漿液性卵巢癌患者的斯鈣素2表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系

吳文娟，陳歷排，張東輝，高春輝

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科腫瘤外科1、病理科2、重癥醫(yī)學(xué)科3，廣東 廣州 510095

根據(jù)2020年癌癥統(tǒng)計，全世界每年約有313 959例卵巢癌新發(fā)病例和207 252 例卵巢癌相關(guān)的死亡病例[1]。卵巢上皮性腫瘤為最常見的卵巢腫瘤，多數(shù)確診時已是晚期，轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)率高，因此卵巢癌治療仍存在巨大挑戰(zhàn)[2]。斯鈣素2 (Stanniocalcin 2，STC2)屬于高度保守的分泌型糖蛋白激素家族。人類的STC2是由302個氨基酸組成，廣泛表達(dá)于腎、卵巢、骨、神經(jīng)及肌肉等組織中，并具有廣泛的促瘤作用[3]。本文基于公共數(shù)據(jù)庫TCGA及GTEx的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對STC2在泛癌中的差異表達(dá)、預(yù)后意義進(jìn)行了分析，進(jìn)而在高級別漿液性卵巢癌及正常卵巢組織中，采用免疫組化檢測STC2的表達(dá)，并且分析STC2的表達(dá)水平與患者預(yù)后的相關(guān)性，為后續(xù)的分子及機制的研究提供臨床基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 泛癌中的STC2 數(shù)據(jù)來源于TCGA (The Cancer Genome Atlas，癌癥基因組圖譜)及GTEx(Genotype Tissue Expression)數(shù)據(jù)庫中l(wèi)evel3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq 數(shù)據(jù)，將其轉(zhuǎn)成TPM 格式并進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化。統(tǒng)計分析及可視化主要使用的是R(3.6.3版本)軟件的ggplot2(3.3.3 版本)。本文分析了STC2 在TCGA 的腫瘤組織及對應(yīng)的GTEx 正常組織中的差異表達(dá)。Tumor Immune Estimation Resource(TIMER，http://timer.comp-genomics.org/)可用于分析泛癌中的免疫浸潤情況，包括TCGA數(shù)據(jù)中的32種癌癥10 897例樣本的基因表達(dá)、臨床預(yù)后、體系突變、體細(xì)胞拷貝數(shù)的改變以及腫瘤免疫系統(tǒng)的特征[4]。采用TIMER 2.0在線分析了STC2 在泛癌中的免疫浸潤情況?；赥CGA 的臨床信息，分組為0～50vs50～100，使用R 語言的survival 包(3.2～10 版本)用于生存資料的統(tǒng)計分析；survminer 包(0.4.9 版本)用于可視化。分析STC2在泛癌中的預(yù)后意義。

1.2 材料與主要試劑 收集2012 年1 月至2019年5月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦瘤科手術(shù)并經(jīng)病理確診為漿液性卵巢癌的102例患者的卵巢腫瘤組織，以及2011年3月至2019年7月因非卵巢部位良性病變行卵巢切除的26 例正常卵巢組織。標(biāo)本離體后經(jīng)石蠟包埋固定保存。所有患者術(shù)前均簽署知情同意書并獲得廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。術(shù)后根據(jù)病理結(jié)果接受化療、靶向治療等規(guī)范治療。STC2 抗體購自abcam(ab262857)，使用安捷倫公司的Dako Omnis 全自動免疫組化儀進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，顯色試劑使用DAKO GV800。

1.3 免疫組化測定 采用免疫組織化學(xué)法(Immunohistochemistry，IHC)檢測STC2 在漿液性卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá)。所有待測樣本經(jīng)石蠟包埋固定連續(xù)切片備用，切片厚度為3 μm，經(jīng)HE染色確診為腺癌后進(jìn)行常規(guī)免疫組化染色。各步驟嚴(yán)格遵照試劑盒說明書進(jìn)行操作。具體方法：使用免疫組化專用防脫玻片，60℃烘烤1 h，上機；脫蠟2 min；抗原修復(fù)，使用tris-EDTA(PH9.0)抗原修復(fù)液進(jìn)行標(biāo)本抗原修復(fù)，條件為97℃、30 min；修復(fù)完畢的切片在染色單元進(jìn)行全自動染色，一抗孵育條件為32℃、30 min，HRP 標(biāo)記的多聚物二抗孵育20 min，DAB 顯色反應(yīng)5 min，蘇木素襯染5 min。染色完畢的切片進(jìn)行脫水干燥，使用環(huán)保封片劑封片，鏡下觀察。結(jié)果由至少兩名病理科醫(yī)生判讀：染色的評分主要考慮著色強度及陽性細(xì)胞的百分率，著色強度分為無色(0 分)、淡棕色(1 分)、棕黃色(2 分)、棕褐色(3 分)；陽性細(xì)胞百分率：＜25% (1 分)，26%～50% (2 分)，51%～75% (3 分)，＞75%(4 分)，兩者得分相乘，＞4 分判定為高表達(dá)，否則為低表達(dá)。

