小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員鑒定及初步分析

趙 琪，李松碩，王 嬌，郭 鵬，呂愛枝，周 碩，焦 博*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所/河北省植物轉(zhuǎn)基因中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050051；2.河北北方學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000；3.河北科技大學(xué) 食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018）

0 引言

氮是植物中氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、葉綠素以及激素等生物大分子物質(zhì)的主要組成成分，是植物生長發(fā)育的主要限制因素［1］。施用氮肥是提高農(nóng)作物產(chǎn)量的有效方法，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)主要的成本支出。在我國的實(shí)際農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，長期存在氮肥施用不合理、農(nóng)作物氮肥吸收利用率低等主要問題，這不僅導(dǎo)致了土壤酸化、水體富營養(yǎng)化，且可能造成嚴(yán)重的環(huán)境污染［2］。此外農(nóng)作物種植成本的提高也嚴(yán)重制約了我國農(nóng)業(yè)的發(fā)展。因此，解析植物對(duì)氮的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝過程，培育高氮肥利用率的農(nóng)作物品種，不僅可以降低氮肥施用量，減少環(huán)境污染，還能降低農(nóng)民的生產(chǎn)成本，有力推動(dòng)我國農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［3］。

植物的根主要從土壤的硝酸鹽(NO3-)、銨(NH4+)等無機(jī)氮形態(tài)中吸收氮元素，這2種形式的氮源分別通過相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白實(shí)現(xiàn)其在細(xì)胞和組織器官之間的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和移動(dòng)，其中硝酸鹽是植物在有氧條件下從土壤中獲取氮源的主要形式［3-4］。硝酸鹽通過不同親和力的硝酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(NRTs)進(jìn)入細(xì)胞，然后在細(xì)胞質(zhì)中經(jīng)NADPH-依賴硝酸還原酶(NAR)還原為亞硝酸鹽，在葉綠體和前質(zhì)體中通過鐵氧還蛋白與亞硝酸還原酶(NiR)催化轉(zhuǎn)變?yōu)殇@。土壤中的銨鹽也可以通過銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(AMT)進(jìn)入植物體內(nèi)，后經(jīng)谷氨酰胺合成酶/谷氨酰胺-α-酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GS/GOGAT)催化合成谷氨酰胺或谷氨酸，進(jìn)一步通過不同的氨基轉(zhuǎn)移酶合成其他氨基酸，最后被植物所利用［5］。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AlaAT)又稱谷丙轉(zhuǎn)氨酶，是參與植物氮素同化的關(guān)鍵酶類，該酶在輔酶磷酸吡哆醛(PLP)存在時(shí)催化丙氨酸和α-酮戊二酸反應(yīng)形成丙酮酸和谷氨酸的可逆反應(yīng)。此催化反應(yīng)中的丙酮酸和α-酮戊二酸也是碳代謝中的重要中間產(chǎn)物，谷氨酸參與了氮素同化以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，丙氨酸是缺氧時(shí)氨基酸的主要來源［6］，所以丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶將植物初級(jí)碳代謝與氨基酸合成聯(lián)系在一起，在碳氮代謝中發(fā)揮了不可或缺的作用。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在擬南芥［6］、水稻［7］、玉米［8］、大麥［9］、苜蓿［10］、豆類［11］、辣椒［12］、蓮花［13］、茶葉［14］、楊樹［15］以及小麥［16］等植物中均有一定的研究報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)，低氧、光照、氮肥施用、高溫以及低溫［14］均可影響丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)水平，并且在許多組織和器官中均能檢測到AlaAT的活性，如擬南芥的葉、根、花［17］以及水稻發(fā)育中的種子［7］等。

