脯氨酸羥化酶3在腫瘤中的作用研究進展▲

鄭 霜 袁 也 金 瑩 付 堅

(湖北醫(yī)藥學院附屬人民醫(yī)院1 超聲影像中心,2 臨床醫(yī)學研究所,湖北省十堰市 442000)

【提要】 脯氨酸羥化酶3(EGLN3)是脯氨酸羥化酶家族成員之一,其羥化酶活性受氧濃度的影響。研究發(fā)現EGLN3可調控腫瘤細胞增殖、凋亡、分化及能量代謝,對腫瘤血管生成、生長及轉移具有重要的調控作用,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡性程度及預后密切相關。本文就EGLN3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用進行綜述,旨在總結EGLN3發(fā)揮抑癌作用的機制,為臨床治療腫瘤提供參考。

脯氨酸羥化酶3(egl-9 family hypoxia inducible factor 3,EGLN3)又稱PHD3、HPH1和SM20,屬于秀麗隱桿線蟲基因egl-9(EGLN)家族缺氧誘導因子(hypoxia inducible factor,HIF)[1-2],依賴氧、α-酮戊二酸和Fe2+催化激活[3]。常氧條件下,EGLN3可羥基化HIF-1α,促進HIF-1α泛素化降解[4]。此外,EGLN3與交感神經細胞的凋亡、平滑肌細胞的分化[5]及小腸杯狀細胞的形成[6]有關,且被認為是配對盒基因2的負性調節(jié)分子,參與調控活化轉錄因子4及絲裂原活化蛋白激酶6的蛋白穩(wěn)定性[7],介導β2腎上腺素能受體的降解,并可羥基化細胞分裂周期樣激酶2,對DNA造成損傷[8]。

目前,EGLN3被認為是一種抑癌基因[9-10]。研究發(fā)現,EGLN3可誘導腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤細胞增殖,其高表達與腫瘤的良好預后相關[11-14]。本文就EGLN3在腫瘤中的作用機制進行綜述,為尋找腫瘤治療的新的潛在靶點提供參考。

1 EGLN3對腫瘤細胞凋亡的調控作用

凋亡是由Caspase介導的程序性細胞死亡。目前細胞凋亡主要包括外源性途徑(腫瘤壞死因子家族死亡受體途徑)和內源性途徑(線粒體依賴途徑)[15]。EGLN3在細胞凋亡中的作用日益被關注,研究發(fā)現其在多種不同的細胞中通過不同機制發(fā)揮促凋亡作用。如去除神經生長因子誘導EGLN3表達后可通過調控驅動蛋白家族成員1β促進PC12細胞(大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株)的凋亡[16-17];Jiang等[1]報告EGLN3過表達可通過激活Caspase-3誘導肝癌細胞凋亡。

1.1 EGLN3通過調控p53的表達促進腫瘤細胞凋亡 p53參與凋亡、衰老、DNA修復和細胞周期停滯等多種細胞反應,它的功能受翻譯后修飾的嚴格調控,包括泛素化、乙?；?、磷酸化和羥基化[18-19]。鼠雙微體2(mouse double minute 2,MDM2)被認為是p53蛋白水平及細胞定位的主要調節(jié)因子,對p53的穩(wěn)定性及功能有重要作用 。

Rodriguez等[19]研究發(fā)現EGLN3通過調控p53發(fā)揮抗增殖與促凋亡功能。EGLN3通過羥化p53的第359位脯氨酸,增強p53與去泛素化酶7和去泛素化酶10的相互作用,進而影響p53蛋白的穩(wěn)定性。抑制EGLN3羥化酶的活性后去泛素化酶與p53結合作用減弱,p53的泛素化水平增強、蛋白表達水平降低。Xu等[8]研究表明,EGLN3通過阻斷p53和MDM2的相互作用,從而抑制MDM2介導的p53泛素化降解,維持p53的穩(wěn)定性,這一過程不依賴EGLN3羥化酶活性。

目前尚未明確EGLN3是否依賴其羥化酶活性來調控p53,以上研究所得的結論并不一致的原因可能是兩個研究所用的實驗細胞不同,而EGLN3調控p53具有細胞特異性。同時,p53的表達調控在轉錄、翻譯,以及翻譯后等多個水平上進行,EGLN3可能通過多個作用位點及相應機制調控p53。

1.2 EGLN3與抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤/白血病2的關系 抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤/白血病2(B-cell lymphoma/leukemia 2,Bcl-2)可通過與Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)形成異二聚體抑制細胞凋亡[20]。Bcl-2包含四個BH(BH1、BH2、BH3、BH4)結構域,其中BH4結構域對Bcl-2的抗凋亡活性具有重要意義。有研究表明,EGLN3可與Bcl-2的BH4結構域相互作用,抑制Bax-Bcl-2復合物的形成,進而影響B(tài)cl-2的抗凋亡作用,促進細胞凋亡[21]。

