不同滅菌方式、蛋白質(zhì)含量飼料對大小鼠生長發(fā)育及生化指標(biāo)的影響

王曉峰，徐騁昊，劉 璇，劉奕廷，張子英，張 楠，朱曉偉，韓 帥

（ 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110 ）

實(shí)驗(yàn)動物是生命科學(xué)研究的重要材料和支撐，其生命中各項(xiàng)生理活動均與營養(yǎng)緊密相關(guān)，如生長、繁殖、疾病防御等。實(shí)驗(yàn)動物個體乃至群體健康均可能受到實(shí)驗(yàn)動物飼料質(zhì)量以及成分配比的影響，而這些影響因素很可能成為基礎(chǔ)研究中的復(fù)雜變量，進(jìn)一步影響研究的再現(xiàn)性和可重復(fù)性[1]。將實(shí)驗(yàn)動物飼料對動物機(jī)體的影響控制在一定可知范圍內(nèi)是保證科研數(shù)據(jù)嚴(yán)謹(jǐn)準(zhǔn)確的前提[2]。

實(shí)驗(yàn)動物營養(yǎng)質(zhì)量控制是實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)化的一項(xiàng)重要內(nèi)容[2]。為標(biāo)準(zhǔn)化控制實(shí)驗(yàn)動物的營養(yǎng)攝入，實(shí)驗(yàn)動物飼料均為全價(jià)飼料。實(shí)驗(yàn)動物飼料原料控制精細(xì)，嚴(yán)格按照國家標(biāo)準(zhǔn)使用規(guī)定的原料類型。但目前我國實(shí)驗(yàn)動物飼料生產(chǎn)廠家的原料采購?fù)緩讲煌?，原料使用受到市場價(jià)格波動影響，而且不同廠家的飼料配方不同，同一廠家不同的產(chǎn)品類型，乃至不同批次的飼料成分也會存在不同程度的變化。這些變化雖然在國標(biāo)范圍內(nèi)，但也可能造成實(shí)驗(yàn)動物機(jī)體和待測指標(biāo)改變進(jìn)而影響試驗(yàn)結(jié)果。目前實(shí)驗(yàn)動物飼料滅菌方式通常采用60Co-γ 射線滅菌和高溫高壓滅菌，而這兩種滅菌方式對飼料營養(yǎng)的損耗程度及飼料的熟化度、硬度等的影響也不同，均可能造成實(shí)驗(yàn)動物個體差異。本試驗(yàn)在60Co-γ 射線滅菌飼料和高溫高壓滅菌飼料等兩種不同滅菌條件下，選取市場上兩種不同蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)動物飼料對SPF 大小鼠生長發(fā)育和各項(xiàng)生化指標(biāo)的進(jìn)行動物健康評價(jià)，以期為確定不同滅菌方式和蛋白質(zhì)含量對大小鼠健康程度的影響提供參考。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)飼料

試驗(yàn)選用內(nèi)蒙古地區(qū)常用的某省某公司的兩種不同鼠飼料，具體成分見表1、表2。檢測標(biāo)準(zhǔn)為GB/T 6438—2007。60Co-γ 輻照滅菌（20 kGy），高溫高壓滅菌（121 ℃、0.14 MPa、20 min）。