現(xiàn)有研究報(bào)道的擬南芥中有4個(gè)AlaAT基因，分別為AtAlaAT1和AtAlaAT2、AtGGAT1和AtGGAT2。GGAT為包含編碼過氧化物酶體靶向信號(hào)(PTSs)序列的谷氨酸：乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶［17-18］，其能催化谷氨酸和乙醛酸反應(yīng)生成α-酮戊二酸和甘氨酸，在光呼吸和氨基酸代謝中發(fā)揮重要作用。在缺氧條件下，AtAlaAT1和AtAlaAT2均被誘導(dǎo)表達(dá)。在擬南芥中突變AtAlaAT1證實(shí)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在低氧脅迫恢復(fù)過程中，對(duì)于丙氨酸分解代謝至關(guān)重要［6］。大豆基因組已鑒定出4個(gè)AlaAT基因，GmAlaAT1～GmAlaAT4。在淹水導(dǎo)致的缺氧條件下，GmAlaAT表達(dá)增強(qiáng)，并參與到丙氨酸的分解代謝［11］。過表達(dá)GmAlaAT1可提高大豆中抗氧化保護(hù)酶活性并促進(jìn)根系發(fā)育［19］。同樣，在苜蓿中也發(fā)現(xiàn)了4個(gè)AlaAT基因，它們與幼苗耐缺氧有關(guān)［10］。在水稻中鑒定出5個(gè)AlaAT基因，其中OsAlaAT1在發(fā)育種子中的表達(dá)量高于其他4個(gè)基因的，并且受缺氧誘導(dǎo)表達(dá)最顯著。在木本植物楊樹中確定了4個(gè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶同源基因AlaAT1～AlaAT4，其中AlaAT1和AlaAT2屬于GGAT蛋白基因，主要在葉中表達(dá)，均能被外施N誘導(dǎo)表達(dá)，并且受晝夜變化調(diào)節(jié)，而AlaAT3和AlaAT4屬于AlaAT蛋白基因，在根、莖、葉中均有表達(dá)。研究證明AlaAT3能夠被谷氨酰胺調(diào)控，受外施N的誘導(dǎo)表達(dá)，可能在根氮代謝中發(fā)揮重要作用［15］。

Miyashita等［6］研究表明AlaAT被證實(shí)參與植物中許多生理代謝過程，如氨基酸代謝、光呼吸、糖異生和糖酵解等，其還可作為C和N的反應(yīng)者和生產(chǎn)者參與C4光合作用以及淀粉的合成［20-21］，參與植物應(yīng)對(duì)非生物脅迫以及提高氮素利用率等反應(yīng)過程。在低N條件下，油菜根特異性啟動(dòng)子btg26啟動(dòng)大麥HvAlaAT能夠增加油菜地上部分的生物量和產(chǎn)量［22］，水稻啟幼子OsAnt1啟動(dòng)大麥HvAlaAT可以提高水稻根和苗的生物量［23］并提高氮素利用率［9］。研究發(fā)現(xiàn)，OsAlaAT1可以調(diào)節(jié)水稻種子發(fā)育過程中淀粉的合成，增加籽粒重量。OsAlaAT1基因的缺失會(huì)導(dǎo)致籽粒中直鏈淀粉的含量下降，支鏈淀粉結(jié)構(gòu)改變，并出現(xiàn)白色胚乳［21,24］。OsAlaAT1的表達(dá)還可以調(diào)控水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)，提高水稻氮素利用率［25］。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在植物氮吸收利用過程中發(fā)揮重要功能，并影響了農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。AlaAT基因在擬南芥、水稻、大麥、苜蓿、豆類和楊樹等多種植物中均有一定的報(bào)道，但在小麥中的研究還不夠深入。因此，本研究根據(jù)小麥的基因組信息，對(duì)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員進(jìn)行鑒定分析，并進(jìn)行了生物學(xué)特性以及功能分析，以期為提高小麥的氮素利用率及產(chǎn)量奠定理論基礎(chǔ)，為培育氮高效小麥品種提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 小麥全基因組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員鑒定

