己酮可可堿灌胃對急性肝性腦病大鼠腦水腫的改善作用及其機制

羅妙莎，羅玉梅，馮云，和水祥

西安交通大學第一附屬醫(yī)院消化內科，西安 710061

肝性腦病是肝臟疾病引發(fā)的神經精神異常綜合征，是嚴重肝臟疾病較為常見的并發(fā)癥之一。急性肝性腦病為急性肝功能衰竭相關肝性腦病，多數(shù)患者無明顯誘因及前驅癥狀，出現(xiàn)急性肝功能衰竭的臨床癥狀，并可在短期內由輕度意識障礙迅速陷入深度昏迷，甚至導致死亡。急性肝性腦病的主要病理生理特征是腦水腫，腦水腫發(fā)展的顱內高壓甚至腦疝已成為急性肝衰竭患者最主要的死亡原因之一［1］。然而目前針對急性肝性腦病的治療方法較為局限，因此開發(fā)新的藥物有助于改善患者的治療現(xiàn)狀［2-3］。水通道蛋白4（aquaporin4，AQP4）是水通道蛋白家族中的一員，在大腦中分布廣泛，參與調節(jié)水分子的跨膜轉運，維持腦組織內水的平衡，在腦水腫的形成與消散過程中發(fā)揮著重要作用［4］。研究［5］發(fā)現(xiàn)，在肝性腦病動物模型中檢測到AQP4的表達升高，提示其在肝性腦病腦水腫的發(fā)生中起到重要作用。甲基黃嘌呤衍生物己酮可可堿是一種磷酸二酯酶抑制劑，具有多種藥理作用，最初用于末梢循環(huán)障礙的治療。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其不僅是一種外周血管擴張劑，還具有較強的抗炎、抗免疫反應及抗纖維化作用，其臨床應用范圍也越來越廣泛［6-8］。近來研究［9-10］發(fā)現(xiàn)，己酮可可堿可通過抑制氧化應激反應、減少血管內皮細胞損傷，減輕腦缺血/再灌注損傷的腦水腫程度。但國內外有關己酮可可堿對急性肝性腦病及其腦水腫的作用研究鮮有報道。2021年9月1日—2022年8月31日，本研究通過制備急性肝性腦病大鼠模型，觀察了己酮可可堿灌胃對急性肝性腦病大鼠腦水腫的改善作用，并探討其作用機制，從而為臨床治療急性肝性腦病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大鼠、藥物、試劑及儀器 健康清潔級雄性Sprague Dawley（SD）大鼠60只，體質量（150 ± 20）g，由西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（陜）08-018。實驗動物在恒溫恒濕自然光線交替環(huán)境下給予自來水和普通嚙齒類動物飼料喂養(yǎng)。所有動物實驗均符合西安交通大學醫(yī)學部動物實驗中心管理委員會有關實驗動物管理和使用的規(guī)定。水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司，硫代乙酰胺、己酮可可堿、伊文思藍購自Sigma公司，兔抗大鼠AQP4抗體購自英國Abcam公司，RNA提取試劑盒、SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa公司，TNF-α ELISA試劑盒、IL-1β ELISA試劑盒購自武漢賽培生物，高速低溫離心機購自德國Eppendorf公司，酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司，PCR儀、垂直電泳槽、凝膠成像分析系統(tǒng)、Western 顯像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 動物分組、急性肝性腦病大鼠模型制備及己酮可可堿給予方法 將60只健康清潔級雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組，每組12只。實驗第1～3天，模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組給予硫代乙酰胺（Thioacetamide， TAA）200 mg/（kg·d）腹腔注射，連續(xù)注射3 d，制備急性肝性腦病大鼠模型；對照組給予等體積生理鹽水腹腔注射。實驗第4天起，己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠分別給予己酮可可堿50、100、200 mg/（kg·d）灌胃，模型組及對照組給予等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)7 d。為防止可能造成的低血糖、低血鉀及脫水癥狀，將大鼠飲用水調至含有0.23% NaCl、2.5%葡萄糖、0.1% KCl的混合溶液。

