長(zhǎng)沙地區(qū)禽源mcr-1 腸桿菌流行病學(xué)調(diào)查

王文靜，杜陽洋,文立華,楊 俊,王紅兵，王 慧，杜麗 飛,劉俊琦※，周望平※

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南長(zhǎng)沙 410131；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙 410128）

抗生素一直是人類抵御各種感染性疾病的主要武器，隨著耐藥菌報(bào)道的日益增多，人類健康公共安全受到威脅。2009 年，Yong 等人首次發(fā)現(xiàn)“超級(jí)細(xì)菌”新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（NDM-1），并證實(shí)NDM-1 能介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)幾乎所有β-內(nèi)酰胺類藥物耐藥[1]。2015 年，沈建忠團(tuán)隊(duì)在大腸桿菌分離株中發(fā)現(xiàn)了一種新的質(zhì)粒介導(dǎo)的抗多黏菌素基因mcr-1[2]。多黏菌素類藥物是治療碳青霉烯耐藥腸桿菌科細(xì)菌( Carbapenem-resistant enterobacteriaceae,CRE）最有效的藥物，被認(rèn)為是治療碳青霉烯耐藥菌感染的“最后一道防線”[3]，然而，當(dāng)前黏菌素耐藥性的流行已經(jīng)成為一個(gè)重大的公共衛(wèi)生安全問題[2]。

有研究報(bào)道，從意大利的住院患者的大腸桿菌樣品中檢測(cè)到了mcr-1 黏菌素耐藥基因，雖然臨床分離所得株耐藥率較低，不過總體較為穩(wěn)定[4]。研究者從食物中分離出mcr 耐藥基因[5-7]，這表明mcr-1已經(jīng)在全球范圍內(nèi)傳播[8]，這些研究都表明了黏菌素耐藥基因mcr-1 傳播途徑的復(fù)雜性。隨后研究在野生動(dòng)物的排泄物中檢測(cè)到了黏菌素耐藥基因[9]。

我國(guó)在2017 年4 月30 日正式禁用黏菌素作為動(dòng)物促生長(zhǎng)劑[22]。但是，隨著近年來革蘭氏陰性菌多重耐藥性（MDR）的產(chǎn)生[10]，耐藥率的激增，讓人類著重考慮健康安全問題，因?yàn)槿狈梢該魯∵@些“超級(jí)細(xì)菌”的新抗生素，以及重要的可用和有效的抗生素通常無法對(duì)抗MDR 革蘭氏陰性病原體[11]，故多黏菌素類藥物又被重新考慮起來。有研究表明黏菌素耐藥的不同機(jī)制，包括內(nèi)在、突變和可轉(zhuǎn)移機(jī)制。

近年來，從動(dòng)物食品中分離出的微生物中攜帶多黏菌素耐藥基因，這引發(fā)人們對(duì)動(dòng)物未使用抗生素卻檢測(cè)出相關(guān)抗生素的討論。所以通過調(diào)查研究食源性動(dòng)物，禽源動(dòng)物的MCR-1 陽性腸桿菌的耐藥率，可以得知目前多黏菌素的耐藥程度，加以干預(yù)目前小型雞場(chǎng)、散雞養(yǎng)殖戶濫用藥物的現(xiàn)狀，以防對(duì)人類生命安全造成威脅，也防止這種抗生素的持續(xù)以來并控制黏菌素耐藥性的傳播[12]。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

從湖南長(zhǎng)沙某屠宰場(chǎng)采集雞源泄殖腔拭子23份，從湖南長(zhǎng)沙某生鮮市場(chǎng)采集雞源泄殖腔拭子52 份、鴿源泄殖腔拭子8 份、環(huán)境樣本40 份。

1.2 主要試劑及設(shè)備

瓊脂粉，阿莫西林、噻孢霉素、替加環(huán)素、慶大霉素、氧氟沙星、頭孢吡肟、氯霉素、林可霉素等藥敏試驗(yàn)藥物購自Solarbio；TSB 瓊脂購自O(shè)XOID；麥康凱瓊脂購自杭州微生物試劑有限公司；瓊脂糖購自Biosharp；SuperRed /GelRed 核 酸 染 料 購 自Biosharp；硫酸粘桿菌素購自麥克林；Biospin 細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司。