本文結(jié)合HMM和BLAST這2種方法篩選小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因。首先從Ensembl(http://plants.ensembl.org/index.html)網(wǎng)站中下載小麥蛋白數(shù)據(jù)庫。根據(jù)包含典型氨基轉(zhuǎn)移酶家族結(jié)構(gòu)域的Pfam碼(PF00155)，通過Pfam數(shù)據(jù)(http://pfamlegacy.xfam.org/)庫查找并下載Stockholm種子文件，并使用HMMER軟件在小麥蛋白數(shù)據(jù)庫中篩選小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員基因；根據(jù)擬南芥和水稻丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因蛋白序列在小麥蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行blast同源蛋白比對(duì)，篩選小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因，結(jié)合兩種方法的結(jié)果進(jìn)行分析，確定目標(biāo)蛋白；通過NCBI-CDD在線網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)篩選剔除缺失或含有不完整氨基轉(zhuǎn)移酶保守結(jié)構(gòu)域的蛋白，最終確定小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因；通過Ensembl數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)獲得基因序列、CDS序列、蛋白序列、基因染色體位置信息、蛋白分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；通過WoLF PSORT網(wǎng)站(https://wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2 進(jìn)化樹分析

通過MEGA7對(duì)小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因及其在水稻、擬南芥和大麥中的同源基因的氨基酸序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，經(jīng)氨基酸序列比對(duì)后，再計(jì)算確定最佳進(jìn)化樹的算法模型為JTT+G，設(shè)定Bootstrap取樣值為1000。15個(gè)小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因最佳進(jìn)化樹算法模型為LG+G。所有氨基酸序列從Ensembl數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站下載?；騃D號(hào)如下：5個(gè)水稻OsAlaAT1(LOC_Os10g 25130)、OsAlaAT2(LOC_Os03g 08530)、OsAlaAT3(LOC_Os07g42600)、OsAlaAT4(LOC_Os10g25140)、OsAlaAT5(LOC_Os09g26380)；4 個(gè)擬南芥AtAlaAT1(At1g17290)、AtAlaAT2(At1g72330)、AtGGAT1(At1g233100)、AtGGAT2(At1g70580)；2個(gè)苜蓿MtmAlaAT(Medtr8g023140)；MtcAlaAT(Medtr5g03 3230)。

1.3 蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析及基因結(jié)構(gòu)分析

將小麥氨基酸序列通過MEME網(wǎng)站進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，設(shè)置結(jié)構(gòu)域個(gè)數(shù)設(shè)為10。通過GSDS 2.0網(wǎng)站(http://gsds.gao-lab.org/index.php)對(duì)小麥成員基因CDS序列與全長基因序列的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

1.4 染色體定位及Ka/Ks計(jì)算

根據(jù)小麥染色體長度與基因在染色體上的位置信息，利用TBtools軟件將15個(gè)基因定位至染色體上。

1.5 啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測

通過Ensembl數(shù)據(jù)庫獲得基因ATG上游2000 bp核苷酸序列，通過PlantCARE網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測。

1.6 基因表達(dá)分析

收集溫室培養(yǎng)的中國春小麥灌漿期的根、莖、葉、旗葉和種子。選取均勻飽滿無傷的種子，平鋪在發(fā)芽盤上，避光2 d進(jìn)行萌發(fā)，隨后正常光照培養(yǎng)3 d，去掉胚乳，轉(zhuǎn)入96孔板上并使用Hoagland營養(yǎng)液水培3 d，達(dá)到2葉1心期進(jìn)行缺氮處理，處理0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、6.0、24.0 h后收集根組織。使用Trizol提取不同組織的RNA后，通過Nano-Drop 2000分光光度計(jì)測定其濃度。每個(gè)樣品包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品取1 μg RNA通過HiScript RT SuperMix試劑反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以每個(gè)樣品的cDNA為模板，使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix通過ABI 7500 Real-Time PCR定量PCR儀進(jìn)行基因表達(dá)分析，引物見表1，采用ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。使用TaActin作為內(nèi)參基因。每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)復(fù)制。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因篩選、鑒定及進(jìn)化樹分析