1.3 各組大鼠肝性腦病癥狀觀察

1.3.1 各組大鼠一般情況觀察 整個實驗期間密切觀察各組大鼠飲食、精神、運動、毛色等基本情況，連續(xù)7 d灌胃結束后稱取各組大鼠體質量。

1.3.2 各組大鼠精神狀態(tài)觀察 采用高架十字實驗。將大鼠置于中央平臺處，使其頭部面向其中一個開放臂，釋放后即開始記錄5 min內開臂進入次數(shù)百分比和開臂滯留時間百分比。

1.3.3 各組大鼠自發(fā)運動能力觀察 采用開場實驗。測試前將大鼠單獨放置于實驗場適應環(huán)境30 min，開始檢測時將大鼠放于敞箱中央，由檢測系統(tǒng)自動記錄5 min內活動狀態(tài)，測量指標為大鼠平均每分鐘自發(fā)運動距離以及中央活動時間百分比。

1.3.4 各組大鼠空間學習記憶能力觀察 采用Morris水迷宮實驗。將平臺隨機置于某一象限中央，將大鼠從平臺所在象限的對側處頭朝下放入水中，由水池上空的監(jiān)控系統(tǒng)跟蹤并記錄大鼠游泳軌跡，每次測試上限時間為120 s。若未找到平臺，則將大鼠手動置于平臺上停留20 s。當大鼠爬上平臺或設定的訓練時間已到時，計算機停止跟蹤記錄并自動計算出找平臺所需的時間，即尋臺潛伏期。

1.4 各組大鼠肝功能指標觀察 最后一次給藥間隔12 h后，給予10%的水合氯醛3～4 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，血樣標本送至西安交通大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，應用全自動生化分析儀檢測肝功能指標，包括血氨、ALT、AST。

1.5 各組大鼠腦水腫情況觀察

1.5.1 各組大鼠血腦屏障通透性觀察 大鼠迅速斷頭取腦，取同側半球稱濕重后置于甲酰胺（1 mL/100 mg腦組織）中，37 ℃避光孵育48 h，1500 r/min離心15 min，吸取上清液，酶標儀測定波長為632 nm處的OD值，繪制標準曲線，測算EB含量。大鼠血腦屏障通透性以大鼠腦內EB含量表示。

1.5.2 各組大鼠腦組織含水量測算 處死大鼠后，迅速取出完整腦組織，取同側大腦半球，除去嗅球、腦干、小腦，電子天平準確稱得濕重后置于100 ℃電熱恒溫干燥箱中烘烤48 h至恒重，兩次稱重誤差小于0.2 mg后稱取干重，計算腦組織含水量。腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.6 各組大鼠腦組織中AQP4 mRNA和蛋白檢測 ①采用實時定量PCR法檢測AQP4 mRNA。取腦組織加入TRIzol試劑提取RNA，將RNA逆轉錄為cDNA后進行PCR擴增。引物序列如下：AQP4正向引物為5'-AGGCAATGTGTGCACTGCTCTAAC-3'，反向引物為5'-GAAGGTGTCAACGTCACACAACAA-3'；GAPDH正向引物為5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'，反向引物為5'-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3'。反應條件：預變性95 ℃、3 min ，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。②采用Western blotting法檢測AQP4蛋白。將取樣腦組織用眼科剪剪切成細小的碎片，加入裂解液（1 mL/100 mg腦組織）裂解提取總蛋白，BCA法測定蛋白定量。配制分離膠盒濃縮膠，上樣后電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉。加入一抗，4 ℃孵育過夜，次日加入二抗，室溫下孵育1 h。Image J軟件分析目的蛋白與內參蛋白的灰度比值，作為目的蛋白的相對表達量。

1.7 各組大鼠腦組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β檢測 采用ELISA法。取2塊腦皮質加入冷PBS進行勻漿，12000 r/min離心20 min，取上清，用ELISA試劑盒測定TNF-α和IL-1β水平，操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料呈正態(tài)分布時以±s表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝性腦病癥狀比較