表1 大鼠、小鼠飼料營養(yǎng)水平Tab.1 Composition of feed for mice and rats

表2 大鼠、小鼠飼料氨基酸含量Tab.2 Amino acid content in rat and mice feed單位:g/kg

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

SPF 級KM 小鼠40 只，Wistar 大鼠64 只，均購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(生產(chǎn)許可證號:SCXK-2020-0001；批準(zhǔn)號:京動字8910M047），自由飲食，飼養(yǎng)環(huán)境符合GB-14925—2010 試驗(yàn)動物環(huán)境及設(shè)施要求。21 日齡離乳后適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，采用隨機(jī)分組法進(jìn)行分組，KM 小鼠、Wistar 大鼠各自均分為4 組:60Co-γ 滅菌高蛋白組（CoG 組）、60Co-γ 滅菌低蛋白組（CoD 組）、高溫高壓滅菌高蛋白組（TG 組）、高溫高壓滅菌低蛋白組（TD 組），各組中Wistar大鼠為16只，KM小鼠為10只，且每組大鼠、小鼠雌、雄各半。小鼠試驗(yàn)期為2021 年12 月9 日至2021 年12 月26 日，共18 d；大鼠飼養(yǎng)試驗(yàn)為2022 年5 月16 日至2022年7月23日，共68 d。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 體重差值和臟器比

試驗(yàn)第1、4、7、9、12、14、16、18 d 9:00 稱量小鼠體重，計(jì)算相鄰兩次測量的體重差值，共計(jì)8次。試驗(yàn)結(jié)束后小鼠進(jìn)行安樂死，解剖后取肝、腎、心臟、脾、子宮、睪丸、回腸、胃、胰腺和胸腺稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。

試驗(yàn)第1、4、7、15、23、33、47、57、68 d 9:00稱量大鼠體重，共計(jì)9次，計(jì)算相鄰兩次測量的體重差值。大鼠CO2安樂死后解剖，取肝、腎、脾、胃和胸腺稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。

式中:m1為臟器重，m為體重，m3為后一次所測量的體重，m2為前一次所測量的體重。

1.3.2 血尿成分分析

試驗(yàn)結(jié)束后剩余大鼠中每組隨機(jī)選擇10 只（雌、雄各半），麻醉取血液，2 675 r/min 離心10min，取血清，使用DI600/800 SOP 全自動生化儀（江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司）測試大鼠血液指標(biāo):谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（GGT）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、高密度脂蛋白（HDL-C）、直接膽紅素（DBIL）、尿素（UREA）、葡萄糖（GLU）、尿酸（UA）、膽固醇（TC）、總膽汁酸（TBA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、鎂（Mg）、甘油三酯（TG）、糖化血清蛋白（FMN）、肌酐（CREA）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、前白蛋白（PA）。

試驗(yàn)結(jié)束后每組隨機(jī)選取3 只雄性大鼠、小鼠進(jìn)行尿液成分檢測。使用半定量尿液試紙（型號:8U12A，威?？嫡t(yī)療器械科技有限公司）檢測相關(guān)指標(biāo):白細(xì)胞、亞硝酸鹽、尿膽原、蛋白質(zhì)、潛血、尿比重、酮體、膽紅素、葡萄糖、抗壞血酸、微量白蛋白。操作方式參考說明書。

2022年7月24日至2022年8月11日，TG組和CoG組飼喂CoD 組飼料，之后每隔6 d 用半定量試紙測量一次尿液，記錄測試指標(biāo)變化，共測試3次。指標(biāo)包括:亞硝酸鹽、蛋白質(zhì)、微量白蛋白。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 進(jìn)行處理分析，獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)、非參數(shù)秩和檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果以平均值表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼料對小鼠、大鼠體重差值的影響（見表3、表4）

表3 不同飼料對KM小鼠體重差值的影響Tab.3 Effect of different feeds on weight difference of KM mice單位:g

表4 不同飼料對Wistar大鼠體重差值的影響Tab.4 Effect of different diets on weight difference of Wistar rats單位:g

由表3、表4可知，1～4 d和5～7 d飼喂低蛋白飼料小鼠體重差值顯著高于高蛋白飼料小鼠（P＜0.05）。其他時段體重差值差異均不顯著（P＞0.05），16 d 前高蛋白飼料飼喂小鼠體重差值低于低蛋白，16 d之后高于低蛋白。8～15 d、16～23 d飼喂低蛋白飼料大鼠體重差值顯著低于高蛋白飼料飼喂的大鼠（P＜0.05）。