Chen等[22]的研究結果顯示,肺癌組織中EGLN3的表達水平明顯高于癌旁正常組織,且與非小細胞肺癌的分期及分化有關;EGLN3的表達水平與Bcl-2的表達水平呈負相關,EGLN3可能通過誘導非小細胞肺癌細胞凋亡來抑制腫瘤生長;EGLN3羥化酶活性被抑制后,其促凋亡作用減弱。但該研究未說明缺乏羥化酶活性的EGLN3是否可以抑制Bcl-2的抗凋亡作用。

1.3 EGLN3通過激活蛋白聚集誘導細胞凋亡 內質網是真核細胞重要的膜性細胞器,控制蛋白質的加工、修飾、合成與分泌。當內質網穩(wěn)態(tài)被破壞時,錯誤折疊蛋白聚集,引起內質網應激[23]。內質網應激早期通過激活未折疊蛋白反應以修復內質網功能,但當內質網應激持續(xù)時間太長或強度太高,會激活C/EBP同源蛋白、c-Jun氨基末端激酶及Caspase等通路,從而誘導細胞凋亡。

Rantanen等[24]研究發(fā)現,EGLN3通過誘導蛋白聚集體的形成,引起26S蛋白酶體、泛素化蛋白和伴侶蛋白等聚集,導致Hela細胞發(fā)生凋亡,該功能受氧分壓的影響,而EGLN3促進蛋白聚集需要羥化酶活性,這表明在常氧條件下Hela細胞存在EGLN3的羥基化靶點。有研究顯示EGLN3和伴侶蛋白T復合物蛋白環(huán)復合物之間存在相互作用[25],而T復合物蛋白環(huán)復合物是蛋白質聚集體的組成部分,但它是否參與EGLN3誘導的蛋白聚集尚未明確。

2 EGLN3對腫瘤細胞增殖的調控作用

細胞的異常增殖與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后關系密切。有研究表明EGLN3可通過β-連環(huán)蛋白/T細胞因子信號通路[26-27]、脂肪代謝等[28]多種機制抑制腫瘤細胞增殖,但也有文獻報告缺氧所致的EGLN3高表達可促進腫瘤細胞生長[29]。

2.1 EGLN3通過調控表皮生長因子受體抑制腫瘤細胞增殖 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)屬于酪氨酸激酶受體ERBB家族,在多種癌癥中發(fā)現EGFR及其相關配體,包括表皮生長因子和轉化生長因子α水平升高[30]。EGFR與其配體結合后,可以啟動受體下游的信號傳導通路,促進癌細胞的增殖,同時也可以通過配體-受體復合物的內吞作用內化EGFR,以抑制信號傳導。此外,EGFR可能還是評估多種腫瘤預后的指標[31]。

Henze等[32]和Garvalov等[33]研究發(fā)現EGLN3是一種新的EGFR活性調節(jié)因子,其與胞吞調控蛋白表皮生長因子受體蛋白酪氨酸激酶底物15結合,促進EGFR的內化。在腦膠質母細胞瘤中,EGLN3的缺失可以抑制EGFR內化,激活EGFR信號傳導,使其磷酸化增加,從而促進腫瘤細胞增殖。上述兩項研究揭示了EGLN3的缺失激活了EGFR途徑,導致低氧環(huán)境中腫瘤細胞的增殖。

2.2 EGLN3通過調控細胞周期進程抑制細胞增殖 細胞周期蛋白依賴性激酶復合物介導視網膜母細胞瘤蛋白的高磷酸化是細胞周期G1期向S期轉變的關鍵,是細胞周期正常進行的重要步驟[34]。機體缺氧后細胞周期和細胞增殖受到抑制,并使p21、p16、p27等細胞周期蛋白依賴性激酶的抑制劑表達上調。H?gel等[35]研究發(fā)現,缺氧時EGLN3的表達增加,并通過降低p27的穩(wěn)定性來維持癌細胞的生長,促進細胞周期的進展。特異性抑制EGLN3后p27 S10磷酸化增加,p27的降解被抑制,高磷酸化視網膜母細胞瘤蛋白的水平及細胞周期蛋白D1的表達水平降低,導致細胞周期阻滯于G1/S期,進而抑制細胞增殖。