根據(jù)典型氨基轉(zhuǎn)移酶家族結(jié)構(gòu)域的Pfam碼(PF00155)，通過HMM和blast結(jié)合，篩選出小麥中的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員，并使用SMART和CDD網(wǎng)站進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域檢測，除去缺失和不完整保守結(jié)構(gòu)域的基因，鑒定出73個(gè)小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因序列(圖1)。對(duì)73個(gè)小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，通過與其在擬南芥、水稻和苜蓿中的同源基因進(jìn)行進(jìn)化樹聚類分析，發(fā)現(xiàn)只有15個(gè)基因與擬南芥、水稻和苜蓿中的同源基因聚類到同一分支上，且這一分支可分為2個(gè)亞族，其中12個(gè)基因與擬南芥中AtAlaAT和所有的水稻OsAlaAT親緣關(guān)系較近，聚類到第1組。小麥中有3個(gè)基因與水稻中OsAlaAT1、OsAlaAT3、OsAlaAT4和OsAlaAT5基因同源，其余3個(gè)基因與擬南芥中AtGGAT1/2和苜蓿中的MtcAlaAT的親緣關(guān)系較近，聚類到第2組。

圖1 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因及其同源基因進(jìn)化樹分析

2.2 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員信息分析

對(duì)小麥中15個(gè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行分析，根據(jù)其在染色體上的位置以及水稻丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因，將小麥的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因分別命名為TaAlaAT1-A/B/D，TaAlaAT3-A/B/D，TaAlaAT4-A/B/D，TaAlaAT5-A/B/D和TaGGAT1-A/B/D。根據(jù)基因序列以及氨基酸序列信息分析這15個(gè)基因的化學(xué)特性，結(jié)果顯示15個(gè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因的等電點(diǎn)在5.6613～6.9316之間，蛋白質(zhì)分子量介于43.7～65.9 kDa之間，轉(zhuǎn)錄本長度介于1209～2434 bp之間。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示TaAlaAT1-A/B定位于細(xì)胞質(zhì)中，TaAlaAT1-D定位于葉綠體中，TaAlaAT3-A/B/D均定位于線粒體，TaAlaAT4-A/B/D均定位于葉綠體中，TaAlaAT5-A/B/D定位于細(xì)胞質(zhì)中，而TaGGAT1-A/B定位于過氧化物酶體，TaGGAT1-D定位于細(xì)胞質(zhì)中(表2)。不同的亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，15個(gè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因在小麥生長發(fā)育過程中發(fā)揮了不同的生物學(xué)功能。

表2 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族成員信息分析

2.3 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因染色體定位分析

普通小麥為異源六倍體(AABBDD)，包含3個(gè)染色體組(ABD)，每個(gè)染色體組含有7條染色體，總共21條染色體?；蛉旧w定位信息結(jié)果顯示，15個(gè)基因主要分布在1、2和5號(hào)染色群組上，定位信息（圖2）分布如下：Chro1A(TaAlaAT1-A)；Chro1B(TaAlaAT1-B)；Chro1D(TaAlaAT1-D)；Chro2A(TaAlaAT3-A、TaGGAT1-A)；Chro2B(TaAlaAT3-B、TaGGAT1-B)；Chro2D(TaAlaAT3-D、TaGGAT1-D)；Chro5A(TaAlaAT4-A、TaAlaAT5-A)；Chro5B(TaAlaAT4-B、TaAlaAT5-B)；Chro5D(TaAlaAT4-D、TaAlaAT5-D)。