飼料不同滅菌方式對小鼠體重差值無顯著影響（P＞0.05），但高溫高壓滅菌飼料飼喂的試驗(yàn)鼠體重差值略高于60Co-γ 滅菌飼料；60Co-γ 滅菌飼料飼喂大鼠5～7 d、24～33 d、34～47 d 的體重差值極顯著高于高溫高壓滅菌飼料（P＜0.01）。

除1～4 d 小鼠和5～7 d 大鼠外，雄性大鼠、小鼠體重差值均顯著或極顯著高于雌性（P＜0.05或P＜0.01）。

2.2 不同飼料對小鼠、大鼠臟器指數(shù)的影響（見圖1、圖2）

圖1 不同飼料對KM小鼠臟器指數(shù)的影響Fig.1 Effect of different feeds on organ index of KM mice

圖2 不同飼料對Wistar大鼠臟器指數(shù)的影響Fig.2 Effect of different feeds on organ index in Wistar rats

由圖1可知，不同蛋白水平，低蛋白飼料飼喂小鼠的胰腺指數(shù)顯著高于高蛋白飼料飼喂小鼠（P＜0.05）。雄性小鼠肝臟指數(shù)、胰腺指數(shù)極顯著高于雌性小鼠（P＜0.01），胸腺指數(shù)極顯著低于雌性小鼠（P＜0.01），腎臟指數(shù)顯著高于雌性小鼠（P＜0.05）。

由圖2可知，不同蛋白水平、不同滅菌方法，大鼠臟器指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05）；雌性大鼠胃指數(shù)、肝臟指數(shù)、胸腺指數(shù)顯著高于雄性（P＜0.05）。

2.3 不同飼料對Wistar大鼠血液指標(biāo)的影響（見表5）

表5 不同飼料對Wistar大鼠血液生化指標(biāo)的影響Tab.5 Effect of different feeds on blood biochemical indexes of Wistar rats

由表5可知，60Co-γ滅菌飼料飼喂的大鼠血液ALT活性和CRP的含量顯著低于高溫高壓法滅菌飼料（P＜0.05），UA、CREA含量顯著高于高溫高壓滅菌飼料（P＜0.05）。

雌鼠血液ALP 活性及TP、UREA、IgG 含量顯著高于雄性（P＜0.05），GGT活性及DBIL、TG、CRP、Mg2+的含量顯著低于雄性（P＜0.05），ALB、HDL-C、GLU、TC含量極顯著高于雄性（P＜0.01），TBA含量極顯著低于雄性（P＜0.01）。

2.4 不同飼料對小鼠、大鼠尿液成分的影響（見表6、表7）

表6 不同飼料對小鼠、大鼠尿液檢測結(jié)果的影響Tab.6 Effect of different feeds on urine test results in mice and rats

表7 轉(zhuǎn)喂低蛋白飼料后Wistar大鼠尿液成分動態(tài)變化Tab.7 Dynamic changes of urine composition in Wistar rats after being fed low protein diet單位:mg/L

由表6 可知，各組小鼠尿蛋白均為1.50 mg/L，尿微量白蛋白均為1 500 mg/L。大鼠CoG 組、TD 組、TG 組尿蛋白質(zhì)分別為1.10、0.70、1.10 mg/L，尿微量白蛋白均為1 500 mg/L。大鼠CoD組尿蛋白質(zhì)0.05 mg/L，微量白蛋白100 mg/L；尿膽原、GLU、維生素C均有陽性檢出。

由表7 可知，CoG 組和TG 組大鼠轉(zhuǎn)喂低蛋白飼料后第12 d 時尿蛋白質(zhì)陰性，尿微量白蛋白降至300 mg/L；第18 d 時尿蛋白質(zhì)陰性，尿微量白蛋白為100 mg/L；第24 d時，尿蛋白質(zhì)和尿微量白蛋白均為陰性。

