微生物治理有害藻華研究進(jìn)展

劉姍姍, 俞志明, 曹西華, 宋秀賢

微生物治理有害藻華研究進(jìn)展

劉姍姍1, 2, 3, 4, 俞志明1, 2, 3, 4, 曹西華1, 2, 4, 宋秀賢1, 2, 3, 4

(1. 中國(guó)科學(xué)院海洋研究所 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 嶗山實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266237; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 4.中國(guó)科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 山東 青島 266071)

近年來(lái), 全球近海海域有害藻華頻發(fā), 導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題與經(jīng)濟(jì)損失, 如何有效地治理有害藻華引發(fā)全球關(guān)注。抑藻微生物可以通過(guò)細(xì)胞接觸等直接方式及分泌胞外活性物質(zhì)等間接方式破壞藻細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理過(guò)程和遺傳功能, 進(jìn)而抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。本文總結(jié)了抑藻微生物控制有害藻華的主要作用原理和研究進(jìn)展, 綜述了當(dāng)前以微生物為基礎(chǔ)的控制藻華的方法和技術(shù), 探討了其在有害藻華治理方面的發(fā)展方向與應(yīng)用前景, 以期為有害藻華的防控提供參考。

抑藻微生物; 有害藻華治理; 研究進(jìn)展

有害藻華(harmful algal blooms, HABs)是由水體中的藻類大量增殖或聚集而形成的一種生態(tài)異?，F(xiàn)象, 嚴(yán)重人類的生存與健康[1]。近年來(lái), 有害藻華呈全球擴(kuò)展態(tài)勢(shì), 表現(xiàn)出暴發(fā)頻率上升、持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)、暴發(fā)規(guī)模擴(kuò)大、致災(zāi)效應(yīng)加重的趨勢(shì)[2], 已遍及中國(guó)所有沿海省市。目前, 中國(guó)已成為全球受藻華災(zāi)害影響最嚴(yán)重的國(guó)家之一[3]。

中國(guó)對(duì)有害藻華的研究起步較晚, 但目前在藻華生物及種群生態(tài)動(dòng)力學(xué)、藻華生消動(dòng)態(tài)過(guò)程和機(jī)制、藻毒素及生態(tài)毒理學(xué)、藻華防治機(jī)理等方面均取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展, 尤其是在藻華應(yīng)急處置方面的研究成果已經(jīng)在國(guó)內(nèi)外上產(chǎn)生了重要影響, 在該研究領(lǐng)域起到了示范與引領(lǐng)作用[2]。

從原理上講, 治理有害藻華的方法可分為化學(xué)方法、物理方法、生物方法和礦物絮凝法等幾大類[4]。其中, 由中國(guó)科學(xué)家研發(fā)的改性黏土方法具有環(huán)境友好、去除效率高等優(yōu)點(diǎn), 是中國(guó)有害藻華應(yīng)急處置的標(biāo)準(zhǔn)性方法, 并在國(guó)際上得到推廣應(yīng)用[5]。近年來(lái), 隨著對(duì)生物間相互作用的研究不斷深入, 利用微生物控制有害藻華為藻華治理提供了新的思路。利用生物學(xué)方法治理有害藻華, 主要基于生態(tài)調(diào)控的原理, 通過(guò)生物間的相互作用, 抑制藻華生物的生長(zhǎng)[6-8]。該方法應(yīng)急處置的作用弱、生態(tài)調(diào)控的特點(diǎn)強(qiáng), 常常用來(lái)作為預(yù)防有害藻華發(fā)生的重要手段[9-12]。

傳統(tǒng)生物法主要包括: 利用濾食性生物捕食(如魚(yú)類、貝類等)原理來(lái)控制藻華生物的數(shù)量; 利用一些水生植物(如挺水植物、大型藻類等)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)來(lái)控制藻華生物的生長(zhǎng); 利用微生物與藻細(xì)胞的相互作用來(lái)抑制藻華生物的增殖等[13-16]。隨著當(dāng)今微生物技術(shù)在環(huán)保領(lǐng)域的蓬勃發(fā)展, 微生物方法在有害藻華治理領(lǐng)域中的研究越來(lái)越多[17-20], 既可處置有害藻華、又可修復(fù)水體, 成為一種頗具應(yīng)用前景的綜合治理方法[21-23]。為此, 本文系統(tǒng)回顧了微生物治理有害藻華的原理、方法和相關(guān)研究進(jìn)展, 綜述其存在問(wèn)題與應(yīng)用前景, 探討其進(jìn)一步的發(fā)展趨勢(shì), 為有害藻華的綜合防控提供參考。

