免疫細胞調控頜骨穩(wěn)態(tài)及損傷修復的研究進展

鐘嘉偉,潘 劍,2,郭雨晨,2

頜骨作為顱頜面的基本硬組織框架,是口頜系統(tǒng)功能及外形的基礎。但是,全球有超過35億人受到口頜系統(tǒng)疾病的影響。其中,發(fā)育畸形、牙周病、外傷、癌癥等疾病均導致顱頜面骨的損傷[1]。目前,上述病損的修復僅局限于手術及假體的修復,缺乏有效的生物學重建手段[2]。研究頜骨的穩(wěn)態(tài)以及損傷修復機制是尋找新治療靶點的突破口。

骨骼是一個動態(tài)變化的系統(tǒng),在整個生命過程中不斷重塑[3]。機體通過復雜的機制對這一過程進行精密調控,其中免疫系統(tǒng)在骨穩(wěn)態(tài)和損傷修復中起著關鍵的作用。2000年,Arron和Choi首次提出骨免疫學的概念,強調骨骼和免疫系統(tǒng)之間的雙向動態(tài)作用關系[4]。隨著研究深入,骨和免疫系統(tǒng)的相互作用逐步明確。骨免疫是指骨代謝過程受到免疫反應的調節(jié);同時,骨細胞對免疫系統(tǒng)也有著調節(jié)作用。這樣的一個雙向調控作用稱為骨免疫。

免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細胞和免疫活性物組成。其中對骨穩(wěn)態(tài)和修復發(fā)揮調控作用的主要是免疫細胞。免疫細胞系來源于多能干細胞,其中造血多能干細胞產生兩種前體細胞,一種是淋巴樣前體細胞,另一種是髓系前體細胞。淋巴樣前體細胞主要分化為T細胞(T-lymphocyte)、B細胞(B-lymphocyte)、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)和樹突狀細胞;而髓系前體細胞主要分化為紅母細胞、巨核細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和粒-單核干細胞,其中粒-單核干細胞可進一步分化為中性粒細胞、單核細胞和樹突狀細胞。T細胞、B細胞等數(shù)種免疫細胞對骨穩(wěn)態(tài)的作用已有較多研究,但是,上述免疫細胞對頜骨穩(wěn)態(tài)和損傷修復的調控作用及機制還尚處于研究起始階段。本文系統(tǒng)性回顧免疫細胞對骨穩(wěn)態(tài)的作用機制,并結合目前骨免疫在頜骨穩(wěn)態(tài)中的研究進展,旨在為后續(xù)的研究提供思路。

1 T細胞對頜骨穩(wěn)態(tài)的作用

T細胞是細胞免疫的主導細胞,由淋巴樣前體細胞分化而來。前體T細胞遷移到胸腺內,在胸腺內分化為成熟的具有免疫活性的T細胞。根據功能和表面標志不同,T細胞可分為輔助性T細胞(helper T cell,Th)、細胞毒性T細胞(cytotoxic T cells,Tc)、調節(jié)T細胞(regulatory T cell,Treg)和記憶T細胞。

1.1 Th細胞

Th細胞可以通過RANK/RANKL/OPG 信號軸對骨細胞發(fā)揮調控作用。早在上世紀90年代,Yoshida課題組和Wiktor-Jedrzejczak課題組就報道了3號染色體上Csfm基因隱性突變的小鼠因缺乏巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)導致體內缺少成熟的巨噬細胞和破骨細胞,其骨改建速率顯著降低,表現(xiàn)出骨硬化癥[5-6]。RANK(receptor activator of nuclear factor κB)是位于破骨細胞表面的受體。RANKL(RANK ligand)作為RANK配體,在M-CSF的協(xié)調作用下與RANK結合,促使前體細胞分化為破骨細胞[7]。后來的研究表明RANKL作用于破骨前體細胞,可激活Src蛋白,從而激活其下游的Akt及mTOR蛋白分子,促使破骨細胞分化[8]。骨保護素(osteoprotegerin,OPG)配體是一種調節(jié)破骨細胞分化和活化的細胞因子,能與RANKL結合以降低RANK結合率,從而抑制破骨細胞分化,降低骨吸收速率[7]。這些研究表明破骨細胞是在M-CSF存在下由RANKL刺激的骨髓單核細胞/巨噬細胞譜系細胞分化而來的。

