鴨疫里莫氏桿菌的分離鑒定與藥敏試驗

文│尹彥昆（山東省陽谷縣畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展中心）

鴨疫里莫氏桿菌病又被稱為鴨傳染性漿膜炎，這是一種急性或慢性傳染病，主要引起60日齡以內(nèi)尤其是14～21日齡的雛鴨、火雞、鵝大量死亡，并造成長期污染，對養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟效益造成了嚴(yán)重的損害。本試驗從調(diào)查鴨死亡的原因出發(fā)，從病死鴨肝、心臟和腦組織中分離出菌株，并經(jīng)分離培養(yǎng)、革蘭氏染色鏡檢及生化試驗，確定該病菌為鴨疫里莫氏桿菌。為了解目前該地區(qū)鴨疫里莫氏桿菌的耐藥性進行了藥敏試驗，為該病的鑒別診斷和預(yù)防提供了科學(xué)依據(jù)。

一、材料與方法

1.材料。

（1）菌株來源。2021年2月，山東省菏澤市兩個鴨場尋找傳染性漿膜炎病例，發(fā)現(xiàn)幾只雛鴨具有典型癥狀。我們將疑似患有鴨傳染性漿膜炎的病鴨解剖后發(fā)現(xiàn)其肝腫大，漿膜表面纖維素滲出等典型變化。為了進一步確診，將病鴨的研究器官解剖并帶回試驗室進一步診斷。

（2）培養(yǎng)基。巧克力培養(yǎng)基（批號20200903）、胰酶大豆瓊脂固體培養(yǎng)基（批號20200811）、馬丁肉湯培養(yǎng)基（批號20200914）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（批號20200106）均購于青島海博試劑公司，胰蛋白胨大豆肉湯（批號20210203）購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，染色試劑盒（批號20201011）購自鄭州中天科技有限公司。

（3）藥品。選用阿莫西林（批號110151）、慶大霉素（批號1 1 0 3 1 1）、氨芐西林（批號110112）、磷霉素（批號110321）、環(huán)丙沙星（批號1 1 0 2 5 6）、多西環(huán)素（批號110711）、左氧氟沙星（批號110614）、頭孢噻肟鈉（批號1 1 0 1 3 1）、頭孢曲松鈉（批號1 1 0 1 4 2）、亞胺培南（批號110153）、氟苯尼考（批號1 1 0 7 5 9）、頭孢吡肟（批號110361）、黏菌素（批號110139）、阿米卡星（批號110251），藥物濃度分別為94%、60%、98.5%、60%、93%、83%、89.92%、90%、85%、80%、99.5%、77%、80%、90%。所有藥物和微量生化鑒定管均選自青島微生物試劑有限公司。

2.方法。

（1）細菌分離。在無菌條件下采集病料，將細菌接種在TSA平板（包括5%的胎牛血清）上，并把培養(yǎng)基放置在37℃厭氧袋中培養(yǎng)，43小時后觀察細菌生長狀態(tài)。

（2）鑒別培養(yǎng)。篩選出可疑菌落，在無菌環(huán)境下按順序分別將其劃線接種于巧克力培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基上，然后在37℃的厭氧袋內(nèi)培養(yǎng)36小時，對3種不同培養(yǎng)基上細菌的生長情況進行觀察。最后挑取具有疑似鴨疫里莫氏桿菌特征的細菌接種于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（含5%胎牛血清）上進行純培養(yǎng)。

（3）革蘭染色。對分離培養(yǎng)得到的菌株進行革蘭氏染色，步驟如下：選出純培養(yǎng)具有鴨疫里莫氏桿菌特征的單個菌落，用接種環(huán)將其均勻涂在載玻片上，干燥固定；在載玻片上滴加1滴草酸銨結(jié)晶紫染色液，染色1分鐘后用水沖洗；加入兩滴革蘭氏碘液，浸染1分鐘，再水洗；用過濾紙吸取多余水分，加入95%酒精進行脫色處理1分鐘，再次水洗；加沙黃復(fù)染1分鐘左右用水沖洗，等待干燥后在顯微鏡下觀察細菌結(jié)構(gòu)特征。

（4）生化試驗。挑選純培養(yǎng)的鴨疫里莫氏桿菌，用接種環(huán)接種到馬丁肉湯培養(yǎng)基中（血清濃度10%），并將其放置在37℃的恒溫箱中連續(xù)振蕩培養(yǎng)24小時，再將培養(yǎng)后的細菌接種于微量生化反應(yīng)小管中，靜置24～48小時，觀察試驗結(jié)果。

糖發(fā)酵試驗。在無菌條件下，在每只糖發(fā)酵小管內(nèi)放入0.2毫升純培養(yǎng)的細菌液，觀察7天。

過氧化氫酶試驗。在無菌條件下，將固體培養(yǎng)基上的菌落用接種環(huán)取出置于試管內(nèi)，滴加2毫升濃度為3%的過氧化氫，觀察是否產(chǎn)生氣泡。

3.藥物敏感性試驗。測定每種細菌對每種藥物的耐藥程度，首先將上述藥物按要求配制成初濃度為1280微克/毫升的儲備液，再將培養(yǎng)好的菌液稀釋1000倍，最后采用微量液體稀釋法進行試驗，并根據(jù)試驗結(jié)果作出分析。

