膽固醇酯對非酒精性脂肪肝藥物治療的影響

朱豆豆， 朱升龍， 崔思遠(yuǎn)， 陸旭陽， 陳永泉*

（1 .江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 無錫市第二人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214122）

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是最常見的肝病之一[1]。 研究表明飲食結(jié)構(gòu)與NAFLD 的發(fā)生與發(fā)展以及后期的治療效果緊密相關(guān)[2-4]，其中膳食補充膽固醇對肝臟代謝穩(wěn)態(tài)具有至關(guān)重要的影響[5]，相關(guān)流行病學(xué)研究表明， 膳食攝入膽固醇是導(dǎo)致NAFLD惡化的獨立危險因素之一[6-7]。

膽固醇（total cholesterol，TC）可分為游離態(tài)膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C）和膽固醇酯（CE），兩種形式的膽固醇在機體代謝中保持動態(tài)平衡[8]。 關(guān)于食物中CE 的報道多集中在禽蛋、蟹黃[9]以及豬油[10]中，其中每100 g 雞蛋蛋黃中膽固醇酯質(zhì)量為117~140 mg，且油酸膽固醇酯最多[11]。攝入兩種不同形式的膽固醇對NAFLD 發(fā)展以及肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的影響可能存在質(zhì)的不同，這可能是由于兩者結(jié)構(gòu)[12-13]以及合成吸收的途徑不同所導(dǎo)致。 在細(xì)胞內(nèi)，CE 由膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶（SOAT）酯化而成，而FC則主要由乙酰輔酶A 在3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶 （HMGCR） 和角鯊烯單加氧酶的作用下于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中合成[8]。 FC 可由尼曼-匹克C1 型類似蛋白1（NPC1L1）直接介導(dǎo)吸收[14]，而CE 在吸收前需要被胰膽固醇酯酶水解[15]。目前關(guān)于NAFLD 的研究多側(cè)重于FC[16]，關(guān)于CE 的研究相對較少。近年來多項研究表明CE 可影響多種疾病的診療， 例如阿爾茨海默病和前列腺癌等[17-19]，然而CE 是否影響NAFLD 的治療，目前尚不清晰。

非諾貝特（fenofibrate，F(xiàn)eno）是臨床上廣泛用于治療NAFLD 的藥物，在一項包括16 例經(jīng)活檢證實為NAFLD 患者的研究中，使用非諾貝特（200 mg/d）48 周可顯著改善患者的胰島素敏感性和血脂水平[20]。因此，作者采用非諾貝特治療的NAFLD 小鼠模型，探究膳食補充CE 對NAFLD 藥物治療的影響及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑 蘇木精-伊紅染液試劑盒、油紅染色液：南通雨露生物公司產(chǎn)品；胰島素：通化東寶藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶與甘油三酯測試試劑盒： 南京建成生物公司產(chǎn)品；RNA 提取試劑盒、SYBR 混合物、HiFi PCR 混合物： 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品； 反轉(zhuǎn)錄試劑盒：Takara 公司產(chǎn)品；第二鏈cDNA 合成試劑盒：碧云天生物公司產(chǎn)品；凝膠回收試劑盒：南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

