苦膽草多糖活性炭脫色工藝研究

黃麗金 陳貴元，2*

（1大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000）

苦膽草（Andrographis paniculata）又稱印度草、穿心蓮、苦草、春蓮、秋蓮。穿心蓮因其食入一小片葉子，就可以感受到那直擊心靈的苦，故稱為“穿心蓮”[1]。該植物廣泛分布于我國(guó)福建、廣東等南方地區(qū)，有著“大南藥”之稱[2]。在民間這種植物可直接作為藥材使用，治療感染性疾病和解蛇毒?？嗄懖葜泻卸喾N活性成分：多酚、蛋白質(zhì)、內(nèi)脂、多糖、黃酮等[3]，其中苦膽草內(nèi)脂有著多種藥理作用，如抗血栓、鎮(zhèn)痛、清熱解毒、抗高血糖、抗癌、保護(hù)肝臟等活性[4]。在研究?jī)?nèi)脂抗癌機(jī)制中，屬結(jié)直腸癌和乳腺癌研究最多[5]。

多糖具有抗血糖[6]、降血脂[7]、抗癌[8]、抗氧化[9]多種活性，徐兵[10]研究發(fā)現(xiàn)苦膽草多糖可以抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞增殖活性、遷移侵襲活性，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。由于提取得到的多糖顏色較深，較難溶于水，且這些色素分子的存在會(huì)影響多糖發(fā)揮作用，這是因?yàn)槲唇?jīng)處理的多糖分子量較大，體積大，且溶解后黏度大，妨礙了多糖通過(guò)機(jī)體屏障進(jìn)入細(xì)胞，使其發(fā)揮不了生物學(xué)作用[11]，因此對(duì)多糖進(jìn)行脫色素非常有必要。研究發(fā)現(xiàn)，多糖脫色素的方法常用的有樹(shù)脂吸附法[12]、活性炭法[13]、雙氧水法[14]等?；钚蕴孔鳛橐环N吸附劑，是一種物理吸附法，其比表面積大、吸附性強(qiáng)、理化性質(zhì)穩(wěn)定、耐酸堿、內(nèi)部空間發(fā)達(dá)[15]等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)使其脫色素迅速又方便?？嗄懖莼钚蕴棵撋珪簾o(wú)相關(guān)研究，故本研究將用活性炭進(jìn)行多糖脫色，從單因素試驗(yàn)方面，考察其脫色率和多糖保留率，選取最優(yōu)試驗(yàn)條件進(jìn)行三因素三水平的Box-Behnken 設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并通過(guò)綜合評(píng)分，響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)出最優(yōu)脫色方案。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

苦膽草購(gòu)于云南省大理市劍川縣農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；活性炭購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站經(jīng)銷；蒽酮、濃硫酸、無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器和設(shè)備

THZ-82恒溫振蕩器（常州智博瑞儀器制造有限公司），DL-8000C低俗冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器公司），722E型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1苦膽草多糖的提取參照李月等[16]的方法。

1.3.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作采用蒽酮濃硫酸法[17]。準(zhǔn)確配制1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，即稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品粉末100 mg 加水定容至100 mL 的容量瓶中，取溶液配制成0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)液帶塞試管，蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，在冰水浴中分別加入4 mL 0.5%的蒽酮濃硫酸試劑，試劑現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存于棕色瓶中。在水浴鍋90 ℃以上中沸騰10 min后，取出迅速冷卻，在常溫放置10 min。在620 nm處進(jìn)行多糖吸光度的測(cè)量。

1.3.3單因素試驗(yàn)取質(zhì)量濃度為0.65 mg/mL的苦膽草多糖，離心取上清。在活性炭用量為0.3 g/30 mL、時(shí)間為40 min、溫度為50 ℃、震蕩頻率為120 r/min的基礎(chǔ)條件下，分別考察活性炭的脫色效果以及多糖保留的情況，每組試驗(yàn)重復(fù)3次及以上。