1 微生物治理有害藻華的主要作用原理

微生物是指?jìng)€(gè)體無(wú)法用肉眼觀察的微小生物, 包括細(xì)菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、顯微藻類等在內(nèi)的一大類生物群體[24-25]。水體中的微生物與藻細(xì)胞之間存在著密切而復(fù)雜的關(guān)系, 國(guó)外很早就開(kāi)展了對(duì)抑藻微生物的研究。早在1924年, Lothar等[26]就發(fā)現(xiàn)了一種黏細(xì)菌(), 可以黏附在剛毛藻上并使其死亡。隨著研究的不斷深入, 越來(lái)越多的抑藻微生物從藻際環(huán)境中被分離出來(lái), 并應(yīng)用于實(shí)際研究工作中。目前所發(fā)現(xiàn)的抑藻微生物主要包括真菌、原生動(dòng)物、細(xì)菌、放線菌和病毒等, 它們通過(guò)直接或間接的方式破壞藻類的正常生理功能, 從而達(dá)到抑制其生長(zhǎng)或致死的效果。

1.1 直接抑藻作用

直接抑藻分為兩種方式, 其一是微生物通過(guò)侵入藻細(xì)胞、攝食或寄生等方式導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡, 如原生動(dòng)物、病毒和部分真菌; 其二是接觸抑藻, 即微生物接觸藻細(xì)胞后附著在藻細(xì)胞表面, 分泌特定的酶類物質(zhì)殺死藻細(xì)胞, 常見(jiàn)于細(xì)菌[27]。

原生動(dòng)物作為水生生態(tài)系統(tǒng)中微食物環(huán)的重要組分, 主要通過(guò)攝食作用控制浮游植物群落的結(jié)構(gòu)。原生動(dòng)物攝食藻類往往具有一定的偏好性, 比如鞭毛蟲(chóng)多攝食單細(xì)胞藻[28], 而變形蟲(chóng)和纖毛蟲(chóng)多攝食絲狀藍(lán)藻[29]。具有食藻功能的原生動(dòng)物可以有效提高浮游植物群落的生物多樣性和物種豐富度, 從而影響藻華的消長(zhǎng)。

藻類病毒分為原核藻類病毒(即噬藻體)和真核藻類病毒。具有抑藻功能的病毒最早在藍(lán)藻內(nèi)被發(fā)現(xiàn), 由于其與噬菌體非常相似而被稱為噬藻體[30]。噬藻體廣泛存在于海水和淡水水體中, 主要通過(guò)溶原性循環(huán)和裂解方式攻擊藻類細(xì)胞。在溶原性循環(huán)過(guò)程中, 病毒將核酸整合到宿主基因組內(nèi), 進(jìn)行基因水平的轉(zhuǎn)移。該過(guò)程不會(huì)損害藻細(xì)胞, 但經(jīng)環(huán)境因素誘發(fā), 病毒會(huì)大量繁殖并破壞宿主細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu), 造成細(xì)胞的裂解[31]。有研究表明, 光照、宿主生長(zhǎng)狀態(tài)[32]和磷酸鹽濃度[33]等因素都會(huì)影響噬藻體的增殖、裂解和釋放。國(guó)內(nèi)藻類病毒的研究還處在初級(jí)階段, 目前大約有來(lái)自真核藻類12個(gè)綱的50個(gè)種的真核藻類病毒被發(fā)現(xiàn)[34], 但大部分真核藻類無(wú)法在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng), 為真核藻類病毒的分離工作增加了難度。目前對(duì)硅藻的病毒的研究較為深入, 自2004年Nagasaki等[35]首次發(fā)現(xiàn)并分離了剛毛根管藻的RNA病毒以來(lái), 已有15種硅藻病毒陸續(xù)被分離[36-37]。此外, 小球藻()[38]和海洋球石藻()[39]病毒也有相關(guān)報(bào)道。

有關(guān)真菌抑制藻華的研究相對(duì)較少。20世紀(jì)中期, Canter等[40]首次發(fā)現(xiàn)了壺菌目真菌對(duì)顫藻的寄生作用。目前研究發(fā)現(xiàn)真菌寄生的藻類宿主以水綿屬居多, 常見(jiàn)的寄生真菌有噬藻絲水霉、星狀水霉、細(xì)長(zhǎng)腐霉等[41]。但寄生真菌對(duì)宿主具有專一性, 且其規(guī)模化培養(yǎng)存在困難, 降低了使用真菌治理藻華的可行性[42]。