Th細胞也通過其他途徑調控骨穩(wěn)態(tài)。Weitzmann等發(fā)現(xiàn),CD4+和CD8+T細胞的免疫重建會引起小鼠骨小梁丟失[9]。與健康人群相比,類風濕性關節(jié)炎的病例中衰老的CD4+CD28-T淋巴細胞分泌大量RANKL,展現(xiàn)出更強的破骨誘導和促進骨吸收能力[10]。對于成骨細胞,Deng等發(fā)現(xiàn)CD4+T淋巴細胞分泌的γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)等細胞因子可促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化,而其分泌的轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)活性與成骨細胞分化呈負相關[11]。

Th細胞包括Th1、Th2、Th17細胞等幾類亞型。Th1分泌的白細胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1(interleukin-1,IL-1)在炎性骨吸收中起著關鍵作用[12]。這些炎性細胞因子可以通過刺激RANK,上調RANKL的表達,或抑制OPG的表達來促進破骨細胞生成和骨吸收[13]。其中IFN-γ可以通過抑制RANKL 信號通路直接抑制破骨細胞的生成[14]。此外,IFN-γ 在炎癥或 T 細胞過度激活的狀態(tài)下能通過 RANKL 非依賴性通路促進破骨細胞的生成[15]。最新研究表明,這種抑制作用是通過誘導轉錄合成短型色氨酸-tRNA合成酶(mini tryptophanyl-tRNA synthetase,mini-TrpRS)繼而刺激單核細胞的多核化實現(xiàn)的[16]。Th2細胞可以通過產生IL-4和IL-13作用于破骨前體細胞,從而抑制破骨細胞的生成[17-18]。Th17細胞能產生白介素-17(interleukin-17,IL-17)。IL-17不僅能通過上調破骨前體細胞上的RANK受體來促進破骨細胞的生成,還能促進TNF-α、IL-6和IL-1等破骨細胞因子的表達[19-20]。IL-17還與骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)有很強的協(xié)同作用,兩者結合后能誘導間充質干細胞向成骨細胞分化[21-22]。

1.2 Tc細胞

Tc細胞也通過多個途徑調節(jié)骨穩(wěn)態(tài)。Tc細胞產生的多種細胞因子,例如IL-12、IL-1、IL-6、IL-17、IL-18和TNF-α[23],參與調節(jié)RANK信號傳導[24],并激活NFATc1(nuclear factor of activated T-cells,cytoplasmic 1)[25],從而促進破骨細胞分化。此外,T細胞還可以通過CD40抑制B細胞OPG的表達,從而增加破骨細胞的生成[26],導致全身及局部骨丟失[27]。

研究表明對小鼠進行細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4(systemic administration of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4,CTLA-4-Ig)的全身給藥可抑制小鼠實驗性牙周炎模型中的骨吸收,這可能是通過抑制破骨細胞的分化和活化而發(fā)揮作用的[28],它可以以CD80/CD86依賴的方式誘導破骨細胞前體細胞凋亡直接抑制破骨細胞分化[29]。

1.3 Treg細胞

Treg細胞也在骨的穩(wěn)態(tài)中起著調控作用。Tregs是以Foxp3表達為特征的CD4+CD25+T細胞亞群[30]。研究表明Treg通過分泌TGF-β,IL-10,IL-5和IL-4抑制外周單核細胞的破骨分化[31-32]。此外,Treg細胞可以通過與細胞毒性T細胞相互作用影響骨的穩(wěn)態(tài)和修復。Treg細胞與CD8+T細胞相互作用,能上調成骨因子Wnt10b的表達,促進骨生成[33]。Treg細胞還能抑制CD4+T細胞分泌IFN-γ和TNF-α,促進骨再生[34]。在絲線結扎誘導的小鼠牙周炎模型中,局部誘導增加Treg細胞可以減少炎癥性的骨喪失[35]。研究發(fā)現(xiàn)與沒有新骨形成的強直性脊柱炎患者相比,有新骨形成的強直性脊柱炎患者的Th17/Treg比值顯著降低,而IL-10的mRNA表達與Th17/Treg的比值呈顯著正相關,提示Treg可通過分泌IL-10抑制Th17,在強直性脊柱炎病例中促進新骨形成[36]。Treg細胞在腭快速擴張早期階段通過抑制Th1和Th17細胞的功能進而抑制破骨細胞生成[37]。而在實驗性牙周炎期間,Treg細胞因表型不穩(wěn)定失去抗破骨細胞生成的特性,促進了Th17主導的骨喪失[38]。在自身免疫性關節(jié)炎和實驗性牙周炎的小鼠模型中,Foxp3+Treg細胞亞群還被發(fā)現(xiàn)可以轉化為自身反應性Foxp3-TH17細胞發(fā)揮作用[38-39]。

