草莓脫毒苗工廠化優(yōu)化生產(chǎn)方法

伊萬偉 湯生兵

（1. 酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院，甘肅 酒泉 735000；2. 酒泉龍德盛農(nóng)業(yè)科技有限公司，甘肅 酒泉 735000）

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）為薔薇科草莓屬多年生草本植物，適應(yīng)性強，果實柔軟多汁、甜酸適口、營養(yǎng)豐富，具有較高的經(jīng)濟價值。目前草莓苗主要用匍匐莖進行無性繁殖，但多年的無性繁殖會使病毒累積在草莓植株體內(nèi)，導(dǎo)致草莓病毒病頻發(fā)、品種退化嚴(yán)重。利用組織培養(yǎng)技術(shù)培育草莓脫毒苗是恢復(fù)草莓優(yōu)良性狀、防治草莓病毒病、提高草莓產(chǎn)量和品質(zhì)的有效途徑。

草莓脫毒苗的生產(chǎn)成本高，且脫毒技術(shù)復(fù)雜、脫毒周期長，給工廠化生產(chǎn)帶來了難度。簡化、優(yōu)化草莓脫毒苗工廠化生產(chǎn)的環(huán)節(jié)，如直接采用莖尖脫毒培養(yǎng)［1］，同時在增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)階段降低培養(yǎng)基用量，可降低脫毒苗的培養(yǎng)成本，促進草莓脫毒苗的規(guī)?；a(chǎn)。為驗證用莖尖脫毒培養(yǎng)、增殖和生根培養(yǎng)方法培育草莓脫毒苗的效果，我們于2022年4月中旬開展了相關(guān)試驗，現(xiàn)將試驗結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為紅顏草莓苗的匍匐莖莖尖，由酒泉龍德盛農(nóng)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司提供。

1.2 試驗方法

試驗設(shè)在酒泉職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院組培室。

1.2.1 莖尖脫毒培養(yǎng)

4 月是草莓匍匐莖生長旺盛時期，選晴天上午取材。從無病健壯的草莓植株上剪取匍匐莖頂芽嫩梢3～5 cm，用自來水沖洗干凈后，將匍匐莖頂芽嫩梢用70%酒精浸泡30 s，再用2%次氯酸鈉溶液消毒15 min，然后用無菌水沖洗6遍，最后將匍匐莖頂芽嫩梢置于已滅菌的濾紙上，吸干表面水分。在解剖鏡下用解剖針剝?nèi)ツ凵彝鈱佑兹~，用已消毒的解剖刀快速切取3 個不同長度帶1～2 個葉原基生長點的莖尖，莖尖長分別為0.2～0.5 mm、0.5～0.8 mm、0.8～1.0 mm，即3 個處理。將莖尖立即接種到無菌培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L）培養(yǎng)，培養(yǎng)基中添加30 g/L 蔗糖、6.5 g/L 瓊脂粉，將培養(yǎng)基pH 值調(diào)至5.75～5.85 后分裝到培養(yǎng)瓶中，高溫高壓滅菌后待用。每個處理接種10瓶，每瓶接種3個莖尖。接種后將培養(yǎng)瓶放入人工氣候箱，在溫度25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)5 d，然后在溫度25 ℃、光照強度2 000 lx、光照時間10 h/d條件下培養(yǎng)25 d。培養(yǎng)期間觀察草莓苗的生長情況，統(tǒng)計成活率和脫毒率。

脫毒率（%）=脫除病毒的葉片數(shù)/檢測葉片數(shù)×100

1.2.2 增殖培養(yǎng)

以培養(yǎng)基不同用量，即MS、1/2 MS、1/3 MS［2］為3 個處理進行草莓增殖培養(yǎng)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.8 mg/L 6-BA、0.01 mg/L NAA、30 g/L 蔗糖、6.5 g/L 瓊脂粉，將培養(yǎng)基pH 值調(diào)至5.75～5.85 后分裝到培養(yǎng)瓶中，高溫高壓滅菌后待用。將培養(yǎng)瓶放在溫度25 ℃、光照強度2 000 lx、光照時間14 h/d條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)期間觀察草莓芽的增殖情況。

1.2.3 生根培養(yǎng)

以培養(yǎng)基不同用量，即MS、1/2 MS、1/3 MS［2］為3 個處理進行草莓生根培養(yǎng)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L NAA、30 g/L 蔗糖、6.5 g/L 瓊脂粉，將培養(yǎng)基pH 值調(diào)至5.75～5.85 后分裝到培養(yǎng)瓶中，高溫高壓滅菌后待用。培養(yǎng)期間觀察草莓苗的生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖大小對草莓苗成活率、脫毒率的影響

