銅藻中巖藻黃素的提取工藝優(yōu)化與含量測定

邢紫風，弓澤華，盛滟，李源，楊絲月，凌俊紅

浙江海洋大學食品與藥學學院（舟山 316022）

銅藻（Sargassum horneri）屬褐藻門墨角藻目馬尾藻科馬尾藻屬的大型海藻，在我國主要分布于遼寧、浙江、福建及廣東等地[1]。銅藻中主要有褐藻糖膠、褐藻多酚、巖藻黃素、膳食纖維、脂肪酸、多糖等成分[2-4]，在食品、飼料、醫(yī)藥等領域具有良好的應用前景[5-6]。

巖藻黃素是褐藻和微藻（硅藻）產生的一種類胡蘿卜素類天然產物，占天然類胡蘿卜素總產量的10%以上[7-9]。巖藻黃素含有獨特的高度共軛不飽和系統(tǒng)[10-11]，賦予該化合物優(yōu)良的抗氧化、抗肥胖、抗炎及抗癌活性[12-16]。鑒于動物自身無法合成像類胡蘿卜素類化合物[17]，因此巖藻黃素作為高附加值海洋功能食品、食用色素及海洋藥物先導化合物具有很高的經濟價值和科學研究價值[15,18-20]。巖藻黃素的提取方法有溶劑浸提法[21]、超聲輔助提取法[22]、酶提取法[23]、超臨界流體萃取法[24]等，超聲輔助提取法具有操作簡單、高提取率等優(yōu)點。因此為研究巖藻黃素在海藻中的生物量，以銅藻為研究對象，優(yōu)化巖藻黃素的提取工藝，測定其在銅藻中的含量，以期對銅藻進一步開發(fā)和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV2600紫外可見分光光度計[島津儀器（蘇州）有限公司]；G-100S超聲波清洗器（深圳市歌能清洗設備有限公司）；OHAUS EX125DZH分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；Vortex-Genie 2渦旋儀（美國Scientific Industries公司）。

甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮（均為分析純）；所用水為二次蒸餾水；巖藻黃素對照品（純度大于95%，山東潔晶集團有限公司）；銅藻[尋山集團有限公司（山東）]。

1.2 試驗方法

1.2.1 對照品儲備液的制備

精密稱取13.2 mg巖藻黃素對照品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到1.32 mg/mL溶液，精密吸取1 mL上述溶液置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到0.132 mg/mL對照品儲備溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備

稱取1.0 g銅藻，置錐形瓶中，加40 mL甲醇，稱重，于60 ℃超聲提取2次（200 W和53 kHz），每次45 min，用甲醇補足質量，合并2次提取液，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

1.2.3 測定波長的確定

精密吸取1 mL“1.2.1”項的對照品儲備液置100 mL量瓶，用甲醇定容至刻度，搖勻，得到1.32 μg/mL溶液，使用紫外可見分光光度儀，在200～800 nm波長范圍內對其進行光譜掃描，確定選用447 nm作為巖藻黃素測定的波長。

1.2.4 標準曲線的建立

精密吸取適量“1.2.1”項的對照品儲備液，配制成8.80，6.60，3.30，1.65，0.83和0.55 μg/mL系列標準質量濃度溶液，以甲醇為參比，用紫外可見分光光度儀在447 nm波長處測定吸光度。

1.2.5 銅藻中巖藻黃素的測定

稱取1.0 g銅藻，按“1.2.2”項的方法制備3份供試品溶液，測定吸光度，根據標準曲線計算即得巖藻黃素含量。

1.2.6 單因素試驗

1.2.6.1 提取溶劑考察

稱取1.0 g銅藻樣品，置錐形瓶中，按樣品質量的10倍體積數(shù)（mL）分別加入甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮，在室溫下超聲提取30 min，提取液稀釋后測定吸光度，根據標準曲線計算巖藻黃素含量，比較不同溶劑對巖藻黃素含量的影響。

1.2.6.2 溶劑體積考察

稱取1.0 g銅藻樣品，置錐形瓶中，分別按樣品質量的10，20，30，40和50倍體積數(shù)（mL）加入甲醇，在室溫下超聲提取30 min，提取液稀釋后測定吸光度，根據標準曲線計算巖藻黃素含量，比較溶劑體積對巖藻黃素含量的影響。

1.2.6.3 提取時間考察

稱取1.0 g銅藻樣品，置錐形瓶中，按樣品質量的10倍體積數(shù)（mL）加入甲醇，在室溫下分別超聲提取10，30，45和60 min，提取液稀釋后測定吸光度，根據標準曲線計算巖藻黃素含量，比較提取時間對巖藻黃素含量的影響。

1.2.6.4 提取溫度考察

稱取1.0 g銅藻樣品，置錐形瓶中，按樣品質量的10倍體積數(shù)（mL）加入甲醇，分別在25，45，60和75 ℃條件下超聲提取30 min，提取液稀釋后測定吸光度，根據標準曲線計算巖藻黃素含量，比較提取溫度對巖藻黃素含量的影響。

1.2.6.5 提取次數(shù)考察

稱取1.0 g銅藻樣品，置錐形瓶中，按樣品質量的10倍體積數(shù)（mL）加入甲醇，在室溫下分別超聲提取1，2和3次，每次45 min，提取液稀釋后測定吸光度，根據標準曲線計算巖藻黃素含量，比較提取次數(shù)對巖藻黃素含量的影響。