1.4 隨訪 根據(jù)患者病歷上登記的聯(lián)系方式，使用電話或者門診進(jìn)行隨訪，隨訪開始時間為手術(shù)時間，隨訪結(jié)束時間為隨訪截止時間或術(shù)后死亡時間，隨訪時間截止至2019 年7 月16 日。無進(jìn)展生存時間(progression free survival time，PFS)指手術(shù)時間至首次復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時間或隨訪截止時間?？偵鏁r間(overall survival，OS)指手術(shù)時間至全因死亡時間或隨訪截止時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 基于公共數(shù)據(jù)庫的差異表達(dá)分析，數(shù)據(jù)來源于UCSC XENA (https://xenabrowser.net/datapages/)經(jīng)Toil流程[5]統(tǒng)一處理的TCGA和GTEx的TPM 格式RNAseq 數(shù)據(jù)。計數(shù)資料使用頻數(shù)(百分率)表示，比較STC2 在漿液性卵巢癌及正常對照組中的表達(dá)采用χ2檢驗或Fisher's 精確檢驗。差異基因表達(dá)分析時兩組間的差異比較，若滿足正態(tài)性檢驗，方差齊選用獨立樣本T檢驗，方差不齊選用Weltch t'test；若不滿足正態(tài)性檢驗使用Mann-WhitneyU檢驗。Kaplan-Meier 生存曲線用于預(yù)后分析，組間比較采用Log-rank檢驗。預(yù)后分析采用COX回歸模塊。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STC2 在泛癌中的表達(dá)差異 基于STC2 在TCGA 及GTEx 數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)差異分析顯示，STC2在多種癌種中存在差異表達(dá)，如圖1 所示，與正常對照組比較，STC2在腎上腺皮質(zhì)癌、膽管癌、結(jié)腸癌、腎透明細(xì)胞癌、卵巢癌等24 個癌種中均高表達(dá)，在胰腺癌、腎乳頭狀細(xì)胞癌、肺腺癌、甲狀腺癌等6 個癌種中均低表達(dá)。

圖1 STC2在泛癌中的表達(dá)差異Figure 1 Differential expression of STC2 in Pan-cancer

2.2 STC2 在泛癌中的預(yù)后價值 STC2 在泛癌中的預(yù)后分析提示，在腎上腺皮質(zhì)癌、膀胱尿路上皮癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等21個癌種(圖2展示了20個癌種)中，STC2表達(dá)的高低與患者的預(yù)后相關(guān)，除在腎透明細(xì)胞癌中，在其余的20 個癌種中STC2 表達(dá)高的患者預(yù)后更差。

圖2 STC2在泛癌中的預(yù)后價值Figure 2 Prognostic value of STC2 in Pan-cancer

2.3 泛癌中STC2 與免疫浸潤的相關(guān)性 STC2在泛癌中的表達(dá)水平與免疫浸潤的相關(guān)性分析顯示，在婦科腫瘤如卵巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌，消化道腫瘤如肝癌、食管癌、胃癌、直腸癌以及呼吸道腫瘤如肺腺癌及鱗癌等21個癌種中STC2的表達(dá)與腫瘤的免疫浸潤相關(guān)(圖3)。

圖3 泛癌中STC2與免疫浸潤的相關(guān)性Figure 3 Correlation between STC2 and immune invasion in Pan-caner

2.4 STC2在漿液性卵巢癌組織及正常卵巢組織中的表達(dá) 采用免疫組化檢測STC2在漿液性卵巢癌組織與正常卵巢組織中的表達(dá)(圖4)，102 例漿液性卵巢癌組織中STC2 高表達(dá)33 例(32.35%)，低表達(dá)69 例(67.65%)，26 例正常卵巢組織中STC2 高表達(dá)僅1 例(3.85%)，其余25例(96.15%)均為不表達(dá)或者表達(dá)量很低，且兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.002 3)，提示STC2可能是漿液性卵巢癌的診斷標(biāo)志物。

圖4 STC2在漿液性卵巢癌及正常卵巢組織中的表達(dá)(SP)Figure 4 Expression of STC2 in serous ovarian cancer and normal ovarian tissue(SP)