3 討論

3.1 不同飼料對大小鼠生長變化的影響

Sijbesma 等[3]研究表明，高蛋白飲食體重和體脂百分比低于低蛋白飲食，且高蛋白飲食可降低GPRC6a敲除和野生型小鼠的體重增加和食物攝入量[4]。本試驗(yàn)中，小鼠高蛋白水平體重差值在第7 d顯著低于低蛋白水平體重差值，其余時間體重差值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，高蛋白水平飼料飼喂的大鼠第7～15 d、15～23 d 的體重差值均低于低蛋白水平。這與小鼠生長變化具有一定相似性，均在生長發(fā)育的中期出現(xiàn)，可能是高蛋白質(zhì)消化后產(chǎn)生大量的肽，阻斷存在于胃腸道主要血管壁上的阿片受體從而抑制食欲。同樣有研究表明，在高脂高蛋白特制飼料喂養(yǎng)情況下，大鼠采食量明顯下降，體重增速緩慢，出現(xiàn)厭食相關(guān)癥狀，且下丘腦 CCK-8 蛋白相對表達(dá)量增高，NPY 蛋白相對表達(dá)量降低[5]。

60Co-γ滅菌處理飼料飼喂的大鼠第4、23、33 d的體重差值顯著低于高溫高壓滅菌的大鼠，這可能是60Co-γ與高溫高壓對飼料中的氨基酸和維生素的破壞程度不同所致，而小鼠未出現(xiàn)這種情況有可能是大鼠對氨基酸和維生素的需求量更高所致。

經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，小鼠性別方面，第1 d時雄性體重顯著高于雌性，但到第7 d 時兩者體重增長無差異，又在7 d之后顯著性逐漸增加，12 d開始差異性顯著。這可能與小鼠性別偏向表達(dá)的時間差異有關(guān)。而本試驗(yàn)大鼠的生長數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，在第1 d 時，雄鼠體重明顯高于雌鼠，但第7 d兩性別體重增長無差異性，15 d之后雄鼠體重增長再次明顯高于雌鼠，生長趨勢與小鼠相同。

3.2 不同飼料對大小鼠臟器指數(shù)的影響

本試驗(yàn)中，高蛋白水平飼養(yǎng)的小鼠的胰臟指數(shù)顯著低于低蛋白水平，其原因可能是高蛋白膳食通過破壞胰腺氧化和抗氧化平衡狀態(tài)，增加自由基對胰腺內(nèi)外分泌功能的氧化應(yīng)激損傷。而高蛋白水平小鼠子宮指數(shù)略低于低蛋白水平小鼠，可能是高蛋白的攝入抑制食欲從而降低采食量而導(dǎo)致子宮發(fā)育輕微受限。60Co-γ 滅菌處理飼料飼喂小鼠脾臟指數(shù)小于高溫高壓滅菌方法，原因可能是60Co-γ破壞了飼料中小鼠脾臟所需的物質(zhì)，確定其具體原因還需進(jìn)一步試驗(yàn)加以驗(yàn)證。

不同性別的小鼠除心臟、脾臟、肺、胃等器官的指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雄性小鼠的肝臟、胰腺、腎臟、回腸等臟器指數(shù)均大于雌性小鼠，胸腺指數(shù)低于雌性小鼠。其中胸腺指數(shù)可能和miR-27b-3p和miR-378a-3p受雌激素所調(diào)控有關(guān)[6]，胰腺指數(shù)的差異可能和基因Slc26a9 有關(guān)[7]。而雌性大鼠的肝臟、胃、胸腺等臟器指數(shù)均大于雄性大鼠，其結(jié)果與小鼠有所不同，其具體原因還需進(jìn)一步研究。