圖2 TaAlaAT基因的染色體分布情況

2.4 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因序列及蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)AlaAT家族成員氨基酸序列信息，通過MEME網(wǎng)站進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測。設(shè)定10個(gè)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在10個(gè)TaAlaAT氨基酸序列中，除TaAlaAT1-D外均含有10個(gè)完整的保守結(jié)構(gòu)域；TaAlaAT1-D缺少N端的Motif9和Motif6保守結(jié)構(gòu)域；TaGGAT1-A/B均含有8個(gè)完整的保守結(jié)構(gòu)域，缺少N端的Motif9和Motif7保守結(jié)構(gòu)域；TaGGAT1-D只含有7個(gè)完整的保守結(jié)構(gòu)域，N端缺少M(fèi)otif9和Motif7，C端缺少M(fèi)otif8保守結(jié)構(gòu)域?；蛐蛄薪Y(jié)構(gòu)分析顯示，所有基因均含有多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，其中外顯子數(shù)目分別為10、12、13、15和18個(gè)，絕大部分為15個(gè)，外顯子數(shù)目最少的為TaAlaAT1-D，數(shù)目最多的為TaAlaAT4-B(圖3)。

圖3 15個(gè)TaAlaAT基因氨基酸及基因結(jié)構(gòu)分析

2.5 基因?qū)a/Ks分析

通過進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，15個(gè)小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因可進(jìn)化為5支，每支有3個(gè)同源基因，基因序列高度同源。為了研究每個(gè)分支中一組基因在進(jìn)化過程中是否受到選擇壓力的影響，對(duì)每對(duì)基因Ka/Ks值進(jìn)行分析。由表3可知，5組基因?qū)Φ腒a/Ks值均小于1，這說明基因在進(jìn)化過程中受純化選擇作用。

表3 基因?qū)a/Ks分析

2.6 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

啟動(dòng)子中的順式作用元件決定了基因的表達(dá)特異性。通過對(duì)基因啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測，可以為研究AlaAT家族成員的功能提供更多的參考依據(jù)。由圖4可知，每個(gè)基因啟動(dòng)子上均含有多種類型的反應(yīng)元件，如激素響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件以及與發(fā)育相關(guān)的順式作用元件；激素響應(yīng)元件包括脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、生長素響應(yīng)元件(AuxRR-core/TGA-element)、赤霉素響應(yīng)元件(P-box/GARE-motif/TATC-box)、茉莉酸響應(yīng)元件(TGACG-motif/CGTCA-motif)和水楊酸響應(yīng)性(TCA-Element)；脅迫反應(yīng)相關(guān)元件包括缺氧誘導(dǎo)反應(yīng)元件(ARE)、防御和脅迫響應(yīng)元件(TC-rich repeats)、低溫反應(yīng)元件(LTR)、干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件(MYB結(jié)合位點(diǎn)，MBS)、光響應(yīng)相關(guān)元件(TCTmotif/TCCC-motif/GATA-motif/L-box/GA-motif/I-box/LAMP-element/chs- cma1a/Sp1/GT1-motif/MRE/Box4/G-Box)和創(chuàng)傷反應(yīng)元件(WUN-motif)；在啟動(dòng)子上還檢測到一些與植物生物合成和發(fā)育相關(guān)的順式作用元件，如黃酮類生物合成基因調(diào)控(MYB結(jié)合位點(diǎn)，MBSI)、種子特異性調(diào)控(RYelement)、玉米蛋白代謝調(diào)控(O2-site)、細(xì)胞周期調(diào)控(MSA-like)和胚乳表達(dá)調(diào)控元件(GCN4-motif)、調(diào)控分生組織表達(dá)(CAT-box)和晝夜節(jié)律調(diào)控(circadian)。綜上，小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶可能參與小麥的生長發(fā)育、激素響應(yīng)以及脅迫響應(yīng)等過程。

