓紅茶市場以及為紅茶產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展提供技術(shù)與理論支撐。由于三種紅茶的香氣品質(zhì)可能受到其他因素的影響，如土壤條件、栽培海拔高度等。還需進(jìn)一步控制變量并增加試驗樣本，并進(jìn)一步結(jié)合GC-O、OAV 和氣相色譜離子遷移譜等技術(shù)開展三種紅茶香氣研究，以期為三者品質(zhì)評定提供更多客觀依據(jù)。