2.3 EGLN3通過調控β-連環(huán)蛋白/T細胞因子信號通路抑制腫瘤細胞增殖 Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的激活是胃癌的主要病因之一[36]。Wnt蛋白可促進β-連環(huán)蛋白釋放和積累,并促進其轉移到細胞核中與轉錄因子淋巴增強因子和T細胞因子相互作用,激活下游靶基因,促進癌癥發(fā)生[37]。Cui等[26]發(fā)現EGLN3可以促進β-連環(huán)蛋白的泛素化,阻遏β-連環(huán)蛋白/T細胞因子信號傳導,進而抑制胃癌細胞的生長。蓬亂蛋白2是β-連環(huán)蛋白/T細胞因子通路的核心分子,可促使β-連環(huán)蛋白與T細胞因子結合,啟動下游靶基因的表達,從而引起腫瘤細胞增殖[38]。EGLN3可與蓬亂蛋白2相互作用,進而抑制信號傳導,但EGLN3與蓬亂蛋白2之間存在直接作用還是間接作用尚未明確,并且該作用是否依賴EGLN3羥化酶活性仍有待研究。

2.4 EGLN3通過能量代謝途徑調控腫瘤細胞增殖 腫瘤細胞具有不同于正常細胞的能量代謝機制。研究表明脂肪酸氧化可促進多種腫瘤細胞的生長,而乙酰輔酶A羧化酶2是脂肪酸代謝的關鍵酶[39]。Rodriguez等[7]和German等[28]發(fā)現EGLN3可調節(jié)脂肪代謝。在急性粒細胞白血病等腫瘤細胞亞群中,EGLN3低表達可促進脂肪分解代謝,而過表達的EGLN3可通過羥基化乙酰輔酶A羧化酶2抑制脂肪酸氧化,阻礙白血病細胞的增殖,但EGLN3如何靶向調控乙酰輔酶A羧化酶2羥基化位點有待進一步闡明。

EGLN3也可調節(jié)糖代謝。EGLN3通過羥基化丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2,PKM2)的第403位和第408位脯氨酸,使其與HIF-1α之間的相互作用增強,進而促進HIF-1α與缺氧反應元件的結合及協(xié)同轉錄激活因子p300向缺氧反應元件的募集,促進HIF-1α糖代謝相關靶基因的轉錄激活,加強了細胞的糖酵解[40]。上述文獻提示EGLN3對HIF-1α轉錄活性的調控依賴PKM2,而PKM2受組蛋白去甲基化酶5(lysine demethylase 5,KDM5)調控。然而,近期Schoepflin等[29]報告,在缺氧狀態(tài)下EGLN3不依賴PKM2-KDM5也可促進髓核細胞HIF-1的轉錄。另外,在腎癌中,EGLN3通過調節(jié)糖代謝關鍵酶的表達,誘導糖酵解和乳酸生成,還可增強核糖體蛋白翻譯,調控細胞周期,進而促進腫瘤的進展,這與EGLN3在其他腫瘤中的抑癌作用機制不同,具體機制有待深入研究[41]。

3 EGLN3對血管生成及腫瘤轉移的調控作用

新生血管形成是腫瘤的主要營養(yǎng)來源,也是腫瘤侵襲及轉移的主要途徑。在腫瘤發(fā)展過程中,血管系統(tǒng)逐漸無法滿足快速增殖的腫瘤細胞,從而出現結構和功能的異常,導致組織中的氧氣和營養(yǎng)物質供應不足[42]。而缺氧又引起各種適應性反應,包括腫瘤細胞代謝、生存、侵襲及血管生成。

3.1 EGLN3通過調控上皮-間質轉化抑制腫瘤轉移 上皮-間質轉化是指上皮細胞在某些特定情況下向間質細胞轉化的現象[43]。在這一過程中,上皮細胞失去極性,細胞間黏附連接減少,遷移、運動能力增強,逐漸向間質細胞表型轉化。上皮-間質轉化是惡性腫瘤侵襲、轉移的重要機制之一。

Dopeso等[44]研究表明,在肺癌微環(huán)境中,EGLN3參與缺氧信號傳導及上皮-間質轉化調節(jié)。轉化生長因子β或EGLN3啟動子甲基化可抑制EGLN3的表達,上調HIF表達,進而誘導轉化生長因子α表達增加,激活EGFR-Smad信號傳導,促進上皮-間質轉化和腫瘤自發(fā)性轉移。EGLN3的低表達與腫瘤的不良預后及對EGFR抑制劑的耐藥有關[44]。以上研究結果表明EGLN3是上皮-間質轉化、腫瘤轉移及治療抵抗的負性調節(jié)因子,明確了EGLN3在腫瘤轉移和治療中的關鍵作用。值得注意的是,EGLN3通過轉化生長因子α介導的上皮-間質轉化具有細胞特異性,在膠質瘤細胞、乳腺癌細胞及結直腸癌細胞等多種腫瘤細胞中未觀察到上述現象。