2.1.1 各組大鼠一般情況比較 對照組大鼠活動自如，自由飲食飲水；模型組和己酮可可堿低劑量組大鼠毛色蓬亂、黯淡、不光潔，活動減少，精神萎靡，食欲不振，對外界刺激反應遲鈍；己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組較模型組大鼠一般情況有所好轉。

對照組和模型組大鼠體質量分別為（250.7 ±11.2）g、（185.6 ± 10.4）g，兩組相比，P＜0.05。模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠體質量分別為（185.6 ±10.4）g、（190.1 ± 9.2）g、（228.8 ± 13.1）g、（241.0 ±12.9）g，其中己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠體質量均高于模型組（P均＜0.05）。

2.1.2 各組大鼠精神狀態(tài)比較 對照組和模型組大鼠開臂進入次數(shù)百分比、開臂滯留時間百分比分別為19.86% ± 3.07%、15.73% ± 2.64%和10.01% ± 1.86%、5.19% ± 1.15%，兩組相比，P均＜0.05。

模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠開臂進入次數(shù)百分比分別為10.01% ± 1.86%、11.34% ± 2.51%、13.49% ± 2.18%、17.37% ± 2.46%，其中己酮可可堿高劑量組大鼠開臂進入次數(shù)百分比高于模型組（P＜0.05）。模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠開臂滯留時間百分比分別為5.19% ± 1.15%、7.22% ±2.48%、8.81% ± 2.45%、11.99% ± 3.03%，其中己酮可可堿高劑量組大鼠開臂滯留時間百分比高于模型組（P＜0.05）。

2.1.3 各組大鼠自發(fā)運動能力比較 對照組和模型組大鼠平均每分鐘自發(fā)運動距離、中央活動時間百分比分別為（22.13 ± 1.99）m、5.92% ± 0.33%和（12.59 ± 2.81）m、2.12% ± 0.45%，兩組相比，P均＜0.05。

模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠平均每分鐘自發(fā)運動距離分別為（12.59 ± 2.81）m、（15.27 ± 2.04）m、（16.80 ± 1.75）m、（19.91 ± 1.24）m，其中己酮可可堿高劑量組大鼠平均每分鐘自發(fā)運動距離高于模型組（P＜0.05）。模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠中央活動時間百分比分別為2.12% ± 0.45%、3.55% ±1.01%、4.79% ± 1.56%、5.28% ± 0.71%，其中己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠中央活動時間百分比均高于模型組（P均＜0.05）。

2.1.4 各組大鼠空間學習記憶能力比較 對照組和模型組大鼠尋臺潛伏期分別為（13.98 ± 3.31）s、（69.10 ± 5.28）s，兩組相比，P＜0.05。

模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠尋臺潛伏期分別為（69.10 ± 5.28）s、（60.37 ± 4.96）s、（58.29 ± 5.15）s、（39.41 ± 4.08）s，其中己酮可可堿高劑量組大鼠尋臺潛伏期較模型組明顯縮短（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠血氨、ALT、AST水平比較 對照組大鼠血氨、ALT、AST水平分別為（42.2 ±8.1）μmol/L、（43.7 ± 7.06）U/L、（110.1 ± 13.3）U/L，模型組大鼠血氨、ALT、AST水平分別為（196.7 ±19.3）μmol/L、（355.4 ± 23.9）U/L、（520.0 ±26.4）U/L，兩組相比，P均＜0.05。

模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠血氨水平分別為（196.7 ± 19.3）μmol/L、（189.0 ± 13.2）μmol/L、（174.6 ± 16.4）μmol/L、（168.3 ± 15.8）μmol/L，其中己酮可可堿高劑量組大鼠血氨水平較模型組下降（P＜0.05）。模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠ALT水平分別為（355.4 ± 23.9）U/L、（327.6 ± 14.7）U/L、（237.3 ± 21.5）U/L、（237.3 ± 21.5）U/L，其中己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠血清ALT水平較模型組下降（P均＜0.05）。模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠AST水平分別為（520.0 ± 26.4）U/L、（486.7 ± 20.8）U/L、（385.3 ± 25.0）U/L、（371.2 ±26.4）U/L，其中己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠血清AST水平較模型組下降（P均＜0.05）。