2 B細胞對頜骨穩(wěn)態(tài)的作用

B細胞在生理狀態(tài)下通過分泌骨保護素抑制破骨細胞的生成,而在病理狀態(tài)下能激活NF-κB配體受體激活因子繼而通過RANK/RANKL軸而刺激破骨細胞的生成[40]。B細胞表達CCL3和TNF等成骨細胞抑制因子,直接抑制間充質干細胞向成骨細胞分化[41]。在牙周炎動物模型中,牙周炎組局部記憶B細胞表達的RANKL顯著升高,且上述細胞可在體外以RANKL依賴性方式支持破骨細胞分化[42]。促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)是促進紅細胞生成的關鍵因子,其受體(EPO-Rs)也在髓系細胞、骨細胞和免疫細胞等非紅系細胞中表達。EPO能誘導小鼠前體B細胞CD115表達并促進破骨發(fā)生,而特異性敲除小鼠B細胞中的EPO-R使小鼠骨量增加。這表明B細胞產生的促紅細胞生成素可能上調破骨信號[43]。

3 單核/巨噬細胞對頜骨穩(wěn)態(tài)的作用

單核細胞系是一類髓系細胞群,是破骨細胞和巨噬細胞的共同來源。巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)刺激單核細胞分化為巨噬細胞,后者激活后根據功能和表面標志物不同,可以分為M1和M2兩種亞型。而RANKL則促使單核細胞向破骨細胞分化[44]。

在特定的免疫微環(huán)境中,巨噬細胞可以轉分化為破骨細胞。巨噬細胞經M-CSF、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)和IL-4、IL-13刺激后,可形成類似破骨細胞的多核巨細胞[45-47]。M2巨噬細胞在RANKL的刺激下可以形成破骨細胞[48]。

巨噬細胞也能分泌IL-1、IL-6、IL-18、IL-23、IL-27和TNF-α等細胞因子[49],影響RANK/RANKL/OPG 破骨細胞調控軸,調控破骨細胞的分化。其中,TNF-α、IL-1β和IL-6可促進破骨細胞的分化和活化[50]。IL-18可能調節(jié)Th1細胞分化和IFN-γ的生成,是破骨生成的抑制因子[51-53]。研究還表明IL-18在體外通過c-MYC途徑激活SLC7A5以增強人骨髓間充質干細胞的成骨分化[54]。IL-23能激活破骨細胞[17]。IL-6在與破骨前體細胞結合后會促進破骨生成[55]。這些細胞因子也可以影響其他細胞的功能,如IL-27可抑制Th17細胞和CD4+T細胞RANKL的表達,減少破骨細胞生成[56-57]。

巨噬細胞與成骨細胞間存在調控關系。骨組織中存在常駐巨噬細胞,即骨巨噬細胞。骨巨噬細胞在組織學上位于成骨細胞附近,與成骨細胞相互作用[58-59]。研究表明,骨巨噬細胞和炎性巨噬細胞能影響膜內成骨細胞的合成功能,其中骨巨噬細胞起到主導作用。此外,巨噬細胞在軟骨內成骨過程中是必需細胞[60]。研究證實,在骨折修復的過程中,巨噬細胞與早期的修復密切相關[61-62]。

與野生型小鼠相比,巨噬細胞缺陷型小鼠骨髓間充質干細胞的成骨分化潛能顯著下降[63-64]。后續(xù)研究證實,巨噬細胞分泌的IL-17和IL-23可以促進骨髓間充質細胞成骨分化[65]。同時巨噬細胞分泌的IL-27能通過增加早期生長反應因子2(early growth response-2,Egr-2)的表達而抑制成骨細胞凋亡,還能以Egr-2 依賴的方式上調Id2,進一步抑制破骨細胞生成[66]。另外,研究人員通過對比年輕小鼠和老齡小鼠巨噬細胞分泌性蛋白的差異,發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白受體相關蛋白1(low-density lipoprotein receptor-related protein 1,LRP 1)是導致兩者骨損傷修復差異的關鍵,阻斷LRP1導致小鼠骨折修復能力消失,而利用重組LRP1治療老年小鼠能促進骨折愈合[67]。

巨噬細胞還可以通過分泌OSM調節(jié)骨的穩(wěn)態(tài)。制瘤素 M(oncostatin M,OSM)是IL-6家族細胞因子之一,可抑制人骨髓間充質干細胞的成脂分化并刺激其成骨分化[68]。后續(xù)研究證明OSM通過JAK3/STAT3信號通路促進牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)的成骨分化和成骨相關基因的表達,阻斷STAT3信號通路能抑制DPSCs成骨分化,并導致基質礦化受到顯著影響[69]。巨噬細胞可通過OSM-STAT3/YAP1 信號軸調節(jié)成骨[70],在大鼠的腰椎退行性疾病模型中,使用抗OSM中和抗體阻斷OSM可預防骨硬化。