2.5 STC2表達(dá)水平與漿液性卵巢癌患者生存預(yù)后的關(guān)系 對收取的102例漿液性卵巢癌患者進(jìn)行隨訪(8 例患者失訪)，中位隨訪時間為18.94 個月，使用Kaplan-Meier 生存分析顯示：與STC2 低表達(dá)的患者比較，STC2 高表達(dá)的患者生存時間更長，預(yù)后更好(圖5A)，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)?；诠矓?shù)據(jù)庫中探針203438_at 以及203439_s_at 的預(yù)后數(shù)據(jù)，使用Kaplan-Meier Plotter 在線數(shù)據(jù)庫(https://kmplot.com/analysis/)，對STC2 在卵巢癌中漿液癌這一病理亞型中的預(yù)后進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在漿液性卵巢癌中STC2高表達(dá)組的生存時間更長，預(yù)后更好，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.022、0.006 4)，見圖5B、5C。

圖5 STC2在漿液性卵巢癌中的預(yù)后意義Figure 5 Prognostic significance of STC2 in serous ovarian cancer

3 討論

STC 是一種最早在硬骨魚鰓中發(fā)現(xiàn)的糖蛋白激素，其作用在于通過影響鈣離子內(nèi)流來降低細(xì)胞內(nèi)鈣的濃度，從而調(diào)節(jié)鈣磷穩(wěn)態(tài)[6-8]。后來，在人類及其

他哺乳動物中證實STC 由STC1 和STC2[9-10]組成，并廣泛分布于多種組織中。人類STC1 位于染色體8p11.2-p21，STC2 位于染色體5q33 或5q35[11-12]。其中STC2 在脊椎動物中高度保守，根據(jù)The Human Protein Atlas 數(shù)據(jù)庫顯示，STC2 廣泛表達(dá)于腎、卵巢、骨骼、神經(jīng)元和肌肉等多種組織，并在維持礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)腫瘤生長的過程中發(fā)揮重要作用，目前已在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)STC2 存在差異表達(dá)，且這種差異表達(dá)對患者的預(yù)后具有預(yù)測價值[3，13-16]。

本研究基于公共數(shù)據(jù)庫對STC2 在多種癌種中的差異表達(dá)、預(yù)后及免疫浸潤進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，STC2在24個癌種中均為高表達(dá)狀態(tài)，且其高表達(dá)狀態(tài)與20個癌種的患者更差的預(yù)后相關(guān)，進(jìn)一步分析提示，STC2的表達(dá)水平與21個癌種的免疫浸潤狀態(tài)相關(guān)，以上數(shù)據(jù)提示，STC2 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的作用。本文重點對STC2在卵巢癌樣本中表達(dá)水平進(jìn)行了驗證，結(jié)果提示STC2 在卵巢癌的表達(dá)明顯高于正常組，這與前文泛癌分析結(jié)果基本一致，從而互相印證。進(jìn)一步的預(yù)后分析顯示，在卵巢癌中STC2 高表達(dá)的患者生存時間更長，預(yù)后更好，提示STC2對患者的預(yù)后有預(yù)測價值。

文獻(xiàn)報道，STC2 與卵巢癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)，其可增加乏氧卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲，與患者的生存時間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[14]。此外，STC2 可下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，上調(diào)N-cadherin、Vimentin 以及基質(zhì)金屬蛋白MMPs-2 和9 的表達(dá)，并且通過調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖[15]。Law等[17]報道STC2在卵巢癌細(xì)胞系SKOV3、OVCAR3 及CaOV3 低表達(dá)。本文基于公共數(shù)據(jù)庫的分析，STC2 在多個癌種中存在差異表達(dá)，并且與多個癌種的患者預(yù)后及免疫浸潤存在明顯的相關(guān)性。無論是公共數(shù)據(jù)庫的漿液性卵巢癌隊列或者本地漿液性卵巢癌隊列的數(shù)據(jù)分析顯示，STC2蛋白在正常卵巢組織中表達(dá)很低，甚至不表達(dá)，但在高級別漿液性卵巢癌組織中高表達(dá)，表達(dá)越高預(yù)示著患者的生存時間更長，這與上述文獻(xiàn)中報道的似有不符，然而文獻(xiàn)報告中研究對象多為上皮性卵巢癌，而本文中的預(yù)后主要針對上皮性卵巢癌中漿液性這一病理亞型進(jìn)行的分析，上述的不一致意味著STC2在不同病理類型卵巢癌的發(fā)生及發(fā)展中的作用機制可能不同。臨床上，不同病理類型的卵巢癌在發(fā)病機制、生物學(xué)行為及預(yù)后亦存在較大差異，基于本文的這些發(fā)現(xiàn)，為臨床上后續(xù)進(jìn)一步研究STC2 在不同病理類型卵巢癌生物學(xué)中的作用以及引起這種差異可能的機制奠定基礎(chǔ)，體現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的理念，為STC2作為漿液性卵巢癌潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點提供理論依據(jù)。