2.3 各組大鼠腦水腫情況比較

2.3.1 各組大鼠血腦屏障通透性比較 對照組和模型組大鼠腦內EB含量分別為（0.75 ± 0.08）μg/g、（1.83 ± 0.28）μg/g，兩組相比，P＜0.05。

模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠腦內EB含量分別為（1.83 ± 0.28）μg/g、（1.66 ± 0.23）μg/g、（1.48 ±0.32）μg/g、（0.97 ± 0.13）μg/g，其中己酮可可堿高劑量組大鼠腦內EB含量較模型組明顯下降（P＜0.05）。

2.3.2 各組大鼠腦組織含水量檢測 對照組與模型組大鼠腦組織含水量分別為76.0% ± 2.6%、85.0% ± 2.0%，兩組相比，P＜0.05。

模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠腦組織含水量分別為85.0% ± 2.0%、84.1% ± 1.8%、83.4.% ± 2.1%、79.7% ± 1.2%，其中己酮可可堿高劑量組大鼠腦組織含水量較模型組下降（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠腦組織中AQP4 mRNA和蛋白相對表達量比較 對照組和模型組大鼠腦組織中AQP4 mRNA和蛋白的相對表達量分別為0.10 ±0.02、0.16 ± 0.03和0.20 ± 0.04、0.31 ± 0.05，兩組相比，P均＜0.05。

模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠腦組織中AQP4 mRNA相對表達量分別為0.31 ± 0.05、0.30 ± 0.07、0.29 ± 0.03、0.18 ± 0.04，其中己酮可可堿高劑量組大鼠腦組織中AQP4 mRNA相對表達量較模型組下降顯著（P＜0.05）。模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠腦組織中AQP4蛋白相對表達量分別為（0.20 ± 0.04）、（0.18 ± 0.05）、（0.16 ± 0.06）、（0.11 ± 0.03），其中己酮可可堿高劑量組大鼠腦組織中AQP4蛋白相對表達量較模型組下降顯著（P＜0.05）。

2.5 各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β水平比較 對照組和模型組大鼠腦組織中TNF-α、IL-1β水平分別為（42.9 ± 6.4）pg/mL、（74.1 ± 5.6）pg/mL和（188.3 ± 20.1）pg/mL、（411.8 ± 22.0）pg/mL，兩組相比，P均＜0.05。

模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠腦組織中TNF-α水平分別為（188.3 ± 20.1）pg/mL、（181.7 ± 17.0）pg/mL、（178.6 ± 18.3）pg/mL、（163.2 ± 11.4）pg/mL，其中己酮可可堿高劑量組大鼠腦組織中TNF-α水平較模型組下降（P＜0.05）。模型組、己酮可可堿低劑量組、己酮可可堿中劑量組、己酮可可堿高劑量組大鼠腦組織中IL-1β水平分別為（411.8 ± 22.0）pg/mL、（381.6 ± 17.6）pg/mL、（378.3 ± 18.1）pg/mL、（348.4 ± 19.8）pg/mL，其中己酮可可堿高劑量組大鼠腦組織中IL-1β水平較模型組下降（P＜0.05）。

3 討論

己酮可可堿是一種非選擇性磷酸二酯酶抑制劑，可抑制磷酸二酯酶減少細胞內環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水解為5'-磷酸腺苷，增加細胞內cAMP的水平，誘導細胞發(fā)生相應變化，抑制細胞的鈣離子內流，具有擴血管、改善微循環(huán)、改善細胞缺氧、抗炎、抗氧化以及免疫調節(jié)等作用［11-12］。我們早前的研究已經證實，在急性肝損傷大鼠模型中，己酮可可堿可通過清除體內過多自由基及減輕脂質過氧化作用，減少肝細胞的損傷，改善肝組織的病理變化，從而對急性肝損傷的發(fā)生、發(fā)展起到一定的抑制作用［13］。在對肝性腦病的研究中證實，氨代謝障礙并不能獨立解釋肝性腦病的所有神經改變，肝性腦病患者的炎性標志物水平明顯增加，抑制炎癥反應，不僅可以延遲肝性腦病的發(fā)生，還能減輕其腦水腫的程度。近來的研究發(fā)現(xiàn)，己酮可可堿的抗炎、抗氧化作用還可以有效減輕腦缺血/再灌注損傷的腦水腫程度。而有關己酮可可堿是否對肝性腦病腦水腫具有作用，目前研究較少。

