乳桿菌發(fā)酵對茯苓的成分和抗氧化能力的影響

孟濤，冀利峰，杜川川，馬彪，曹剛剛

安徽古井健康科技有限公司（亳州 236800）

茯苓是我國傳統(tǒng)上既是食品又是藥品的物質(zhì)之一[1]。茯苓具有利水滲濕、健脾、寧心之功效[2]。茯苓具有多種活性成分，包括但不限于多糖類、三萜類、甾醇類及其衍生物[3-5]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)，茯苓多糖和三萜在抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗炎等方面具有一定作用[6-9]。關于茯苓中總黃酮和多酚的相關研究文獻報道較少。

微生物發(fā)酵技術特異性強、副產(chǎn)物少、條件溫和而且清潔環(huán)保，因此在中藥轉化領域具有獨特優(yōu)勢[10-11]。而作為發(fā)酵核心的益生菌又起著決定性作用[12]?；谥兴幉脑系奶厥庑?，探究不同菌株對原料的發(fā)酵性能，并篩選適宜特定中藥發(fā)酵的益生菌，具有重要的科學意義和應用價值[13-14]。

以茯苓為研究對象，利用實驗室保藏的三株對植物性原料耐受性強、發(fā)酵轉化率高的乳桿菌進行發(fā)酵，通過檢測茯苓發(fā)酵前后的主要活性成分和抗氧化性，即總黃酮、總酚、總三萜的含量和ABTS+自由基、羥自由基、DPPH自由基清除率的變化，對益生菌發(fā)酵在食藥兩用茯苓深加工中的應用進行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓、白砂糖（市售）；植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2、鼠李糖乳桿菌YS-3（經(jīng)過選育的適宜植物類原料發(fā)酵的菌種，保藏于實驗室）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、碳酸鈉、氫氧化鈉、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、水楊酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉、氯化鉀（國藥集團化學試劑有限公司）；蘆丁[純度≥95%，生工生物工程（上海）股份有限公司]；維生素C（L-抗壞血酸，純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）；ABTS+、DPPH、沒食子酸、福林-酚、無水乙醇、香草醛、齊墩果酸、冰乙酸、高氯酸、過氧化氫（上海麥克林生化科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

Infinite F50酶標儀（瑞士TECAN公司）；ME104E電子天平（梅特勒-托利多國際有限公司）；DK-S28電熱恒溫水浴鍋、DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）；DK-8D三溫三控水槽、YXQ-50A立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；TG16-WS臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；SW-CJ-1D凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

挑選干燥、無霉變的茯苓塊，除去雜質(zhì)，自來水沖洗后用無菌水洗凈，勻漿，紗布過濾汁液用于發(fā)酵。稱取500.0 g茯苓汁置于無菌密封罐中，加入5%白砂糖，攪拌溶解，于121 ℃滅菌15 min，接種5%乳桿菌菌種液（1×108CFU/mL），于37 ℃密封恒溫發(fā)酵7 d，每隔2 d放氣1次，發(fā)酵結束后過濾得濾液，按6 000 r/min離心15 min，獲得上清液，備用。取上清液，調(diào)整pH至中性，稀釋到適宜濃度用于自由基清除率的檢測分析。相關發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化在前期研究已完成。

1.3.2 總黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[15]建立標準曲線和樣品檢測，以蘆丁為標準品，檢測波長510 nm，標準曲線方程為y=1.496 2x+0.001 4，R2=0.999 7。根據(jù)樣品檢測的吸光度得出樣品中總黃酮的蘆丁當量。

1.3.3 總酚含量的測定

采用福林-酚法[16]。檢測波長760 nm，沒食子酸標準曲線方程為y=0.001 1x+0.005 2，R2=0.999 5。根據(jù)樣品檢測的吸光度得出總酚的沒食子酸當量。

1.3.4 總三萜含量的測定

采用高氯酸-香草醛比色法[16]測定總三萜含量。以齊墩果酸為標準品，檢測波長550 nm，標準曲線方程為y=12.435 2x-0.041 3，R2=0.998 8。根據(jù)齊墩果酸標準曲線計算出樣品中總三萜含量。

1.3.5 ABTS+自由基清除率的測定

參照謝國芳等[17]的測定方法，檢測波長734 nm，維生素C作陽性對照，按式（1）計算ABTS+自由基清除率。

式中：A1為樣品加ABTS+工作液反應后的吸光度；A2為樣品加蒸餾水的吸光度；A0為蒸餾水空白對照的吸光度。

1.3.6 羥自由基清除率的測定

參照譚榮華等[18]的測定方法，檢測波長510 nm。以維生素C作為陽性對照。羥自由基清除率的計算參照式（2）。

式中：A1為樣品加H2O2反應體系反應后的吸光度；A2為樣品加蒸餾水的吸光度；A0為蒸餾水空白對照的吸光度。

1.3.7 DPPH自由基清除率的測定

采用比色法測定[19]，檢測波長517 nm。以維生素C作為陽性對照。DPPH自由基清除率的計算參照式（3）。

式中：A1為樣品加DPPH溶液反應后的吸光度；A2為樣品加蒸餾水的吸光度；A0為蒸餾水空白對照的吸光度。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗做3個平行，數(shù)據(jù)采用平均值表示。取得各項檢測數(shù)據(jù)后采用Origin 8.0軟件繪圖，采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 總黃酮含量的變化