圖4 啟動(dòng)子順式作用元件預(yù)測

2.7 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因在小麥不同組織中的表達(dá)模式分析

為了研究丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因在小麥不同組織中的表達(dá)模式，本研究以小麥灌漿期根、莖、葉、旗葉以及種子為材料，提取RNA并分析基因表達(dá)量。由于同源基因序列相似度較高，分別設(shè)計(jì)了5對(duì)引物，每對(duì)引物可同時(shí)檢測包含了ABD染色體組上的3個(gè)同源基因(表1)。由圖5可知，所有基因在根、莖、葉、旗葉以及種子中均有表達(dá)，且在葉、旗葉中的表達(dá)量均較高。

圖5 基因的組織表達(dá)量分析

2.8 小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因缺氮處理的表達(dá)水平分析

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶是氮代謝通路中的重要酶類，本研究對(duì)小麥丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶在不同時(shí)長缺氮處理的表達(dá)模式進(jìn)行分析。由圖6可知，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因在缺氮處理后表達(dá)模式均有變化，其中TaAlaAT1-A/B/D在缺氮處理后相對(duì)表達(dá)水平上調(diào)，在處理0.5 h時(shí)的表達(dá)量最高，隨后下降，在處理24.0 h后，相對(duì)表達(dá)水平恢復(fù)到處理前水平；TaAlaAT3-A/B/D基因在缺氮處理1.0 h后相對(duì)表達(dá)水平上調(diào)，處理2.0 h的表達(dá)量達(dá)到最高水平，在3.0、6.0、24.0 h時(shí)的表達(dá)量均高于處理前水平；TaAlaAT4-A/B/D基因?qū)θ钡幚頉]有顯著性的響應(yīng)；TaAlaAT5-A/B/D基因在缺氮處理后表達(dá)量顯著下調(diào)；TaGGAT1-A/B/D基因在缺氮處理1.0、2.0、3.0、6.0、24.0 h的表達(dá)量均上調(diào)，在處理2.0 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高值。綜上，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶能夠參與小麥響應(yīng)氮脅迫的調(diào)控過程。

圖6 基因在缺氮脅迫不同時(shí)間的表達(dá)量分析

3 結(jié)論與討論

氮是植物生長所必需的基本元素，對(duì)植物施用氮肥可以促進(jìn)植物的生長發(fā)育，提高植物的生物量和產(chǎn)量。小麥(Triticum aestivumL.)是世界“三大谷物”之一，為人類和牲畜提供蛋白質(zhì)、淀粉和能量。本文結(jié)合HMM、BLAST這2種方法在小麥中篩選鑒定出73個(gè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因，通過進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)：只有15個(gè)基因與擬南芥、水稻、苜蓿中的AlaAT基因親緣關(guān)系比較近(圖1)，在5個(gè)水稻丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因中，除了OsAlaAT2基因，其余4個(gè)OsAlaAT基因在小麥中均有3個(gè)同源基因，并且3個(gè)同源基因分布于ABD不同染色體組上(圖2)。目前，有關(guān)水稻中GGAT基因的研究還鮮有報(bào)道，而在擬南芥中有2個(gè)AtGGAT1/2，大麥中有1個(gè)MtcAlaAT，在小麥中有3個(gè)TaGGAT分別分布于ABD不同染色體組上。研究報(bào)道擬南芥中AlaAT1定位于細(xì)胞質(zhì)中，AlaAT2預(yù)測定位于線粒體中，GGAT定位于過氧化物酶體中［10,18］，水稻OsAlaAT1定位于細(xì)胞質(zhì)中［21］。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，小麥中與水稻OsAlaAT1親緣關(guān)系較近的TaAlaAT1-A/B定位于細(xì)胞質(zhì)中，TaAlaAT1-D定位于葉綠體中，說明OsAlaAT1和TaAlaAT1-A/B可能在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮相同的生物學(xué)功能；與擬南芥AlaAT2親緣關(guān)系較近的TaAlaAT3-A/B/D也定位于線粒體；與GGAT親緣關(guān)系較近的TaGGAT1-A/B也定位于過氧化物酶體中，TaGGAT1-D則定位于細(xì)胞質(zhì)中，這是由于TaGGAT1-A/B氨基酸序列C端含有過氧化物酶體靶向信號(hào)-PTS1的3個(gè)保守多肽(SRL)［17］，而TaGGAT1-D氨基酸序列C端則不含有(表2)。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示：所有基因均含有典型的依賴于磷酸吡哆醛的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族AAT-like保守結(jié)構(gòu)域，磷酸吡哆醛通過與賴氨酸殘基形成希夫堿中間化合物。TaGGAT1與TaAlaAT氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)，TaGGAT1氨基酸序列N端缺少M(fèi)otif9和Motif7保守結(jié)構(gòu)域(圖3)，說明TaGGAT和TaAlaAT功能上的差異可能是由于這2個(gè)結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致。