直接抑藻的細(xì)菌主要包括黏細(xì)菌屬、假交替單胞菌屬[43]、腐螺旋菌屬、海桿菌屬等[44]。1970年, Shilo在電子顯微鏡下觀察到黏細(xì)菌攻擊宿主細(xì)胞時(shí)緊緊與細(xì)胞連接, 并在20 min后溶解了宿主細(xì)胞, 還發(fā)現(xiàn)在固體的瓊脂培養(yǎng)基上的抑藻過(guò)程比在液體培養(yǎng)基中更快, 且如果液體培養(yǎng)瓶被搖動(dòng), 抑藻現(xiàn)象不再發(fā)生。推測(cè)細(xì)菌與宿主必須直接接觸才能發(fā)揮作用。將細(xì)菌的過(guò)濾液與培養(yǎng)液混合來(lái)培養(yǎng)藻細(xì)胞時(shí), 未見(jiàn)抑藻效應(yīng), 證明黏細(xì)菌不是通過(guò)分泌抑藻物質(zhì)而是通過(guò)與宿主直接接觸的方式來(lái)發(fā)揮作用[45]。隨著研究的不斷深入, 更多研究人員對(duì)直接抑藻細(xì)菌的特性作了詳細(xì)的觀察與歸納。這類菌通常具有可使細(xì)菌快速靠近藻細(xì)胞的特殊結(jié)構(gòu), 如黃桿菌()能夠依靠鞭毛附著在硅藻細(xì)胞表面并抑制藻細(xì)胞分裂[34], 腐螺旋菌屬可依靠纖毛的擺動(dòng)向藻體靠近[46]從而有效抑藻。這些細(xì)菌靠近藻細(xì)胞后, 大多都是通過(guò)分泌溶解纖維素的酶使藻細(xì)胞裂解死亡, 但也偶有細(xì)菌通過(guò)胞外橋狀復(fù)合體進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)將其裂解的案例[47]。

由此可見(jiàn), 直接抑藻作用主要基于微生物與藻細(xì)胞的直接接觸[48]。除此之外, 研究表明微生物不但可以通過(guò)直接接觸抑藻, 還可以通過(guò)間接作用影響藻細(xì)胞的生長(zhǎng)與繁殖。

1.2 間接抑藻作用

微生物通過(guò)分泌胞外活性物質(zhì)、與藻類競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等方式抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的作用稱為間接抑藻作用。通過(guò)該方式抑藻的微生物主要包括細(xì)菌和真菌。相比較于直接抑藻作用, 分泌胞外物質(zhì)抑藻的文獻(xiàn)報(bào)道較多, 是抑藻微生物的主要作用方式。

真菌主要是通過(guò)分泌抗生素類物質(zhì)發(fā)揮抑藻作用的。20世紀(jì)中期, Safferman等[49]發(fā)現(xiàn)真菌產(chǎn)物對(duì)綠藻或藍(lán)藻具有顯著的去除效果。翅孢殼屬真菌和支頂孢屬真菌可以產(chǎn)生抗生素β-內(nèi)酰胺類抗生素頭孢菌素C, 進(jìn)而降解魚(yú)腥藻()水華[50]。

細(xì)菌是目前研究最為廣泛的一類間接抑藻微生物。通過(guò)分泌胞外物質(zhì)抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)是大多數(shù)抑藻細(xì)菌的作用方式[51-54]。常見(jiàn)的此類抑藻細(xì)菌包括假交替單胞菌[55]、假單胞菌[56]、芽孢桿菌[57]和弧菌[58]等。這些分泌的抑藻活性物質(zhì)主要包括蛋白質(zhì)(如胞外絲氨酸蛋白酶)、抗生素(如吩嗪色素)、環(huán)肽和脂肪酸等。抑藻物質(zhì)的生物毒性與穩(wěn)定性一直受到廣泛關(guān)注。例如, 有研究人員將假交替單胞菌同綠胞藻目的與黃尾魚(yú)一起培養(yǎng), 藻細(xì)胞失去活性, 黃尾魚(yú)活力未受影響[59]。此外, 有些抑藻物質(zhì)具有環(huán)境穩(wěn)定性, 可以適應(yīng)復(fù)雜多變的海洋環(huán)境。如芽孢桿菌所分泌的抑藻物質(zhì)對(duì)鏈狀亞歷山大藻()的抑藻活性在高溫、酸、堿、反復(fù)凍融的條件下均保持穩(wěn)定[60]。且除分泌抑藻物質(zhì)外, 細(xì)菌還通過(guò)群體感應(yīng)調(diào)控其抑藻作用。Harvey[61]等發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌可以分泌群體感應(yīng)信號(hào)分子前體, 從而改變菌藻相互作用關(guān)系, 引起浮游植物種群動(dòng)態(tài)變化, 誘導(dǎo)海洋球石藻()死亡。此外, 抑藻細(xì)菌還可與藻類進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng), 從而抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。瞿建宏等人[62]研究了芽孢桿菌和微囊藻在氮限制、磷限制條件下的生長(zhǎng)速率, 發(fā)現(xiàn)氮、磷比例上升時(shí), 藻類對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收率顯著低于抑藻菌, 生長(zhǎng)受到抑制。

當(dāng)前, 有關(guān)細(xì)菌的間接抑藻作用研究較多, 其在控制有害藻華方面也顯現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用潛力, 是目前的研究熱點(diǎn)。

2 主要研究進(jìn)展

隨著研究的深入, 對(duì)微生物治理有害藻華的研究主要包括抑藻微生物的分離鑒定、抑藻方式和抑藻機(jī)理三方面, 其中針對(duì)抑藻細(xì)菌的研究最多。