莖尖大小對草莓苗成活率、脫毒率的影響見表1。

表1 莖尖大小對草莓苗成活率、脫毒率的影響

接種不同長度的草莓莖尖均可誘導(dǎo)出苗，但莖尖長度對草莓苗的成活率和脫毒率影響較大，莖尖脫毒培養(yǎng)一般要求莖尖長度小于1.0 mm。由表1 可知，莖尖長度0.8～1.0 mm 處理草莓苗的成活率較高（86.7%）、脫毒率為0，莖尖長度0.5～0.8 mm 處理草莓苗的成活率為66.7%、脫毒率為10.2%，莖尖長度0.2～0.5 mm 處理草莓苗的成活率最低（40.0%）、脫毒率為62.0%。雖然莖尖越短，成活率越低，相對培養(yǎng)脫毒苗較難，但越靠近莖頂端區(qū)域，植物病毒的濃度越小，脫毒率則越高?？梢?，培育草莓脫毒苗應(yīng)選用長度為0.2～0.5 mm 的莖尖較合適。

2.2 培養(yǎng)基不同用量對草莓增殖培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)基不同用量對草莓增殖培養(yǎng)的影響見表2。

由表2 可知，在草莓增殖培養(yǎng)過程中，MS 培養(yǎng)基處理芽苗的增殖倍數(shù)為4.0、芽苗長勢良好，1/2MS 培養(yǎng)基處理芽苗的增殖倍數(shù)為3.8、芽苗長勢良好，1/3MS 培養(yǎng)基處理芽苗的增殖倍數(shù)為2.1；MS 培養(yǎng)基處理和1/2MS 培養(yǎng)基處理芽苗的增殖倍數(shù)、芽苗長勢差異不大，1/3MS 培養(yǎng)基處理芽苗的增殖倍數(shù)和生長情況顯著降低?？梢?，使用1/2MS培養(yǎng)基進行草莓增殖培養(yǎng)，既可保證芽苗多增殖，又可降低生產(chǎn)成本。

2.3 培養(yǎng)基不同用量對草莓生根培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)基不同用量對草莓生根培養(yǎng)的影響見表3。

表3 培養(yǎng)基不同用量對草莓生根培養(yǎng)的影響

把增殖培養(yǎng)的叢生芽切成單株接種到生根培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，20 d后部分小苗基部開始膨大，逐漸出現(xiàn)不定根。由表3 可知，在草莓生根培養(yǎng)過程中，MS 培養(yǎng)基處理芽苗的生根率最高（92.5%）、根系長勢良好，1/2MS 培養(yǎng)基處理芽苗的生根率為90.6%、根系長勢良好，1/3MS 培養(yǎng)基處理芽苗的生根率最低（73.5%）；1/2MS培養(yǎng)基處理芽苗的生根效果與MS培養(yǎng)基處理差異不大，1/3MS培養(yǎng)基處理芽苗的生根率、根系長勢顯著降低。可見，用1/2MS培養(yǎng)基進行草莓生根培養(yǎng)較合適。

3 小結(jié)與討論

活躍生長的莖尖分生組織的代謝水平高能抑制病毒的繁殖，采用莖尖脫毒培養(yǎng)可獲得大量優(yōu)質(zhì)的脫毒苗。莖尖培養(yǎng)是培育草莓脫毒苗的常見方法，其脫毒效率高、速度快，能在較短的時間內(nèi)得到原種繁殖材料，但草莓苗成活率不高。可采用莖尖脫毒培養(yǎng)和熱處理等多種脫毒方法相結(jié)合的方式進行草莓脫毒苗生產(chǎn)。如高遐虹等［3］采用二次莖尖培養(yǎng)的方法培育草莓脫毒苗，趙海紅［4］采用熱處理和二次莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的方法培育草莓脫毒苗。多種脫毒方法相結(jié)合的方式雖然提高了脫毒率，但規(guī)?；a(chǎn)效率并未得到顯著提高，可能是脫毒流程多、操作步驟繁瑣、時間長和操作失誤等原因所致。

在莖尖脫毒培養(yǎng)中，要求莖尖長度小于1.0 mm，靠近頂端的莖尖脫毒率較高，但在實際操作過程中，小的莖尖于接種培養(yǎng)2 周內(nèi)易變?yōu)楹稚菟?，成活率較低。因此莖尖的取材和消毒非常重要。一般選晴天上午取材，利于莖尖的剝離和培養(yǎng)；由于外植體來自于田間，附有大量細(xì)菌，需嚴(yán)選消毒劑種類和濃度、消毒時間，如外植體需用70%酒精液浸泡30 s，再用2%次氯酸鈉溶液消毒15 min，然后用無菌水沖洗6遍。此消毒方法對外植體的消毒效果較好，對莖尖的損傷也較小。

草莓脫毒苗工廠化生產(chǎn)應(yīng)綜合考慮生產(chǎn)效率、脫毒效率和生產(chǎn)成本，以獲得較高的經(jīng)濟效益。試驗結(jié)果表明，采用長度為0.2～0.5 mm 的莖尖、1/2 MS 培養(yǎng)基培育草莓脫毒苗，雖然成活率較低，但脫毒率較高，既可簡化脫毒環(huán)節(jié)、保證芽苗的增殖倍數(shù)、提高生根效果，又可降低生產(chǎn)成本，在保證一定的脫毒率和成活率的同時提高生產(chǎn)效率。