非諾貝特（使用生理鹽水配制，振蕩器充分渦旋混勻）： 美國雅培制藥有限公司產(chǎn)品；CE：TCI 公司產(chǎn)品；高脂飼料（脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%，美國營養(yǎng)學(xué)會AIN-93 標(biāo)準(zhǔn)）：南通特洛菲飼料科技有限公司產(chǎn)品。60%高脂飼料+1%CE 飼料（均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)）由南通特洛菲飼料科技有限公司制備， 并經(jīng)60Co 輻照滅菌，所有飼料儲存于4 ℃，使用前取出恢復(fù)至室溫。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 石蠟包埋機、全自動輪轉(zhuǎn)式切片機、冰凍切片機：德國Leica 公司產(chǎn)品；QP2010 Ultra 型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀： 日本島津公司產(chǎn)品；Vanquish Q Exactive Plus 型超高效液相色譜、 酶標(biāo)儀：美國Thermo 公司產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物模型建立 動物實驗方案及所有程序經(jīng)江南大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn) （批準(zhǔn)協(xié)議號：JN.No20190330c0700710[36]）。 從SPF（北京）生物技術(shù)有限公司（中國）購買6 周齡的雄性C57BL/6J小鼠，適應(yīng)實驗室條件1 周。 1）高脂或正常飼料喂養(yǎng)小鼠13 周以建立NAFLD 小鼠模型。 將19 只小鼠分為正常飲食組（normal diet，ND，n=5）、高脂飲食組 （high fat diet，HFD，n=7） 以及非諾貝特治療組（HFD-Feno，100 mg/kg，n=7），藥物治療組小鼠隔天經(jīng)灌胃給藥，HFD 組小鼠給予生理鹽水作為對照，持續(xù)10 周。 2）使用6 周齡的雄性C57BL/6J 小鼠，高脂飼料喂養(yǎng)13 周以建立NAFLD 小鼠模型。將21只小鼠分為高脂飲食組（HFD，n=7）、非諾貝特治療組（HFD-Feno，100 mg/kg，n=7）以及補充質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%CE 的非諾貝特治療組（HFD-CE-Feno，n=7）。 藥物治療組小鼠隔天經(jīng)灌胃給藥，HFD 組小鼠給予生理鹽水作為對照，持續(xù)10 周。

1.2.2 組織病理學(xué)檢查 蘇木精-伊紅染色參照之前方法[21]。 對于油紅染色，將儲存在-80 ℃冰箱的組織切成8 μm 厚的切片，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%甲醛固定30 min。然后使用油紅染色試劑盒對切片進行染色。

1.2.3 總膽固醇酯與膽固醇酯種類的測定 氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）用于檢測TC、FC 以及CE 質(zhì)量分?jǐn)?shù)。樣品制備步驟如下：20 mg 肝臟組織于500 μL 純水中勻漿，取100 μL 勻漿液或25 μL 血清置于10 mL 塑料離心管。 同一樣品做6 個平行樣，分為兩組（TC 組標(biāo)記為A1、A2、A3；FC 組標(biāo)記為B1、B2、B3）。 A 組樣品加入1 mL 1 mol/L 氫氧化鉀-乙醇溶液檢測TC，渦旋15 s，70 ℃金屬浴1 h。 B 組加入1 mL 乙醇測定FC，充分渦旋。

兩組后續(xù)處理如下：分別向上述混合液中添加1 mL 超純水、3 mL 正己烷，充分渦旋15 s，2 000 r/min離心10 min，分層。 轉(zhuǎn)移上清液到新的塑料離心管中，向原管剩余液體中加入3 mL 正己烷，重復(fù)提取一次，混勻。吸取1 mL 上清液轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP 管，用氮氣吹干。 向干燥的EP 管中添加50 μL BSTFA混勻并在75 ℃金屬浴1 h， 進行衍生化。 離心，取40 μL 混合液體至棕色氣相瓶，上機或儲存在-80 ℃冰箱。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析 對于文庫的制備， 使用Ultrapure RNA 試劑盒提取總RNA。此外使用RT 試劑盒合成具有1 μg 總RNA 的cDNA。 使用第二鏈cDNA 合成試劑盒合成第二鏈cDNA。使用凝膠回收試劑盒純化文庫片段。 使用HiFi PCR 混合物擴增混合物，回收目標(biāo)產(chǎn)物并進行PCR。

使用Qubit?3.0 中的Qubit?RNA 分析試劑盒測量文庫中的RNA 濃度以進行初步定量， 然后將其稀釋至1 ng/μL。使用Agilent Bioanalyzer 2100 系統(tǒng)評估插入物的大小， 并使用StepOnePlusTM實時PCR 系統(tǒng)（庫中有效濃度>10 nmol/L），將合格的插入物進行準(zhǔn)確定量。 使用HiSeq PE Cluster Kit v4-cBot-HS（Illumina）在cBot 群集生成系統(tǒng)上對索引編碼的樣本進行群集。產(chǎn)生簇后，在Illumina 平臺上對文庫進行測序，并產(chǎn)生150 bp 的配對末端讀段。

1.2.5 實時熒光定量PCR 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒從1 μg 總RNA 中合成cDNA， 使用Ultra SYBR 混合物進行實時熒光定量PCR（RT-QPCR）。根據(jù)3 個獨立實驗樣品的閾值循環(huán)值分析數(shù)據(jù)。 引物見表1。