2 結果與分析

2.1 巖藻黃素含量測定方法學研究

2.1.1 標準曲線

以吸光度（A）為縱坐標，質量濃度（C）為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，巖藻黃素在0.55～8.80 μg/mL范圍內呈現(xiàn)良好線性關系，回歸方程為A=0.109 9C-0.007 1，r=0.999 3。

2.1.2 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液，重復測定6次，記錄吸光度，巖藻黃素吸光度的SRSD為0.44%（表1），說明該方法精密度良好。

表1 精密度試驗結果（n=6）

2.1.3 重復性試驗

按“1.2.2”項的方法平行制備6份供試品溶液，測定吸光度，計算得出巖藻黃素含量的SRSD為3.1%（見表2）。

表2 重復性試驗結果（n=6）

2.1.4 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，10，12和24 h測定，記錄吸光度。巖藻黃素吸光度的SRSD為3.0%（見表3）。結果表明供試品溶液在制備后24 h內穩(wěn)定。

表3 穩(wěn)定性試驗結果（n=8）

2.1.5 回收率試驗

采用加樣回收法。精密稱取9份1.0 g已知含量的銅藻樣品，分別精密加入適量高、中、低3種質量濃度的對照品溶液，按“1.2.2”項的操作，制成加樣回收率供試液，在447 nm波長下測定吸光度，計算回收率。結果顯示，平均回收率為98.7%，SRSD為1.9%（見表4）。

表4 銅藻中巖藻黃素的回收率試驗（n=9）

2.2 銅藻中巖藻黃素的含量

以“1.2.5”項制備的供試品溶液中巖藻黃素含量按式（1）計算，結果分別為518.1，517.8和521.6 μg/g，巖藻黃素的平均含量為519.2 μg/g。

式中：C為樣品溶液中巖藻黃素的質量濃度，μg/mL；V為樣品溶液體積，mL；M為銅藻質量，g。

2.3 單因素試驗

以巖藻黃素含量為指標，單因素試驗結果如圖1～圖5所示。

圖1 提取溶劑對巖藻黃素含量的影響

圖2 提取溶劑體積對巖藻黃素含量的影響

圖3 提取時間對巖藻黃素含量的影響

圖4 提取溫度對巖藻黃素含量的影響提取2次時，巖藻黃素含量最高。

圖5 提取次數(shù)對巖藻黃素含量的影響

結果表明，巖藻黃素在甲醇溶劑中含量最高，在乙醇溶劑中次之。

提取溶劑用量從10倍增加到50倍，在40倍量時巖藻黃素含量最大，但增加到50倍有小幅下降。

巖藻黃素含量隨著提取時間的延長總體趨勢是先上升，至45 min時趨于穩(wěn)定，但在60 min時出現(xiàn)小幅下降，這可能是由于巖藻黃素穩(wěn)定性差，時間長使其被破壞。

巖藻黃素的含量隨著提取溫度的升高總體趨勢是先上升，至60 ℃時最高，但在75 ℃時明顯下降，這可能是由于巖藻黃素熱穩(wěn)定性差，高溫會使其破壞。

3 討論

3.1 最優(yōu)的提取工藝

銅藻中巖藻黃素的含量十分豐富，是一種理想的巖藻黃素提取原料，而超聲輔助法提取巖藻黃素的提取效率高、方便快捷。提取溶劑的考察，選取4種常用的溶劑，提取效果是甲醇＞乙醇＞丙酮＞乙酸乙酯，可能由于甲醇的穿透能力強于其他3種溶劑，故甲醇提取效果最好。而溶劑用量、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)考察以單因素試驗得出，最優(yōu)條件為提取溶劑甲醇、固液比1∶40（g/mL）、提取溫度60℃、提取次數(shù)2次，每次45 min。

3.2 試驗中的注意事項

由于巖藻黃素遇光不穩(wěn)定，極易分解，故在試驗過程中要保持避光。

制備的供試品溶液中存在細小粉末雜質，干擾測定。因此在測定前使用0.22 μm微孔濾膜濾過供試品溶液。

3.3 分析方法的驗證

建立紫外可見分光光度法測定銅藻中巖藻黃素含量的方法，并通過線性、精密度、重復性、穩(wěn)定性、提取回收率等方法進行驗證，試驗結果顯示，在0.55～8.80 μg/mL范圍內，巖藻黃素質量濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關系（回歸方程為A=109.95C-0.007 1，相關系數(shù)r=0.999 3），精密度SRSD為0.44%，重復性SRSD為3.1%，回收率為96.6%～102.2%，證明建立的紫外可見分光光度法適合于測定銅藻中巖藻黃素含量，最終測得銅藻中巖藻黃素的平均含量為519.2 μg/g。

4 結論

通過超聲輔助法從銅藻中提取巖藻黃素，以提取含量為考察指標，在單因素試驗基礎上優(yōu)化巖藻黃素的提取工藝，研究得出巖藻黃素最佳提取工藝：提取溶劑甲醇、固液比1∶40（g/mL）、提取溫度60 ℃、提取次數(shù)2次，每次45 min。最優(yōu)工藝條件下得到的銅藻中巖藻黃素的平均含量為519.2 μg/g。研究試驗數(shù)據為銅藻的進一步開發(fā)應用提供理論依據和技術參考。