3.3 不同飼料對大鼠血液生化指標(biāo)的影響

本研究中，高蛋白水平攝入的大鼠血液ALT、ALB、TBA略高于低蛋白水平，這可能是高蛋白的攝入導(dǎo)致機(jī)體為消化蛋白質(zhì)而增加TBA的含量，進(jìn)一步導(dǎo)致體內(nèi)對氨基酸代謝增加，使ALT 活性、ALB 含量增加。有研究表明，高蛋白飲食可對肝臟的功能能力產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶活性增加，TC 和蛋白質(zhì)代謝發(fā)生變化[8]。FMN 檢測可準(zhǔn)確反映血糖水平，本研究中高蛋白日糧飼喂的大鼠血液FMN含量略高于低蛋白日糧飼喂的大鼠，表明大鼠攝取高蛋白后可使血糖升高。

由于滅菌方式會對飼料中的維生素造成破壞，本試驗(yàn)中高溫高壓滅菌日糧飼喂的大鼠血液CREA 含量低于60Co-γ滅菌法，表明60Co-γ滅菌法可能使大鼠的腎臟功能下降。同時高溫高壓法滅菌日糧飼喂大鼠血液CRP、ALP、DBIL 也高于60Co-γ 滅菌法，表明大鼠肝臟功能下降，原因可能是高溫高壓破壞了某種肝臟所需的維生素成分，導(dǎo)致了肝臟的損傷。有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，維生素B6可在大腦衰老過程中恢復(fù)ALT的活性[9]。Haraikawa等[10]研究發(fā)現(xiàn)，維生素K1或維生素K2能夠提高大鼠ALP 活性。本研究中，60Co-γ 法滅菌飼料飼喂的大鼠UA 含量顯著高于高溫高壓法飼料飼喂的大鼠，可能與高溫高壓法對B族維生素的破壞有關(guān)。有研究表明，葉酸可通過降低黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生氧自由基及過氧化物的能力，抑制黃嘌呤氧化酶的活性，從而減少UA生成。而且維生素B12會加強(qiáng)葉酸的利用率從而降低UA的產(chǎn)生；同時缺乏維生素B2可能會影響到黃嘌呤氧化酶的活性，進(jìn)而影響機(jī)體UA 水平；維生素B6也可參與葉酸和維生素B12的代謝從而影響UA的生成，進(jìn)一步說明高溫高壓破壞維生素導(dǎo)致肝臟受損。本研究中，60Co-γ滅菌飼料飼喂的大鼠血液DBIL含量高于高溫高壓飼料飼喂的大鼠，原因可能是對維生素的破壞導(dǎo)致肝臟損傷，導(dǎo)致肝臟對膽紅素的代謝能力下降。綜上，這兩種滅菌方法對維生素的破壞均可對肝臟代謝產(chǎn)生一定影響，并且高溫高壓對大鼠肝臟的影響更大。

本研究中，雄性大鼠GGT、DBIL、TBA、CRP均高于雌性大鼠，說明雄性大鼠的代謝比雌性大鼠旺盛。本試驗(yàn)中，雄性大鼠的Mg2+的濃度遠(yuǎn)高于雌性大鼠，有研究表明，高濃度Mg2+組大鼠股骨生長速度加快，并且Mg2+能夠減輕5/6腎切除大鼠胸主動脈血管鈣化，促進(jìn)骨骼生長[11]，這可能是雄性大鼠體重增長高于雌性大鼠的原因之一。雌性大鼠血液IgG含量高于雄性大鼠，研究顯示賴氨酸攝入量與大鼠血漿IgG 的分?jǐn)?shù)合成率（FSR）呈正相關(guān)關(guān)系[12]，推測雌性大鼠可能對飼料中的賴氨酸更加敏感。雌性大鼠HDL-C顯著高于雄性，可能和雌激素誘導(dǎo)HDL-C合成有關(guān)。雌性大鼠血液UREA含量顯著高于雄性，原因可能是肝臟內(nèi)UREA循環(huán)的關(guān)鍵酶（氨基甲酰-P合酶1、精氨酸-琥珀酸合酶和精氨酸酶）的表達(dá)活性與基因表達(dá)相關(guān)，通常表現(xiàn)為雄性因飲食而降低更為顯著[13]。雌性大鼠血液TC 含量顯著高于雄性，這可能是不同性別的大鼠對酪蛋白的敏感性不同。Torres-Villalobos 等[14]研究顯示，酪蛋白飲食大鼠的血清和肝臟TC 含量更高。雌性大鼠血液TP、ALB含量顯著高于雄性大鼠，與前人研究結(jié)果相似[15]。雌性大鼠血液GLU含量極顯著高于雄性大鼠，這可能是雌性大鼠白色脂肪組織（WAT）基因表達(dá)更活躍。Rotondo等[16]研究表明，WAT 可吸收并用于脂肪合成生成多余的膳食GLU，且雌性WAT基因表達(dá)比雄性高。