有研究報(bào)道，Kendziorek等［16］在小麥中分離出4個(gè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因，并分別命名為AlaAT1-2和GGAT1-2，定量結(jié)果顯示只有AlaAT1在缺氧脅迫下轉(zhuǎn)錄水平升高，其余3個(gè)基因在缺氧脅迫后表達(dá)沒有顯著性差異。這4個(gè)基因在缺氮后表達(dá)量均下調(diào)，其中AlaAT1-2基因表達(dá)下調(diào)顯著，而GGAT1基因下調(diào)不顯著，GGAT2基因在缺氮處理24.0 h后才開始下調(diào)表達(dá)。AlaAT基因不僅受缺氧調(diào)控，還受光照影響。小麥中AlaAT和GGAT的活性在黃化幼苗中均能檢測到，并且其活性在放入有光環(huán)境后增強(qiáng)。根據(jù)序列比對(duì)確認(rèn)AlaAT1在本文中命名為TaGGAT1-A/B/D，AlaAT2在文中為TaGGAT5-A/B/D，GGAT1在文中為TaAlaAT3-A/B/D，GGAT2在文中為TaGGAT1-A/B/D。本文定量結(jié)果顯示TaAlaAT1-A/B/D、TaAlaAT3-A/B/D和TaGGAT1-A/B/D基因在缺氮處理后均被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，其中TaAlaAT1-A/B/D基因在處理0.5 h時(shí)表達(dá)水平上調(diào)，隨后下降，在處理24.0 h后恢復(fù)到處理前水平；TaAlaAT3-A/B/D基因缺氮處理1.0 h后表達(dá)水平上調(diào)，處理2.0 h時(shí)達(dá)到最高水平，隨后在處理24.0 h內(nèi)的表達(dá)量均高于處理前水平；TaGGAT1-A/B/D基因在缺氮處理1.0 h后表達(dá)水平上調(diào)，處理2.0 h時(shí)達(dá)到最高表達(dá)水平；而TaAlaAT5-A/B/D在基因缺氮處理后表達(dá)水平下調(diào)。上述基因可能在不同時(shí)間參與小麥響應(yīng)氮脅迫調(diào)控過程。TaAlaAT4-A/B/D基因在缺氮處理后表達(dá)量與處理前相比沒有顯著性的差異，說明該基因可能未參與小麥氮代謝的調(diào)控過程。本文定量結(jié)果與前人報(bào)道上存在的差異可能是由于小麥品種差異造成。小麥中AlaAT基因被證實(shí)在小麥根、莖、葉、雄蕊和雌蕊中均有表達(dá)，但在葉片中的表達(dá)量最高，該基因參與小麥響應(yīng)鎘脅迫調(diào)控過程，經(jīng)鎘脅迫處理后，該基因的表達(dá)量先上升后下降［26］。AlaAT基因即本文中的TaGGAT1-B基因，本文組織表達(dá)分析顯示15個(gè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因在根、莖、葉、種子和旗葉中均有表達(dá)，且在葉、旗葉中的表達(dá)量均較高。