水通道蛋白在機體內分布的范圍比較廣泛，它們大多數(shù)選擇性地分布在與體液吸收或分泌相關的細胞及可能協(xié)同跨細胞轉運的內皮細胞中，執(zhí)行著各部位水分的重吸收、液體分泌和細胞內外水平衡功能。AQP4是中樞神經系統(tǒng)最主要的水通道蛋白，對維持構成血腦屏障通透性及腦內水平衡至關重要［4］。腦水腫的形成與AQP4表達升高有著密切的關系，AQP4可能參與急性HE腦水腫的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究通過建立急性肝性腦病模型，并給予不同劑量己酮可可堿干預治療，結果顯示模型組大鼠出現(xiàn)活動減少、精神萎靡、食欲不振，對外界刺激反應遲鈍，體質量明顯減輕，大鼠表現(xiàn)出肝性腦病的癥狀。進一步通過行為學測試發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠明顯出現(xiàn)探索活動減少、學習記憶能力下降及精神障礙等異常表現(xiàn)，而己酮可可堿高劑量組大鼠上述肝性腦病癥狀則得到明顯改善。通過對各組大鼠血清學指標的檢測發(fā)現(xiàn)，己酮可可堿高劑量組可有效降低急性肝性腦病大鼠血氨及血清中AST、ALT水平，高劑量己酮可可堿對大鼠的肝功能有顯著改善作用。在對各組大鼠腦水腫情況的檢測中發(fā)現(xiàn)，己酮可可堿高劑量組大鼠的腦組織中EB含量及腦組織含水量均較模型組下降，表明高劑量己酮可可堿在一定程度上可改善肝性腦病大鼠腦水腫情況，并通過降低血腦屏障的通透性以改善腦水腫程度；進一步通過PCR、Western blotting檢測進一步發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，己酮可可堿高劑量組AQP4 mRNA及蛋白相對表達量均顯著下降。因此，我們推測高劑量己酮可可堿能有效減輕急性肝性腦病大鼠腦水腫情況，降低血腦屏障通透性，其機制可能與下調肝性腦病大鼠腦組織中AQP4的表達有關。

細胞因子是一組與免疫活化和炎癥反應相關的可溶性多肽介質，正常情況下細胞因子不能通過血腦屏障，但在腦損傷時血腦屏障被破壞，使細胞因子透過被破壞的血腦屏障進入腦實質，同時細胞因子也可直接破壞血腦屏障，使其通透性增加，直接或間接作用于神經膠質細胞，誘發(fā)其分泌產生更多的細胞因子或使神經膠質細胞表面表達更多的細胞因子受體，從而釋放各種神經毒性因子，如氧自由基，進一步破壞血腦屏障和損傷細胞膜，產生和加重血管源性及細胞毒性腦水腫［14-16］。而炎癥因子IL-1β、TNF-a能介導星形膠質細胞AQP4表達上調和腦水腫的形成［17］。本研究結果顯示，與模型組相比，己酮可可堿高劑量組能抑制TAA誘導的急性肝性腦病腦組織中TNF-α和IL-1β的水平，因此我們推測己酮可可堿可能通過降低肝性腦病腦組織中細胞炎癥因子TNF-α和IL-1β的水平，抑制炎癥反應，從而下調腦組織的AQP4表達，減輕腦水腫。

綜上所述，200 mg/（kg·d）己酮可可堿灌胃能改善急性肝性腦病大鼠的腦水腫，其機制可能與下調腦組織中AQP4表達、降低TNF-α和IL-1β水平有關。這為肝性腦病腦水腫的臨床治療提供了新的思路，未來有待開展高質量的研究，以期進一步研究其具體的分子作用機制。