3.4 不同飼料對大小鼠尿液成分的影響

本試驗(yàn)通過檢測尿液，進(jìn)一步驗(yàn)證不同飼料對大小鼠生長發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)在高、低蛋白水平下小鼠均有大量蛋白尿，其尿蛋白均為1.5 mg/L，尿微量白蛋白均為1 500mg/L，并且在高、低蛋白水平下小鼠血液氨基酸成分沒有明顯差異，這表明兩種蛋白質(zhì)含量可能均高于小鼠生長發(fā)育所需要的蛋白質(zhì)含量，并且在一定程度上高蛋白質(zhì)可能對腎臟造成損傷。同時大多數(shù)小鼠出現(xiàn)尿膽原陽性，其可能血膽紅素含量增高，表明肝臟出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，這可能是小鼠肝臟無法代謝大量蛋白質(zhì)而出現(xiàn)肝臟的損傷。對于大鼠尿液成分檢測分析中，第一次檢測大鼠尿液后發(fā)現(xiàn)，高蛋白水平和低蛋白水平均有尿蛋白質(zhì)和尿微量白蛋白，但其低蛋白水平不同程度的等于或低于高蛋白水平的尿蛋白含量。之后大鼠TG組和CoG組轉(zhuǎn)飼喂CoD飼料，其尿蛋白含量明顯下降，最后一次檢測其尿蛋白質(zhì)和尿微量白蛋白陰性。表明TG和CoG組提供了超過大鼠所需要的蛋白質(zhì)，并且可能已經(jīng)對大鼠腎臟造成一定的損傷。另外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)從低蛋白水平飼喂大鼠的第一次檢測尿液成分中發(fā)現(xiàn)抗壞血酸等其他成分的陽性，這可能是一次偶然的結(jié)果，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明其結(jié)果。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高溫高壓滅菌法飼喂的部分大鼠會出現(xiàn)尿亞硝酸鹽陽性，這可能是高溫高壓造成飼料水分不斷蒸發(fā)，硝酸鹽的濃度相對地增加并且受熱分解變成了亞硝酸鹽有關(guān)。但高溫高壓法下飼喂小鼠并沒有出現(xiàn)尿亞硝酸鹽陽性，可能是小鼠進(jìn)食含量較小的原因，當(dāng)前方法無法檢測出結(jié)果，但還需進(jìn)一步證明。本研究結(jié)果顯示，飼料的滅菌方式和蛋白水平對大小鼠的健康均有不同程度的影響，應(yīng)予以重視，為保證研究的準(zhǔn)確性，可實(shí)時監(jiān)測其血液和尿液相關(guān)指標(biāo)。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，本試驗(yàn)所用的低蛋白水平飼料比高蛋白水平飼料飼養(yǎng)的大鼠、小鼠更健康，60Co-γ 輻照滅菌（20 kGy）比高溫高壓滅菌（121 ℃、0.14 MPa、20 min）破壞飼料中營養(yǎng)成分的程度小，對大鼠、小鼠產(chǎn)生影響更小。