2.1 抑藻微生物的篩選與鑒定

分離抑藻微生物的一般方法是先從環(huán)境中取得含有微生物的樣品, 將樣品涂布平板, 劃線分離獲得純培養(yǎng)菌株, 然后通過(guò)抑藻實(shí)驗(yàn)再進(jìn)行有針對(duì)性的篩選。純化后的微生物可以通過(guò)定量PCR、PCR-DGGE、FISH等技術(shù)進(jìn)行鑒定; 抑藻測(cè)試可以通過(guò)抑藻固體實(shí)驗(yàn)(檢測(cè)抑藻斑大小)、液體抑藻實(shí)驗(yàn)(藻細(xì)胞計(jì)數(shù)、葉綠素含量等生理指標(biāo)變化)等方法進(jìn)行。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)抑藻微生物分離、篩選的研究很多, 他們多從藻華衰亡期的水體[64]、養(yǎng)殖池[65]中分離得到具有抑藻作用的微生物。

2.2 抑藻作用機(jī)制研究

目前, 國(guó)內(nèi)外大部分的科學(xué)研究還是聚焦于抑藻微生物的作用機(jī)制方面, 包括對(duì)目標(biāo)藻細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理過(guò)程和遺傳功能的作用機(jī)制等。

2.2.1 對(duì)藻細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞作用

細(xì)胞的完整性是細(xì)胞正常生存的基礎(chǔ), 對(duì)于維持細(xì)胞自身正常的生理活動(dòng), 保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用。微生物對(duì)藻細(xì)胞最直觀的抑藻作用體現(xiàn)在對(duì)藻細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)及亞顯微結(jié)構(gòu)的破壞, 包括細(xì)胞膜、細(xì)胞核及葉綠體和線粒體等細(xì)胞器的形態(tài)變化。李祎等[66]發(fā)現(xiàn)一株對(duì)假微型海鏈藻()有趨化作用的細(xì)菌(LY03), 該細(xì)菌可以通過(guò)鞭毛將自身固定到藻細(xì)胞上, 與此同時(shí)釋放幾丁質(zhì)酶降解其細(xì)胞壁, 使藻細(xì)胞裂解死亡。

Shi等[67]向水華束絲藻()中接種蠟狀芽孢桿菌DC22后, 在光鏡下進(jìn)行連續(xù)觀察。發(fā)現(xiàn)水華束絲藻的裂解始于細(xì)胞壁, 細(xì)胞壁完全裂解后, 水華束絲藻中的包裹體消失, 細(xì)胞死亡。從圖1a可以看出, 水華束絲藻的細(xì)胞保持完整。然而, 約30 s后, A1和A2細(xì)胞包涵體消失, 后整個(gè)細(xì)胞裂解(圖1b)。又過(guò)30 s后, A3細(xì)胞的細(xì)胞壁破裂, 藍(lán)藻內(nèi)部部分消失(圖1c)。在接下來(lái)的一分鐘, 整個(gè)細(xì)胞完全爆裂(圖1d)。

2.2.2 對(duì)藻細(xì)胞生理生化功能的影響機(jī)制

抑藻微生物對(duì)藻細(xì)胞生理生化過(guò)程的影響主要體現(xiàn)為對(duì)其抗氧化系統(tǒng)與光合系統(tǒng)的破壞。

抑藻微生物分泌的活性物質(zhì)進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)部后, 會(huì)對(duì)細(xì)胞器產(chǎn)生刺激, 導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)升高。研究表明ROS可能是一種可以導(dǎo)致藻細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素, 不利因素脅迫藻細(xì)胞時(shí), 藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量ROS, 致使細(xì)胞色素c釋放, 線粒體膜電位降低, 進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能紊亂, Caspase蛋白酶活性升高, 進(jìn)而造成藻細(xì)胞凋亡[68]。研究人員在利用sp.KA22的濾液處理銅綠微囊藻()時(shí)發(fā)現(xiàn), 藻細(xì)胞的ROS水平顯著增加, 丙二醛(MDA)含量也呈上升趨勢(shì)。這種變化反映出細(xì)胞內(nèi)部的氧化系統(tǒng)功能發(fā)生劇烈的波動(dòng), 引起脂質(zhì)過(guò)氧化, 破壞膜系統(tǒng)和光合系統(tǒng)功能, 從而降低藻密度[69]。

圖1 水華束絲藻裂解過(guò)程的光鏡觀察[67]

注: Ba表示蠟狀芽孢桿菌DC22, A1、A2、A3表示藻細(xì)胞

抑藻微生物也會(huì)影響藻細(xì)胞的光合系統(tǒng), 導(dǎo)致細(xì)胞光合能力的改變, 造成藻細(xì)胞葉綠素含量、類胡蘿卜素、藻膽素等含量的降低。藻細(xì)胞的光合作用能力通常用最大光量子產(chǎn)量(v/m)來(lái)表征。研究人員利用放線菌BS01產(chǎn)生的濾液處理塔瑪亞歷山大藻()時(shí)發(fā)現(xiàn)v/m劇烈降低, 光合能力受到了顯著影響[70]。進(jìn)一步研究表明, 抑藻微生物主要是通過(guò)抑制電子在光合系統(tǒng)PSII上的傳遞, 進(jìn)而影響藻細(xì)胞的光合作用。例如,sp.JS01通過(guò)釋放靈菌紅素抑制藻細(xì)胞光合系統(tǒng)PSII活性, 造成了細(xì)胞功能障礙, 進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的損傷, 使藻細(xì)胞死亡[71]。