立式壓力蒸汽滅菌器購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BS-600L 電子天平購自上海友聲衡器有限公司；H1650-W 醫(yī)用離心機(jī)購自長(zhǎng)沙高新技術(shù)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；BHS-1 水浴鍋購自JOANLAB；Opticlean-1300 潔凈工作臺(tái)購自力康精密科技（上海）有限公司；DYY-6C 型電泳儀購自北京市六一儀器廠；AG22331 普通PCR 儀購自德國(guó)eppendorf；Tanon3500R 凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀購自上海賽默飛世爾儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

樣本采集后，加入2 mL TSB 液體培養(yǎng)基富集化培養(yǎng)2～3 h，接種于含有2 μg/mL 硫酸多黏菌素藥物的麥康凱培養(yǎng)基中，37℃溫箱培養(yǎng)12～16 h，篩選出黏菌素耐藥菌，使用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，按照說明書進(jìn)行細(xì)菌基因組提取。

1.3.2 耐藥菌株培養(yǎng)與保存

將純化后的菌株接種于普通培養(yǎng)基中富集化，加入2mL30%甘油和液體培養(yǎng)液1∶1 混合液，刮取菌落，抽取至離心管中，于-80℃冰箱保存。

1.2.3 PCR 鑒定

據(jù)NCBI 上已發(fā)表的大腸桿菌的MCR-1 基因（參考菌株：KU743383.1，位置28185-29810），用BLAST 進(jìn)行特異性和保守型比較分析，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 細(xì)菌核酸檢測(cè)引物信息

挑選麥康凱培養(yǎng)基中目的菌落接種于普通培養(yǎng)基中純化，使用mcr-1 引物進(jìn)行鑒定。PCR 反應(yīng)運(yùn)行體系25 μL，其中模板2 μL，mcr-1 上游引物1 μL，mcr-1 下游引物1μL，2×Ex Taq Premix12.5 μL，滅菌純水8.5 μL。

1.3.4 抗菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

按照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)抗菌藥物敏感性試驗(yàn)( Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）和歐洲臨床微生物和感染病學(xué)會(huì)藥敏委員會(huì) ( EUropean Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）標(biāo)準(zhǔn)[13-14]，采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)耐藥菌株對(duì)8 種藥物的最低抑菌濃度（MIC）包括氧氟沙星、頭孢吡肟、林可霉素、噻孢霉素、阿莫西林、替加環(huán)素、慶大環(huán)素、氯霉素，藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷參照文獻(xiàn)[15]。

2 結(jié)果

2.1 腸桿菌的分離

采集的123 份樣品中，共分離到119 株腸桿菌，其中禽源屠宰場(chǎng)22 株、生鮮市場(chǎng)97 株（包括雞源50 株，環(huán)境39 株，鴿源8 株）。

2.2 耐藥菌分離鑒定

119 株腸桿菌中分離到21 株含有mcr-1 耐藥基因的腸桿菌（17.6%，21/119），其中屠宰場(chǎng)分離得3 株、生鮮市場(chǎng)分離得18 株（其中雞源14 株，環(huán)境3 株，鴿源1 株），分離結(jié)果見表2。

表2 樣本分組Table2 Grouping ofSamples

2.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

17 株mcr-1 多黏菌是耐藥菌對(duì)氧氟沙星、頭孢吡肟、林可霉素、噻孢霉素、阿莫西林、替加環(huán)素、慶大環(huán)素、氯霉素等抗生素的MIC 值見表3。17 株腸桿菌對(duì)林可霉素和阿莫西林耐藥率均為100%，對(duì)氯霉素耐藥率為94%，對(duì)慶大環(huán)素耐藥率為88%，對(duì)氧氟沙星耐藥率為76%，對(duì)噻孢霉素耐藥率為65%，對(duì)替加環(huán)素耐藥率為0%（圖1）。17 株腸桿菌對(duì)2 種藥物耐藥菌株占5.9%（n=1），對(duì)3 種藥物耐藥菌株占5.9%（n=1），對(duì)5 種藥物耐藥菌株占23.5%（n=4），對(duì)6 種藥物耐藥菌株占38.9（n=7），對(duì)7 種藥物耐藥菌株占23.5%（n=4）。