如圖1所示，茯苓漿（即對照，下同）發(fā)酵前總黃酮含量均值為2.4 g/L，經(jīng)植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2和鼠李糖乳桿菌YS-3分別發(fā)酵后，發(fā)酵液總黃酮含量分別達到4.2，3.7和3.1 g/L，均有顯著提升（P＜0.05）。特別是經(jīng)植物乳桿菌YS-1發(fā)酵的茯苓總黃酮含量比發(fā)酵前提高75%。

圖1 乳桿菌發(fā)酵前后的總黃酮含量變化情況

2.2 總酚含量的變化

如圖2所示，茯苓漿發(fā)酵前總酚含量為4.2 g/L，經(jīng)植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2和鼠李糖乳桿菌YS-3分別發(fā)酵后，發(fā)酵液的總酚含量分別達到6.5，6.2和5.8 g/L，均有顯著提升（P＜0.05）。經(jīng)植物乳桿菌YS-1發(fā)酵的茯苓總酚含量比發(fā)酵前提高55%。

圖2 乳桿菌發(fā)酵前后的總酚含量變化情況

2.3 總三萜含量的變化

如圖3所示，茯苓漿發(fā)酵前總三萜含量為5.5 g/L，經(jīng)植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2和鼠李糖乳桿菌YS-3分別發(fā)酵后，發(fā)酵液的總三萜含量分別為7.9，6.8和4.3 g/L，經(jīng)植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2發(fā)酵的茯苓總三萜含量顯著提升（P＜0.05），經(jīng)鼠李糖乳桿菌YS-3發(fā)酵后總三萜含量下降。其中，經(jīng)植物乳桿菌YS-1發(fā)酵后提升幅度達到44%。綜上，在3株乳桿菌中，植物乳桿菌YS-1對茯苓的抗氧化成分發(fā)酵性能最佳。

圖3 乳桿菌發(fā)酵前后的總三萜含量變化情況

2.4 ABTS+自由基清除率的變化

如圖4所示，茯苓漿發(fā)酵前對ABTS+自由基清除率為62%，經(jīng)植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2和鼠李糖乳桿菌YS-3分別發(fā)酵后，發(fā)酵液對ABTS+自由基清除率分別為77%，81%和69%。其中，經(jīng)植物乳桿菌YS-2發(fā)酵后對ABTS+自由基清除率最高，稍高于植物乳桿菌YS-1。

圖4 乳桿菌發(fā)酵前后的ABTS+自由基清除率變化情況

2.5 羥自由基清除率的變化

如圖5所示，茯苓漿發(fā)酵前對羥自由基清除率為68%，經(jīng)植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2和鼠李糖乳桿菌YS-3分別發(fā)酵后，發(fā)酵液對羥自由基的清除率分別為75%，77%和62%。其中，經(jīng)植物乳桿菌YS-2發(fā)酵的茯苓漿對羥自由基清除率稍高于植物乳桿菌YS-1。經(jīng)鼠李糖乳桿菌YS-3發(fā)酵的茯苓漿對羥自由基清除率稍有下降。

圖5 乳桿菌發(fā)酵前后的羥自由基清除率變化情況

2.6 DPPH自由基清除率的變化

如圖6所示，茯苓漿發(fā)酵前對DPPH自由基清除率為55%，經(jīng)植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2和鼠李糖乳桿菌YS-3分別發(fā)酵后，發(fā)酵液對DPPH自由基的清除率分別為88%，72%和62%。經(jīng)植物乳桿菌YS-1發(fā)酵后顯著提升，比發(fā)酵前提高33%。綜上，植物乳桿菌YS-1和YS-2發(fā)酵茯苓可顯著提高其對3種自由基的清除率。

圖6 乳桿菌發(fā)酵前后的DPPH自由基清除率變化情況

3 結論

試驗研究了茯苓經(jīng)乳桿菌發(fā)酵前后的抗氧化成分和抗氧化能力的變化。經(jīng)檢測，茯苓原漿的總黃酮、總酚、總三萜含量分別為2.4，4.2和5.5 g/L，經(jīng)植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2分別發(fā)酵后，3種成分含量均顯著提高。經(jīng)植物乳桿菌YS-1發(fā)酵后的總黃酮、總酚、總三萜含量均最高，分別達到4.2，6.5和7.9 g/L?？寡趸煞值暮匡@著提升。茯苓原漿對ABTS+自由基、羥自由基、DPPH自由基清除率分別為62%，68%和55%，經(jīng)植物乳桿菌YS-1、植物乳桿菌YS-2分別發(fā)酵后，發(fā)酵液對3種自由基清除能力比發(fā)酵前均有明顯提高。平均而言，植物乳桿菌YS-1發(fā)酵后提升更明顯。ABTS+自由基、羥自由基、DPPH自由基清除率分別達到77%，75%和88%。經(jīng)鼠李糖乳桿菌YS-3發(fā)酵后的茯苓總三萜含量下降，且對羥自由基清除率也稍有降低。試驗表明3株乳桿菌發(fā)酵的茯苓特征成分含量和抗氧化性具有較大差異。植物乳桿菌YS-1發(fā)酵對提升茯苓抗氧化成分含量和自由基清除率最佳。