2.2.3 對(duì)藻細(xì)胞遺傳表達(dá)的影響研究

已有多篇研究表明抑藻微生物不但能損害藻細(xì)胞的功能, 還可以破壞其遺傳表達(dá), 使藻細(xì)胞功能基因的表達(dá)受到不同程度的影響。Wu等[72]發(fā)現(xiàn)在解淀粉芽孢桿菌()分泌的桿菌溶菌素bacilysin作用下, 銅綠微囊藻細(xì)胞中細(xì)胞分裂相關(guān)基因, 光合作用相關(guān)基因和細(xì)胞壁合成相關(guān)基因的表達(dá)均顯著下調(diào)。銅綠微囊藻的細(xì)胞壁和質(zhì)膜被破壞, 導(dǎo)致細(xì)胞通透性增加, 細(xì)胞內(nèi)成分外流, 氧化系統(tǒng)與光合系統(tǒng)無(wú)法發(fā)揮正常的生理功能, 使藻密度下降。陰盼晴[71]發(fā)現(xiàn)錐狀斯式藻細(xì)胞在嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(JX14)所分泌的抑藻化合物作用下, ATP合成酶轉(zhuǎn)子亞基α的基因上調(diào), 而ATP合成所需原料ADP的合成基因卻下調(diào), 高耗能與低原料來(lái)源相矛盾, 從而抑制了ATP合成, 導(dǎo)致藻細(xì)胞光合磷酸化電子傳遞過(guò)程受抑制, 使得藻細(xì)胞調(diào)節(jié)紊亂直至死亡。在藻細(xì)胞蛋白輸出過(guò)程中, 信號(hào)肽受體蛋白下游基因和能夠識(shí)別折疊錯(cuò)誤的肽鏈并將其泛素化降解的基因下調(diào), 使得蛋白輸出受阻, 從而藻使得蛋白輸出功能相關(guān)的生理活動(dòng)都受到抑制, 最終導(dǎo)致藻的生長(zhǎng)受到抑制。

除此之外, 抑藻微生物還會(huì)影響藻細(xì)胞的細(xì)胞周期。有學(xué)者研究了希瓦氏菌(spIRI-160)所分泌的親水性熱穩(wěn)定分子對(duì)微型原甲藻()、劇毒卡爾藻()和條紋環(huán)溝藻()等3種藻華生物細(xì)胞周期的影響, 結(jié)果表明該抑藻物質(zhì)可以使細(xì)胞周期停滯在S期到G2/M期的過(guò)程, 使藻細(xì)胞DNA降解、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外ROS濃度顯著上升, 造成藻類的程序性死亡[74]。

上述研究揭示了微生物能夠抑制藻類生長(zhǎng)和繁殖的主要方式和作用機(jī)制, 為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)生物抑藻制劑, 應(yīng)用于藻華防控奠定了重要基礎(chǔ)。

2.3 抑藻微生物在藻華防控中的應(yīng)用

隨著對(duì)抑藻微生物研究的不斷深入, 抑藻微生物在藻華防控中得到了一些應(yīng)用。

2.3.1 具有抑藻作用的微生物制劑

目前, 已有多種抑藻微生物被制備為微生物制劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖, 不僅具有一定的抑藻功能, 還可以調(diào)控水質(zhì)(如降低氨氮、COD等)。從物態(tài)、制備技術(shù)上講, 微生物制劑主要分為液態(tài)菌劑和固態(tài)菌劑。液體發(fā)酵是以液體為介質(zhì)的一種發(fā)酵方式, 首先將菌株接種到生物反應(yīng)器中, 而后進(jìn)行深層液態(tài)培養(yǎng)、過(guò)濾、濃縮, 實(shí)現(xiàn)菌種擴(kuò)增的效果[75-76]。固體菌劑為單種或多種菌株經(jīng)規(guī)模發(fā)酵后, 輔以一定載體(如低聚木糖、碳酸氫鈉、海藻糖等)做保護(hù)劑, 冷凍干燥后所制成的粉狀菌劑。固態(tài)菌劑使用前多需要進(jìn)行活化, 以使抑藻微生物恢復(fù)活性。

根據(jù)菌劑組成, 微生物制劑可分為單一型菌劑和復(fù)合型菌劑。

2.3.1.1 單一型菌劑

被選用于微生物制劑的抑藻微生物通常需要具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性與調(diào)節(jié)水質(zhì)的功能。實(shí)際應(yīng)用于藻華防控的單一型菌劑主要包括光合細(xì)菌、芽孢桿菌等。