4 中性粒細胞和肥大細胞對頜骨穩(wěn)態(tài)的作用

中性粒細胞來源于骨髓,具有吞噬、殺菌和趨化作用。在骨組織炎性反應過程中,中性粒細胞最先到達病灶,并通過其趨化作用募集大量先天性和適應性免疫細胞及骨髓間充質干細胞,在IL-8的誘導作用下,啟動軟骨內成骨的過程。在此過程中,N2極化的中性粒細胞介導巨噬細胞和CD4+T細胞向抗炎型轉化;還可以分泌SDF-1α進一步通過SDF-1/CXCR4通路及其下游PI3K/Akt通路促進骨髓間充質干細胞趨化[71]。

粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)是粒細胞增殖、分化和存活的關鍵調節(jié)因子。最近的研究表明,G-CSF對實驗動物和患者的骨骼健康都有不利的影響。與對照組相比,用G-CSF處理后,小鼠的成骨細胞和骨細胞數(shù)量明顯減少,而且成骨相關標志物表達量也下降。機制研究顯示這一作用是通過誘導細胞凋亡完成的。對小鼠使用一氧化氮抑制劑可以部分恢復G-CSF刺激后成骨細胞的數(shù)量和成骨相關指標。據此,G-CSF可通過上調中性粒細胞中一氧化氮的產生來抑制小鼠的成骨細胞和骨細胞的生長[72]。在大鼠和小鼠的衰老骨骼中,炎性細胞和衰老的免疫細胞,包括中性粒細胞和巨噬細胞會聚集在骨髓中,分泌大量的甘卡霉素,導致成骨和破骨的失衡。而具有甘卡霉素基因缺失的中性粒細胞和巨噬細胞的小鼠會表現(xiàn)出骨骼老化延遲[73]。

肥大細胞來源于髓樣細胞,參與免疫調節(jié),具有弱吞噬功能,也對骨穩(wěn)態(tài)有著調控作用。肥大細胞能通過細胞表面RANKL誘導破骨細胞生成[74],還能通過分泌組胺、TNF和IL-6等促進破骨細胞的生成或通過分泌IL-1抑制成骨細胞活性來發(fā)揮骨吸收的作用[74-75]。研究人員通過研究組胺對小鼠骨髓細胞的影響,發(fā)現(xiàn)肥大細胞分泌的組胺能通過H1受體誘導破骨細胞的生成[76]。在小鼠的顱骨缺損模型中,肥大細胞展現(xiàn)出了促進成骨的作用[77]。對于成骨細胞,肥大細胞介導肌動蛋白細胞骨架的重排改變成骨細胞形態(tài);并且可以下調細胞成骨分化相關mRNA的表達而抑制成骨細胞的功能[78]。最近發(fā)現(xiàn),肥大細胞分泌的糜酶被人原代成骨細胞攝取后,通過TGF-β相關信號通路影響成骨相關因子的表達,并影響成骨細胞胞外基質的合成及分泌,從而抑制成骨細胞功能[79]。

目前,國內學者用單細胞RNA測序構建了小鼠下頜骨的單細胞圖譜。數(shù)據分析表明,與長骨相比,小鼠牙槽骨中發(fā)現(xiàn)了更加活躍的免疫微環(huán)境。其中牙槽骨單核細胞/巨噬細胞表達更高水平的OSM,從而促進未分化間充質細胞的成骨分化[80]。作為國內首個小鼠頜骨免疫微環(huán)境的單細胞測序研究,該研究提示免疫細胞在頜骨可能發(fā)揮更加重要的調控作用。后續(xù)研究可以通過挖掘相應數(shù)據,探究更多的作用細胞和效應細胞,并發(fā)掘更多的作用通路,為疾病治療的藥物研發(fā)開創(chuàng)新的切入靶點。同時,進行大動物以及人類樣本的深入研究,將進一步推進骨免疫研究數(shù)據向藥物研發(fā)和臨床應用的轉化。

綜上,免疫系統(tǒng)對于顱頜面的骨具有關鍵的調控作用。但是,目前的研究數(shù)據尚無法構建頜骨免疫穩(wěn)態(tài)調節(jié)的完善的分子調控網絡機制。結合近年來單細胞組學技術、空間轉錄組技術等新一代研究技術的廣泛應用,有望發(fā)現(xiàn)更多的調控分子靶點,從而構建更為完善的分子調控網絡學說,同時為相關疾病治療藥物的研發(fā)提供更新的治療靶點和更加完善的理論基礎。