表1 qPCR 引物序列Table 1 qPCR primer sequence

1.3 統(tǒng)計分析

使用SPSS 25.0 版進行數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性分析。 所有數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 7 進行分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。 兩組間比較時，如果數(shù)據(jù)滿足正態(tài)性、獨立性且方差齊性，則統(tǒng)計檢驗方法選用獨立樣本t 檢驗； 兩組以上數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 非諾貝特治療NAFLD 的效果分析

高脂飲食飼喂13 周以建立NAFLD 小鼠模型，連續(xù)10 周隔天灌胃給藥后，觀測藥物療效。

與HFD 組相比，非諾貝特在不影響小鼠肝臟質(zhì)量和白色脂肪質(zhì)量的同時顯著降低體質(zhì)量。 此外，治療期間的小鼠進食量無顯著差異（見圖1）。

圖1 非諾貝特對小鼠體質(zhì)量以及組織質(zhì)量的影響Fig. 1 Effect of fenofibrate on the body weight and tissue weight of mice

從圖2（a）、2（b）可知，同HFD 組小鼠相比，非諾貝特可以顯著降低小鼠肝臟內(nèi)甘油三酯（triglycerides，TG） 和谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （alanine aminotransferase，ALT）水平。圖2（c）是染色后的肝臟石蠟切片與冰凍切片， 與ND 組相比，HFD 組小鼠肝臟存在明顯的脂質(zhì)堆積。 同HFD 組小鼠相比，HFDFeno 組小鼠肝臟的脂質(zhì)堆積情況得到顯著改善。

圖2 非諾貝特對小鼠肝臟的影響Fig. 2 Effect of fenofibrate on the liver of mice

2.2 膳食補充CE 對小鼠肝臟中CE 的影響

非諾貝特能夠有效緩解NAFLD 的癥狀， 在膳食補充CE 后， 藥物治療組小鼠肝臟內(nèi)的膽固醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)生明顯改變。如圖3 所示，相較于HFD 組，非諾貝特顯著降低了小鼠肝臟中的CE 水平， 但膳食添加CE 抵消了非諾貝特對NAFLD 小鼠肝臟中CE 的調(diào)控作用。 其中，膽固醇油酸酯是小鼠肝臟中CE 增加的主要形式。

圖3 膳食補充CE 對小鼠肝臟膽固醇酯水平的影響Fig. 3 Effects of dietary CE on hepatic cholesterol levels of mice

2.3 膳食補充CE 對非諾貝特藥效的影響

如圖4 所示，非諾貝特治療10 周后，與HFDFeno 組相比，膳食補充CE 在不影響體質(zhì)量與白色脂肪質(zhì)量的同時可增加小鼠肝臟質(zhì)量。 但與HFDFeno 組小鼠相比，HFD-CE-Feno 組小鼠的血糖水平?jīng)]有顯著改變。

圖4 膳食補充CE 對小鼠組織質(zhì)量及血糖水平的影響Fig. 4 Effects of dietary CE on tissue weight and blood glucose level of mice

從圖5（a）可知，HFD-CE-Feno 組小鼠肝臟中TG 水平并未顯著增加，但具有升高的趨勢。 小鼠肝臟的石蠟切片與冰凍切片染色結(jié)果也一致表明，膳食補充CE 可削弱非諾貝特對NAFLD 小鼠的治療效果（見圖5（b））。

圖5 膳食補充CE 對非諾貝特治療小鼠肝臟的影響Fig. 5 Effect of dietary CE on the liver of mice treated with fenofibrate

2.4 補充CE 對非諾貝特治療的NAFLD 小鼠肝臟脂質(zhì)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄組水平的影響

如圖6（a）所示，非諾貝特調(diào)控基因中倍數(shù)改變前20 的基因聚類顯示，在補充CE 后，非諾貝特調(diào)控的基因呈現(xiàn)相反的變化。 從圖6（b）可知，非諾貝特上調(diào)的151 個基因中， 有78 個基因在膳食補充CE 后下調(diào)；而在非諾貝特下調(diào)的167 個基因中，有75 個發(fā)生上調(diào)。

圖6 膳食補充CE 對脂質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of dietary CE on lipid-related gene expression