光合細(xì)菌在厭氧和好氧條件下均可生長(zhǎng), 可以利用光能與水體中的有機(jī)質(zhì)進(jìn)行繁殖代謝, 能夠有效降低水體的化學(xué)需氧量、生物需氧量, 減少硫化氫與氨氮含量, 從而改善水質(zhì)[77], 常用于凈化養(yǎng)殖廢水等污染水體。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 光合細(xì)菌治理藍(lán)藻水華的能力得到了人們的關(guān)注, 由其制備的微生物菌劑也在藍(lán)藻水華治理中得到了實(shí)際運(yùn)用[78]。據(jù)報(bào)道, 實(shí)驗(yàn)室條件下光合細(xì)菌的濃度達(dá)到106CFU/mL以上時(shí)才對(duì)藍(lán)藻展現(xiàn)抑制效果; 自然水體中, 其使用濃度遠(yuǎn)低于這一水平, 約為103CFU/mL。研究表明, 光合細(xì)菌與自然富營(yíng)養(yǎng)化水體中的假單胞菌()之間存在耦聯(lián)作用, 二者共同作用抑制了魚(yú)腥藻的生長(zhǎng)[79]。目前光合細(xì)菌等微生物制劑多采用液體發(fā)酵工藝, 與固態(tài)菌劑相比, 液態(tài)菌劑的菌體、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物懸浮在液體中, 易于擴(kuò)散; 發(fā)酵速度相對(duì)較快, 且產(chǎn)量較高, 適宜規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)[80]。

芽孢桿菌作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的益生菌, 可以拮抗多種細(xì)菌和真菌, 有效防治水產(chǎn)動(dòng)物病害, 提高養(yǎng)殖生物成活率[81]。同時(shí), 芽孢桿菌在水華藍(lán)藻治理上展現(xiàn)了巨大潛力。Kim等[82]用的短芽孢桿菌(YS-3)濾液(濕重濃度為10 μg/mL)處理亞歷山大藻()9 h后, 對(duì)藻細(xì)胞的去除率可達(dá)90%。芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抗逆性, 在缺氧或無(wú)氧的條件下仍可存活, 多以固體菌劑形式應(yīng)用, 具有調(diào)節(jié)養(yǎng)殖生物體內(nèi)微生物平衡、改良養(yǎng)殖環(huán)境的作用[83]。

2.3.1.2 復(fù)合型菌劑

部分藻華由多種藻華生物共同引發(fā), 此時(shí)單一種類的抑藻微生物能力有限, 難以有效控制有害藻華, 制備復(fù)合抑藻菌劑可以有效解決這個(gè)難題[84]。

廖春麗等[85]分析了不同比例和配方的復(fù)合菌劑對(duì)小球藻()、柵藻()、惠氏微囊藻()、銅綠微囊藻的抑藻效果, 篩選高效復(fù)合抑藻菌群。結(jié)果表明, 不同比例的混合菌劑對(duì)不同藻類的抑藻效果各不相同, 但復(fù)合菌劑效果優(yōu)于單一菌劑。因此, 根據(jù)不同的藻華生物篩選并制備具有針對(duì)性的復(fù)合菌劑是利用微生物治理有害藻華的一個(gè)發(fā)展方向。

EM菌(effective microorganisms)是以光合細(xì)菌、酵母菌、乳酸菌等為主要類群的微生物復(fù)合而成的一種微生物制劑, 兼有厭氧性與好氧性。1982年, 由日本琉球大學(xué)的比嘉照夫教授研制出EM菌, 并于80年代投入市場(chǎng), 目前多用于富營(yíng)養(yǎng)化水體治理[86]。經(jīng)EM菌劑處理后水體的COD、亞硝酸鹽、硫化氫均低于空白對(duì)照組[87]。吳珊[88]發(fā)現(xiàn)EM菌對(duì)顫藻有著顯著的抑制作用, 且隨著EM菌添加量的增加, 抑制作用上升。當(dāng)前市面上常見(jiàn)的EM菌制劑固態(tài)液態(tài)兼而有之, 在調(diào)控微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)、提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力、增重增產(chǎn)等方面有著顯著的效果, 但其基礎(chǔ)理論研究還比較薄弱, 且生產(chǎn)技術(shù)及應(yīng)用過(guò)程等還存在著不足[89]。

2.3.2 微生物與其他物質(zhì)復(fù)配控制藻華

微生物除單獨(dú)發(fā)揮作用外, 還可以與其他物質(zhì)進(jìn)行復(fù)配, 發(fā)揮協(xié)同抑藻作用。目前常用的復(fù)配方式主要包括將抑藻物質(zhì)與抑藻細(xì)菌復(fù)配, 或?qū)⑵渑c載體結(jié)合, 進(jìn)行固定化。