3.2 EGLN3通過調控抗凋亡基因髓樣細胞白血病1介導的三磷酸腺苷生成抑制腫瘤轉移 抗凋亡基因髓樣細胞白血病1是Bcl-2家族抗凋亡蛋白,在維持線粒體正常生理和能量代謝方面發(fā)揮著重要作用[45]。Radhakrishnan等[46]報告人類結直腸癌組織中EGLN3的低表達與腫瘤高轉移率和不良預后密切相關。敲除腫瘤細胞中的EGLN3基因后,髓樣細胞白血病1在線粒體中表達增強,加速三磷酸腺苷的產生,促進細胞的遷移潛能和克隆形成能力。該研究揭示了EGLN3與髓樣細胞白血病1之間的重要關系,并證實髓樣細胞白血病1與腫瘤細胞缺氧感應通路和能量穩(wěn)態(tài)之間的關系,但EGLN3與髓樣細胞白血病1之間的具體作用機制如何,有待闡明。另外,該研究認為結直腸癌組織中EGLN3的表達與腫瘤分級、分期無明顯相關性,此結論與Xue等[47]的研究結果相反,這可能與納入群體的特殊性有關。在Radhakrishnan等[46]的研究中患者多為低位直腸癌,局部復發(fā)率相對較高。此外,還可能與上述兩個研究中患者的腫瘤生物學特征不同有關,EGLN3與這些影響腫瘤復發(fā)的生物學特征之間具有不同程度的相關性。

3.3 EGLN3通過調控HIF抑制腫瘤轉移及血管生成 HIF-1α是腫瘤細胞適應缺氧環(huán)境的關鍵調控因子,對腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲等特性發(fā)揮重要作用[48]。在常氧條件下,EGLN3羥基化HIF-1α 的第402位和第564位脯氨酸,羥化的HIF-1α與希佩爾-林道綜合征腫瘤抑制蛋白結合,經泛素蛋白酶途徑降解。在缺氧環(huán)境下,EGLN3酶活性降低,HIF-1α降解受阻,激活下游血管內皮生長因子等基因誘導腫瘤血管生成,助力腫瘤的生長和轉移[49]。但有研究報告,胰腺癌中表達異常升高的EGLN3在缺氧微環(huán)境中依然可抑制HIF信號通路進而導致新生血管形成不良[50]。

在常氧條件下,EGLN3通過翻譯后羥基化作用抑制HIF-2α蛋白表達。然而,在腎癌細胞中,沉默EGLN3基因表達后卻導致HIF-2α蛋白表達水平及mRNA表達水平降低[51]。體外實驗證明EGLN3可通過調節(jié)mRNA加工因子從而影響HIF-2α mRNA表達水平的穩(wěn)定性。腎癌組織中異常高表達的EGLN3可以維持HIF-2α及血管內皮生長因子A、干細胞轉錄因子、葡萄糖轉運體1及乳酸脫氫酶A等下游靶基因的穩(wěn)定性,進而增加腎癌的糖酵解效應,促進腎癌的進展并增加其侵襲性[51]。此項研究亦表明,EGLN3在腎癌中發(fā)揮了促癌作用,與前述對腎癌的研究結果相似[41]。

目前,EGLN3對HIF-2α的調控如何,相關觀點尚未統(tǒng)一。如在骨髓瘤細胞中,EGLN3過表達可以抑制HIF-2α的表達,并增強氧感知通路的穩(wěn)定性,促進缺氧誘導的細胞凋亡[52]。但Jiang等[1]通過各種實驗分析肝細胞癌組織和鄰近正常肝組織中EGLN3與HIF-2α的蛋白質和mRNA表達水平,結果顯示肝癌組織中HIF-2α與EGLN3的蛋白質和mRNA表達水平之間無明顯相關性。這些研究結論存在差異的原因可能與細胞特異性及腫瘤微環(huán)境的不同有關,具體機制有待深入探索。

3.4 EGLN3通過血小板衍生生長因子調控腫瘤血管生成 Egners等[53]研究發(fā)現,小鼠骨肉瘤LM8細胞的EGLN3基因可以促進腫瘤生長,但對HIF-1α及其下游靶基因的表達并無影響,且免疫組織化學實驗證明,敲除EGLN3基因可以使腫瘤組織血管密度、形態(tài)發(fā)生變化,形成大的、不規(guī)則形狀且密度較低的血管。新生血管的這一表型變化是由血小板衍生生長因子C表達上調引起。血小板衍生生長因子C通過促進周細胞募集、內皮細胞遷移、內皮祖細胞動員等多種方式影響腫瘤進展。該研究表明抑制小鼠肺癌細胞(LLC細胞)的EGLN3后血小板衍生生長因子C表達并未上調,因此EGLN3與血小板衍生生長因子C通路之間的相互作用可能具有腫瘤類型特異性。

4 小結與展望

EGLN3不僅能夠羥基化HIF-1α,還具有多種HIF非依賴性功能,在腫瘤凋亡、增殖、轉移及血管生成中發(fā)揮重要作用。本文通過對EGLN3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的調節(jié)功能及機制進行綜述,為進一步探索EGLN3在腫瘤中的作用,以及相關腫瘤的精準治療提供新的思路。