圖1 藥物對(duì)耐藥菌株的耐藥率Fig.1 Resistance rate ofeight drugsto resistant strains

表3 抗菌藥物敏感性測(cè)試結(jié)果Table3 Antimicrobial susceptibility test results

腸桿菌科細(xì)菌是一種常見的機(jī)會(huì)致病菌，主要導(dǎo)致肺炎、腹腔感染等，隨著“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)，人們對(duì)多黏菌素藥物的依賴日益增加。近年來，由于多黏菌素耐藥基因mcr-1 的出現(xiàn)，人們又開始擔(dān)憂公眾安全問題，在國(guó)內(nèi)頒發(fā)黏菌素禁藥政策后，黏菌素耐藥率也在逐漸下降。

本試驗(yàn)中，可以觀察到，提取出的17 株mcr-1耐藥陽性菌株對(duì)林可霉素、阿莫西林的耐藥率較高，與Song 等研究結(jié)果基本一致[23]；替加環(huán)素耐藥率為0%，說明替加環(huán)素還未在本地區(qū)大范圍使用，可能是碳青霉烯耐藥菌感染的理想治療抗生素。在藥敏試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，藥敏試驗(yàn)與耐藥菌株的結(jié)果相一致，大多數(shù)mcr-1 陽性大腸桿菌對(duì)氧氟沙星、頭孢吡肟及替加環(huán)素較為敏感，可能與樣本來源地較少使用該類藥物有關(guān)；同時(shí)，這些陽性菌株對(duì)噻孢霉素的藥敏性呈現(xiàn)出較大差異，而噻孢霉素較青霉素效果較差且較為昂貴，一般很少在養(yǎng)殖業(yè)用到，在以往研究中也很少提到，出現(xiàn)差異的原因耐人尋味。值得注意的是，F(xiàn)6、F30、H17、G2 等菌株對(duì)試驗(yàn)中八種抗生素中大多數(shù)都存在較強(qiáng)的耐藥性，說明這幾種菌株已經(jīng)出現(xiàn)多重耐藥性，未來可能發(fā)展成為“超級(jí)耐藥細(xì)菌”。

另外，生鮮市場(chǎng)和屠宰場(chǎng)的雞糞便中mcr-1 陽性率都超過10%，生鮮市場(chǎng)的雞和鴿子大多來源于散養(yǎng)戶，這說明長(zhǎng)沙地區(qū)大腸桿菌對(duì)多黏菌素耐藥情況較為嚴(yán)重，家禽養(yǎng)殖戶可能存在黏菌素濫用泛用的行為。在生鮮市場(chǎng)周圍所采集的環(huán)境樣本中也檢出3 株mcr-1 陽性株，可能是人類活動(dòng)過程中攜帶的黏菌素耐藥基因傳播到了自然環(huán)境中，或是禽類生活過程中將攜帶的黏菌素耐藥基因傳播到了其他自然環(huán)境中。屠宰場(chǎng)糞便、生鮮市場(chǎng)糞便和環(huán)境中均檢測(cè)到耐藥基因，說明動(dòng)物與環(huán)境之間存在相互傳播，且有進(jìn)一步傳染到人體的可能性，這與王警等[24]研究中提出的觀點(diǎn)一致。各類屠宰場(chǎng)應(yīng)該嚴(yán)格制定管理?xiàng)l例并嚴(yán)格執(zhí)行，做好動(dòng)物的健康監(jiān)測(cè)，正確處理排放廢水或污水，及時(shí)消毒，做好環(huán)境保障工作。

如今mcr-1 耐藥菌肆虐，危害公共健康，而多黏菌素類藥物被限制使用，“最后一道防線”藥物所剩無幾，為防止人類和動(dòng)物在往后的疾病侵襲中陷入無藥可用的境地，市場(chǎng)要加強(qiáng)藥物管理，嚴(yán)格執(zhí)行獸藥專用；養(yǎng)殖戶應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，減少藥物濫用。 □