1.3.4響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在最優(yōu)試驗(yàn)條件下作為中心點(diǎn)設(shè)計(jì)Box-Behnken三因素三水平表（見(jiàn)表1），進(jìn)一步研究活性炭用量（A）、脫色溫度（B）、脫色時(shí)間（C）之間的交互影響。使用Design-Expert 8.0 設(shè)計(jì)軟件優(yōu)化設(shè)計(jì)多糖脫色工藝，以綜合評(píng)分（Y）為響應(yīng)值評(píng)價(jià)多糖的脫色效果以及多糖保留率情況，并計(jì)算出最優(yōu)的試驗(yàn)條件。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.5驗(yàn)證試驗(yàn)根據(jù)響應(yīng)面得出的最優(yōu)脫色工藝組合進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，以綜合評(píng)分為指標(biāo)驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)是否可靠。

1.3.6脫色率、多糖保留率和綜合評(píng)分的測(cè)定和計(jì)算方法

（1）脫色率測(cè)定 將多糖溶液在200～1 200 nm紫外分光度計(jì)下掃描波長(zhǎng)，結(jié)果未得到合適的最大吸收峰，根據(jù)顏色的互補(bǔ)定理[18]，該溶液為深褐色，選取560 nm 的波長(zhǎng)進(jìn)行后續(xù)的多糖脫色效果測(cè)定。按式（1）的計(jì)算方法計(jì)算脫色率：

（2）多糖保留率的測(cè)定 采用蒽酮濃硫酸法，在620 nm 處測(cè)定脫色前后多糖的OD 值，帶入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程計(jì)算出質(zhì)量濃度，按式（2）的計(jì)算方法計(jì)算多糖保留率：

（3）綜合評(píng)分 綜合評(píng)分（Y）= 0.5 ×

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Origin 9.0、Excel 2007、Design-Expert 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，以葡萄糖質(zhì)量濃度（ug/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y= 0.012 9x-0.021 9，R2=0.993 9，表明10～60 ug/mL 范圍內(nèi)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1活性炭用量在基礎(chǔ)條件下，分別考察活性炭用量為0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 g/30 mL 的多糖脫色率與多糖保留率。如圖2 所示，在0.3 g/30 mL 用量之前，隨著活性炭用量的增加，脫色率呈陡峭曲線上升，表明在此范圍內(nèi)，脫色率與活性炭使用量成正比關(guān)系；而在活性炭添加量0.3 g/30 mL 之后，脫色率曲線較之前曲線平緩，表明脫色效果在下降，這可能是隨著活性炭添加量的增加，活性炭逐漸與溶液中的色素分子的結(jié)合，呈飽和狀態(tài)；多糖分子隨著活性炭添加用量的增加不斷減少（圖3），這可能是由于活性炭的吸附為不定向，在吸附色素分子的同時(shí)也吸附了多糖分子。由此表明，活性炭取量在0.3 g/30 mL 時(shí)脫色效果和多糖保留率都處于良好狀態(tài)，故選擇用量0.3 g/30 mL為響應(yīng)面活性炭用量的中心點(diǎn)。

圖2 活性炭用量對(duì)多糖脫色率與多糖保留率的影響

圖3 活性炭用量對(duì)苦膽草多糖綜合評(píng)分的影響

2.2.2脫色時(shí)間在設(shè)置的基礎(chǔ)條件下，分別考察脫色時(shí)間20、30、40、50、70 min 的多糖脫色率與多糖保留率。由圖4、圖5 可知，隨著時(shí)間的增加，脫色率不斷增加，多糖保留率不斷下降。隨著時(shí)間的增加，脫色率上升的并不多，即在68%～76%，這表明活性炭脫色效果與時(shí)間的關(guān)系不是很大，隨著時(shí)間的增加，活性炭所吸附的分子越來(lái)越多，當(dāng)基本填滿作用孔徑時(shí)，每個(gè)活性炭表面都吸附色素分子，空間變得擁擠、堵塞，造成吸附色素分子的能力下降，稱為“堵車”現(xiàn)象。為節(jié)省時(shí)間以及減少多糖分子不必要的損失，故選擇40 min 作為響應(yīng)面脫色時(shí)間的中心點(diǎn)。