郭惠娟[90]利用雙十二烷基γ–雙季銨鹽(DBAS)和抑藻細(xì)菌進(jìn)行協(xié)同控藻特性研究, 考察了投加DBAS、G6菌產(chǎn)生的協(xié)同控藻效果和DBAS對(duì)G6菌抑藻活性的影響。結(jié)果表明, G6菌與DBAS可協(xié)同除藻, 破壞藻細(xì)胞壁完整性并使藻細(xì)胞死亡、沉淀。

在抑藻細(xì)菌的固定化研究中, 要求載體性質(zhì)穩(wěn)定、廉價(jià)高效, 且對(duì)微生物無(wú)損傷。目前常用載體包括殼聚糖、海藻酸鈉等[91]。此外, 固定化過(guò)程中添加一些材料還可以增強(qiáng)固定化的抑藻菌的活性。如麥麩, 不但可以為所培養(yǎng)的微生物提供營(yíng)養(yǎng)成分, 而且網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使其具有較大的比表面積, 提高微生物的附著率[92]。

王艷等[93]研究了2種改性粘土與抑藻菌聯(lián)合使用消殺錐狀斯氏藻, 改性粘土耦合抑藻菌使用后, 抑藻效果顯著提升, 藻類空泡化乃至裂解。唐晨等[94]將放線菌與高嶺土結(jié)合, 經(jīng)過(guò)殼聚糖改性處理后制備出一種抑藻粉劑, 該粉劑質(zhì)量投加比為1∶20 000時(shí), 作用30 min對(duì)藻細(xì)胞的去除率可達(dá)90%, 且連續(xù)觀察10 d后銅綠微囊藻未出現(xiàn)二次暴發(fā)。

孫朋飛[80]以海藻酸鈉為固定材料, 將銅綠假單胞菌ZJU1 (ZJUl)與高嶺土、氯化鈣、硫酸鋁鉀等試劑按比例復(fù)配, 得到復(fù)合微生物絮凝劑。0.275 g/L的添加量即可對(duì)銅綠微囊藻()達(dá)到100%的絮凝率。一般認(rèn)為, 胞外活性物質(zhì)中的蛋白組分可以促進(jìn)細(xì)菌聚集, 使其進(jìn)入絮凝體; 多糖組分則是絮凝活性的主要貢獻(xiàn)者。細(xì)菌ZJU1的胞外活性物質(zhì)中, 多糖與蛋白總量之和高達(dá)88%, 大大提升了絮凝效率。且其原材料具有環(huán)境友好性, 為利用抑藻細(xì)菌制備微生物絮凝劑提供了參考。

雖然目前的協(xié)同復(fù)配實(shí)驗(yàn)均處于室內(nèi)實(shí)驗(yàn)階段, 但目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可證明抑藻菌株與其他物質(zhì)復(fù)配后制備的控藻劑, 具有快速且長(zhǎng)效的抑藻效果, 有一定的應(yīng)用前景。

2.3.3 原位生物膜控藻

生物膜技術(shù)是指在水體中投放填料, 為微生物、浮游動(dòng)物提供生長(zhǎng)聚集的載體, 使其富集在填料表面并形成一層膜。但目前生物膜多應(yīng)用于污水治理, 在藻華治理上的應(yīng)用寥寥無(wú)幾。該生物膜可以產(chǎn)生天然化感物質(zhì), 從而抑制藻類生長(zhǎng)。有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)生物膜所分泌的化感物質(zhì)3-氧化-α-紫羅蘭酮和吲哚可以破壞藻細(xì)胞的類囊體膜, 阻斷光合系統(tǒng)Ⅱ中的電子傳遞, 影響光合作用, 進(jìn)而抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)[95]。肖紹祥等[96]針對(duì)北京動(dòng)物園內(nèi)的藻華水體, 設(shè)計(jì)了人造生物膜進(jìn)行治理, 提高了水體的透明度, 治理速度較快, 有效控制了藻華。He等[97]利用椰子纖維作為填料, 在藻華水體中富集了多種殺藻菌, 對(duì)水體中藻華生物的去除率和葉綠素降解率達(dá)到87.69%, 為藻華水體的原位生物修復(fù)提供了新的見(jiàn)解。

3 主要問(wèn)題

總體而言, 中國(guó)微生物治理有害藻華的研究起步較晚, 經(jīng)歷了幾十年的發(fā)展之后, 在機(jī)制研究、實(shí)際應(yīng)用方面均進(jìn)展明顯, 具有防控藻華功能的微生物制劑也在水產(chǎn)養(yǎng)殖中得到了廣泛應(yīng)用, 但目前仍然存在很多問(wèn)題, 主要如下。

3.1 抑藻機(jī)制研究還有待于進(jìn)一步深入

目前對(duì)市面上微生態(tài)制劑的研究主要集中于抑藻現(xiàn)象的描述及抑藻微生物的分離鑒定等。鑒于目前分析技術(shù)和成本等因素的限制, 對(duì)抑藻物質(zhì)的分離、鑒定方面的研究仍顯不足, 由此也限制了微生物對(duì)藻細(xì)胞化感作用研究的深入。其次, 抑藻作用是多因素的綜合結(jié)果, 機(jī)制復(fù)雜, 導(dǎo)致目前微生物的抑藻研究主要停留在結(jié)果的描述, 缺乏過(guò)程的剖析、關(guān)鍵因素的解析, 理論研究對(duì)實(shí)際應(yīng)用的指導(dǎo)作用不足。