二、結(jié)果與分析

1.細菌分離結(jié)果與分析。從病鴨心臟、肝和腦中分離出的可疑菌株，在巧克力瓊脂平板上形成橢圓形、稍突出、水滴樣、大小相近的菌落；麥康凱瓊脂平板上的細菌不繁殖；在TSA平板上菌落平滑、潮濕、白色半透明，與鴨疫里莫氏桿菌的特征相同。

2.染色鑒定結(jié)果與分析。革蘭氏染色呈紫色，單個存在，偶見幾個排列呈弧形，細長桿菌，沒有發(fā)現(xiàn)芽孢；不能運動；兩極濃染的短小桿菌，與鴨疫里莫氏桿菌的染色特征相同。

3.生化試驗結(jié)果與分析。結(jié)果表明，不發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、果糖、阿拉伯糖，硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、VP試驗、甲基紅試驗、硫化氫產(chǎn)生、尿素分解陰性，氧化酶、觸酶試驗陽性（見表1）。試驗證明該細菌為鴨疫里莫氏桿菌。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果

4.MIC值測定結(jié)果與分析。本試驗選用多種藥物，如阿米卡星、氨芐西林、環(huán)丙沙星等12種藥物作為試驗原料，對分離的12株細菌進行藥物抗菌試驗，結(jié)果見表2，從菌株耐藥性角度分析：G4菌株對所有的藥物具有很低的敏感性，其最小抑菌濃度均≥64克/毫升，具有很強的耐藥性。相反G7、G8對所有藥物都高度敏感，除氟苯尼考外，其最小抑菌濃度均＜0.0625微克/毫升。從藥物的抗菌性角度分析：頭孢曲松、亞胺培南和頭孢吡肟這3種藥物對G6、G7、G8、G9和G10五種菌株的最小抑菌濃度均＜0.0625微克/毫升，對其他菌株（G4除外），最小抑菌濃度分別為≤32、0.125和≤16微克/毫升，說明它們具有很好的抗菌性。環(huán)丙沙星、多西環(huán)素和慶大霉素這3種藥物對G1～G12所有菌株（G4除外）的最小抑菌濃度分別為≤8、16和16微克/毫升，具有較好的抗菌性。上述其他藥物對分離菌的最小抑菌濃度值有較大差異，可能與細菌個體差異有關(guān)。

表2 12種藥物對12株鴨疫里莫氏桿菌的MIC測定結(jié)果（微克/毫升）

三、討論

1.鴨疫里莫氏桿菌病的發(fā)展現(xiàn)狀及原因。近年來，鴨疫里莫氏桿菌在菏澤市的發(fā)生十分復(fù)雜：首先是該細菌耐藥性問題日趨嚴(yán)重。我國大多數(shù)養(yǎng)殖場使用大量抗生素來預(yù)防或治療該病。這種行為不僅影響環(huán)境，還會造成細菌耐藥性問題，本試驗結(jié)果表明，分離的12株菌株中，G3和G4對阿莫西林和氨芐西林已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性，為該病治療和預(yù)防帶來了很大難度。二是混合感染的發(fā)病率大大提高，給臨床治療帶來很大難度，因此，必須重視和加強對鴨疫里莫氏桿菌感染的預(yù)防，加強宣傳，引導(dǎo)養(yǎng)殖戶科學(xué)養(yǎng)殖，避免耐藥菌的出現(xiàn)和可能造成的環(huán)境污染問題，提高經(jīng)濟效益。

2.試驗藥物的作用效果。從病鴨肝、心臟和腦組織中分離得到的12株細菌，根據(jù)其病理變化、形態(tài)特征、染色結(jié)果、生化試驗可以確定為鴨疫里莫氏桿菌。藥敏試驗結(jié)果表明，亞胺培南、環(huán)丙沙星的抗菌活性最高，它們對12株細菌的抑菌效果最好。慶大霉素、多環(huán)西素和頭孢吡肟對鴨疫里莫氏桿菌也有較好的抗菌活性，除G4菌株外，它們對其他11種菌株的最小抑菌濃度均≤16微克/毫升。慶大霉素主要抑制細菌的蛋白質(zhì)合成，從而發(fā)揮滅菌作用。多環(huán)西素通過改變細菌細胞膜的通透性，使細胞內(nèi)核苷酸漏出，影響細菌DNA的復(fù)制，從而殺滅細菌。頭孢吡肟主要通過抑制細菌細胞壁的合成而產(chǎn)生殺菌活性。因此，將3種藥物作為備選藥物使用。另外，革蘭陰性菌在死亡后會產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素，對動物內(nèi)臟產(chǎn)生嚴(yán)重的毒害作用，推薦在使用抗菌藥物的過程中加入黃芪多糖。

3.預(yù)防措施。加強場區(qū)生物安全管理，入場人員需沐浴、換衣、采樣，合格后方可入場。生產(chǎn)區(qū)與工作區(qū)分離，生產(chǎn)區(qū)進入工作區(qū)要沐浴換衣采樣。進入鴨舍要腳踏火堿盆，工作期間用過硫酸氫鉀消毒手部，過道使用5%氫氧化鈉消毒，每日對鴨舍環(huán)境和異常鴨進行采樣檢測。及時清理病死鴨，用袋子密封，扔到指定區(qū)域集中處理。

四、結(jié)語