圖4 脫色時(shí)間對(duì)多糖脫色率與多糖保留率的影響

圖5 脫色時(shí)間對(duì)苦膽草多糖綜合評(píng)分的影響

2.2.3脫色溫度在基礎(chǔ)條件下，分別考察脫色溫度30～70 ℃條件下的多糖脫色率和多糖保留率。如圖6、圖7所示，隨著脫色溫度的上升，脫色率不斷上升，基本與脫色溫度成正比關(guān)系，在70 ℃時(shí)，曲線變得較平直，這說(shuō)明一定的溫度可以促進(jìn)活性炭的吸附，但是活性炭會(huì)處于空間飽和狀態(tài)，所以過(guò)高的溫度對(duì)多糖脫色效果不明顯，只會(huì)更多地?fù)p耗多糖。從多糖保留率來(lái)看，隨著溫度的上升，多糖保留率不斷下降，由圖6 可知，為更多地保留多糖分子，因其多糖保留率40 ℃后出現(xiàn)驟減，故選擇40 ℃作為響應(yīng)面脫色溫度的中心點(diǎn)。

圖6 脫色溫度對(duì)多糖脫色率與多糖保留率的影響

圖7 脫色溫度對(duì)苦膽草多糖綜合評(píng)分的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果與方差分析表見(jiàn)表2、表3。由表2 數(shù)據(jù)得出二次回歸模型方程，Y=+69.25+3.52A+1.19B+0.44C+0.093AB+0.039AC+0.22BC-1.99A2+0.060B2+0.77C2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

其中Y（綜合評(píng)分），A（活性炭使用量），B（脫色時(shí)間），C（脫色溫度）。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

以綜合評(píng)分為指標(biāo)，并通過(guò)回歸二次方程得出的最佳脫色工藝組合為活性炭用量0.4 g/30 mL、溫度45.23 ℃、時(shí)間49.92 min，綜合評(píng)分預(yù)測(cè)值為72.828 5，保留2位小數(shù)約72.83。

考慮到試驗(yàn)的條件，最終驗(yàn)證試驗(yàn)條件改為用量0.4 g/30 mL，溫度45.20 ℃，時(shí)間50 min。在其他條件不變的情況下，試驗(yàn)重復(fù)3次取均值，在此條件下多糖脫色率為80.49%，多糖保留率65.34%，綜合評(píng)分為72.91，與預(yù)測(cè)值的綜合評(píng)分72.83相差很小，相對(duì)誤差為0.11%。這表明該模型下提供的最優(yōu)工藝參數(shù)具有可靠性，可應(yīng)用到實(shí)際中。

3 結(jié)論

本文以活性炭對(duì)多糖進(jìn)行脫色試驗(yàn)，選取單因素試驗(yàn)結(jié)果最佳試驗(yàn)范圍，后通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以綜合評(píng)分為指標(biāo)篩選出了最優(yōu)脫色工藝條件：活性炭用量0.4 g/30 mL、溫度45.2 ℃、時(shí)間50 min，在此條件下，多糖平均脫色率為80.49%，多糖保留率65.34%，綜合評(píng)分為72.91，接近預(yù)測(cè)值72.83。表明該工藝設(shè)計(jì)的條件以及得出的結(jié)果具有可靠性、精確性，可應(yīng)用到實(shí)際工作中去，避免在實(shí)際工作中造成資源、成本的浪費(fèi)。

活性炭在日常生活中具有脫色、凈化污水、吸附有毒氣體、凈化空氣等諸多作用，在多糖脫色這一塊，相校其他方法如過(guò)氧化氫法、大孔樹(shù)脂吸附法，具有成本低廉、脫色效率高、所耗時(shí)間短以及不改變多糖的性質(zhì)、也不帶進(jìn)別的物質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，非常適合工藝化的生產(chǎn)需求。不過(guò)活性炭也有不足的地方，活性炭的吸附不具有特定性，它沒(méi)有選擇性地吸附所有可吸附的東西，所以在多糖脫色時(shí)也會(huì)造成多糖的損耗，并且它本身是黑色粉末狀，自帶黑色物質(zhì)，在脫色時(shí)，需要不斷離心、過(guò)濾才能清除黑色物質(zhì)，在此過(guò)程中造成時(shí)間成本增加，試驗(yàn)也變得繁瑣，故今后對(duì)活性炭的研究可以關(guān)注如何快速地除去活性炭本身的顏色以及控制活性炭在吸附色素時(shí)不吸附多糖分子。