3.2 實(shí)驗(yàn)室成果有待于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)踐

目前有關(guān)抑藻微生物的研究有很多, 大都停留在實(shí)驗(yàn)室階段。特別是通過(guò)攝食、寄生、侵入等直接接觸藻細(xì)胞來(lái)治理有害藻華的抑藻方法, 在實(shí)際應(yīng)用的報(bào)道寥寥無(wú)幾。目前能夠現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用大都是基于間接抑藻作用的微生物方法, 但也存在很多技術(shù)難題。例如, 很多實(shí)驗(yàn)室分離得到的抑藻細(xì)菌, 特別是那些具有特異性抑藻作用的菌類, 由于自然水體中土著微生物的競(jìng)爭(zhēng)和復(fù)雜多變的物理化學(xué)條件等因素的影響, 難以發(fā)揮最大的抑藻效果。另外, 利用微生物抑藻的周期較長(zhǎng), 無(wú)法作為藻華大規(guī)模暴發(fā)時(shí)的應(yīng)急處理措施。所以目前該方面應(yīng)用也主要局限于小規(guī)模、封閉性的水環(huán)境調(diào)控, 間接對(duì)藻華起到防控作用。

3.3 缺乏生態(tài)安全評(píng)估, 市場(chǎng)產(chǎn)品良莠不齊

目前有關(guān)微生物治理有害藻華研究主要聚焦于其抑藻效果, 缺乏這些微生物的引入對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和生態(tài)安全的評(píng)估研究。例如, 一些抑藻細(xì)菌為條件致病菌, 其本身產(chǎn)生的細(xì)菌毒素也會(huì)使得水體中毒素含量急劇升高, 對(duì)人類和水生動(dòng)植物造成危害。此外, 還有部分抑藻細(xì)菌需采用有機(jī)培養(yǎng)基分離和培養(yǎng), 實(shí)際應(yīng)用時(shí)還會(huì)額外增加水體的營(yíng)養(yǎng)負(fù)荷。除此之外, 市面上部分成品菌劑雖具有抑藻效果, 但質(zhì)量良莠不齊, 缺乏質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn), 為現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用帶來(lái)很多安全隱患。

4 結(jié)論

綜上所述, 微生物治理有害藻華是一種具有發(fā)展前景的方法。針對(duì)目前存在的問(wèn)題開(kāi)展更加深入的研究、技術(shù)研發(fā)和應(yīng)用實(shí)踐, 相信未來(lái)該方法會(huì)在有害藻華治理領(lǐng)域中發(fā)揮更大的作用。

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Advances in marine algicidal microorganism research

LIU Shan-shan1, 2, 3, 4, YU Zhi-ming1, 2, 3, 4, CAO Xi-hua1, 2, 4, SONG Xiu-xian1, 2, 3, 4

(1. CAS Key Laboratory of Marine Ecology and Environmental Sciences, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory of Marine Ecology and Environmental Science, Laoshan Laboratory, Qingdao 266237, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 4. Center for Ocean Mega-Science, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Recently, the range and frequency of harmful algal blooms (HABs) have considerably increased, causing various environmental issues and economic losses. Algicidal microorganisms can destroy the cell structure, physiological process, and genetic function of algal cells, contributing to the mitigation of HABs. In this paper, the main principles and research progress of controlling HABs using algicidal microorganisms are summarized. Furthermore, the current research situation and challenges facing marine algicidal microorganism research are reviewed and discussed, providing a reference for the application of algicidal microorganisms in controlling HABs.

algicidal microorganisms; mitigation of harmful algal blooms; research progress

Aug. 14, 2020

X52; X17

A

1000-3096(2023)6-0096-12

10.11759/hykx20200814001

2020-08-14;

2020-12-04

山東省重大科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目“赤潮治理新型功能材料的研發(fā)與示范應(yīng)用”(2019JZZ010808); 山東省支持青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室重大科技專項(xiàng)(2018SDKJ0504-2); “泰山學(xué)者攀登計(jì)劃”項(xiàng)目

[The Key R&D Project of Shandong Province, No. 2019JZZ010808; Financially Supported by the Marine S&T Fund of Shandong Province for Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology(Qingdao), No. 2018SDKJ0504-2; The Taishan Scholars Climbing Program of Shandong Province]

劉姍姍(1997—), 女, 山東德州人, 博士研究生, 主要從事有害藻華生物防控研究, E-mail: liushanshan181@mails.ucas.ac.cn; 俞志明(1959—),通信作者, 研究員, 主要從事有害藻華防控和近海富營(yíng)養(yǎng)化研究, E-mail: zyu@qdio.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)