為進一步探究這些差異基因所參與的代謝途徑，分別對兩組差異基因進行GO 富集分析。 如圖7（a）所示，非諾貝特主要影響甘油三酯代謝、脂肪酸的β 氧化以及PPAR 信號通路，尤其是膽固醇酯化途徑。 而在HFD-CE-Feno 組，補充CE 主要影響甘油三酯代謝以及蛋白質(zhì)入核（見圖7（b））。

圖7 膳食補充CE 對脂質(zhì)相關(guān)通路的影響Fig. 7 Effect of dietary CE on lipid-related pathways

從圖8 可知，在高脂飲食情況下，非諾貝特顯著升高氧化磷酸化相關(guān)基因Atp5b 以及Cycs 在肝臟中的mRNA 水平，而在HFD-CE-Feno 組，兩者均顯著降低。 同HFD 組相比， 非諾貝特顯著升高Pparα 以及Cpt1a 的mRNA 水平，而CE 則逆轉(zhuǎn)了非諾貝特對該基因的調(diào)控作用。 盡管CE 并未影響Fasn 以及Acc1 的 表 達(dá)， 但 補 充CE 后，Dgat2 的mRNA 水平呈倍數(shù)增加，具有明顯上升趨勢。 此外，非諾貝特顯著降低膽固醇酯化基因Soat1 與Soat2的表達(dá)，膳食補充CE 抵消了非諾貝特的影響。由此可以推測， 補充CE 改變了非諾貝特對脂肪酸代謝以及膽固醇酯化的調(diào)控作用。

圖8 脂質(zhì)相關(guān)通路基因的表達(dá)變化Fig. 8 Changes in the expression of lipid-related pathway genes

先前研究表明， 肥胖與血液中CE 水平顯著相關(guān)， 肥胖受試者肝臟中CE 的水平相比于對照組增加了3 倍[22]。 成像數(shù)據(jù)顯示在重癥前列腺癌和轉(zhuǎn)移的脂滴中存在酯化膽固醇的積累[18]。 此外，CE 影響動脈粥樣硬化[23-24]、乳腺癌[25]、白血病[26]和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[27]等多種疾病，這表明CE 也可能在疾病發(fā)展中起關(guān)鍵作用。

NAFLD 的發(fā)生通常與肝臟中甘油三酯的升高有關(guān)[28]，然而，最近的研究表明膽固醇穩(wěn)態(tài)在NAFLD中起著核心作用[29]。作為臨床常用于治療NAFLD 的藥物， 非諾貝特與TG 和高密度脂蛋白膽固醇水平的改善緊密相關(guān)[30-31]。 然而，就非諾貝特對胰島素敏感性和葡萄糖代謝的影響而言，結(jié)果喜憂參半[32-33]。在該研究中， 膳食補充CE 在增加小鼠肝臟中CE的同時削弱了非諾貝特對NAFLD 小鼠的治療效果。 因此猜測非諾貝特臨床治療效果差異顯著的一個潛在原因可能是患者肝臟中CE 的水平不同，這可能是飲食中過量攝入CE 導(dǎo)致的。此外，干預(yù)生活方式仍是目前治療NAFLD 的重要手段， 通過控制飲食減輕體質(zhì)量可顯著減少肝脂肪變性和炎癥[34]。因此合理適量的調(diào)整飲食，即減少非諾貝特治療的NAFLD 患者飲食中CE 的攝入或可進一步改善藥物的治療效果。 然而，CE 如何介入非諾貝特治療NAFLD 的具體機制仍需進一步研究。

3 結(jié) 語

膳食補充CE 會增加小鼠肝臟中CE 水平，在不影響體質(zhì)量的同時抵消非諾貝特治療小鼠NAFLD 的效果。 此外CE 影響了甘油三酯代謝以及蛋白質(zhì)入核過程，同時逆轉(zhuǎn)了非諾貝特對氧化磷酸化、脂肪酸氧化以及脂質(zhì)生成相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。 盡管NAFLD 對人體健康造成很大影響，但治療疾病可選擇的方案仍然有限。因此，開發(fā)與CE 相關(guān)的治療NAFLD 的手段以及探究如何通過膳食指導(dǎo)提高藥物療效應(yīng)引起關(guān)注。