淺析遺傳多樣性的研究方法

陳珊珊，周明芹 (長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

淺析遺傳多樣性的研究方法

陳珊珊，周明芹
(長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北 荊州 434025)

綜述了檢測遺傳多樣性的形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記4種遺傳標(biāo)記的發(fā)生與發(fā)展過程，并比較了各自的優(yōu)缺點(diǎn)及其應(yīng)用。

遺傳多樣性、形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記、DNA分子標(biāo)記

遺傳多樣性(genetic diversity)是生物多樣性的重要組成部分，是生態(tài)系統(tǒng)多樣性和物種多樣性的基礎(chǔ)，任何物種都有其獨(dú)特的基因庫或遺傳組織形式[1]。廣義的遺傳多樣性是指地球上所有生物所攜帶的遺傳信息的總和，但通常所說的遺傳多樣性是指種內(nèi)的遺傳多樣性，即種內(nèi)不同種群之間或一個種群內(nèi)不同個體的遺傳變異[2]。遺傳多樣性的表現(xiàn)形式是多層次的，可以從形態(tài)特征、細(xì)胞學(xué)特征、生理特征、基因位點(diǎn)及DNA序列等不同方面來體現(xiàn)，其中DNA多樣性是遺傳多樣性的本質(zhì)[3]。通常，遺傳多樣性最直接的表現(xiàn)形式就是遺傳變異水平的高低。然而，對任何一個物種來說，個體的生命是短暫的、有限的，而由個體構(gòu)成的種群或種群系統(tǒng)(宗、亞種、種)在自然界中具有其特定的分布格局，在時間上連續(xù)不斷，是進(jìn)化的基本單位。因此，遺傳多樣性不僅包括變異水平的高低，而且包括變異的分布格局，即種群的遺傳結(jié)構(gòu)。種群遺傳結(jié)構(gòu)上的差異是遺傳多樣性的重要體現(xiàn)，一個物種的進(jìn)化潛力和抵御不良環(huán)境的能力既取決于種內(nèi)遺傳變異的大小，也有賴于種群的遺傳結(jié)構(gòu)[4]。

遺傳多樣性的研究具有重要的理論和實(shí)際意義。物種或居群的遺傳多樣性程度是長期進(jìn)化的產(chǎn)物，是其生存(適應(yīng))和發(fā)展(進(jìn)化)的前提。一個居群(或物種)遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，越容易擴(kuò)展其分布范圍和開拓新的環(huán)境，因此，對遺傳多樣性的研究可以揭示物種或居群的進(jìn)化歷史(起源的時間、方式等)，也能為進(jìn)一步分析其進(jìn)化潛力和未來命運(yùn)提供重要資料，尤其有助于物種稀有或?yàn)l危原因及過程的探討。遺傳多樣性的研究不僅與資源的收集、保存和更新密切相關(guān)，而且是種質(zhì)資源創(chuàng)新和品種改良的基礎(chǔ)。準(zhǔn)確評價在DNA分子水平上的遺傳多樣性，不僅可以為親本選配、后代遺傳變異程度及雜種優(yōu)勢的預(yù)測提供預(yù)見性指導(dǎo)，而且還有助于了解品種間的系譜關(guān)系，進(jìn)行品種鑒定和品種分類以及分析物種的起源與進(jìn)化[1～4]。

對遺傳多樣性的系統(tǒng)研究始于十九世紀(jì)，達(dá)爾文在《物種起源》中用大量資料和證據(jù)揭示出生物中普遍存在變異現(xiàn)象，并發(fā)現(xiàn)了大部分變異有遺傳現(xiàn)象，他把這種可遺傳的變異稱為多樣性。隨著孟德爾遺傳定律的重新發(fā)現(xiàn)，摩爾根染色體遺傳學(xué)及后來發(fā)展的細(xì)胞遺傳學(xué)的誕生為群體遺傳理論的發(fā)現(xiàn)奠定了基礎(chǔ)并提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，充分證實(shí)了在自然界中確實(shí)存在大量的遺傳變異。

隨著生物學(xué)理論和技術(shù)的不斷進(jìn)步，以及實(shí)驗(yàn)條件和方法的不斷改進(jìn)，檢測遺傳多樣性的方法日益成熟和多樣化，可從不同的角度和層次來揭示物種的變異。遺傳標(biāo)記(genetic markers)的發(fā)展經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)標(biāo)記(morphological markers)、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記(cytological markers)、生物化學(xué)標(biāo)記(biochemical markers)和分子標(biāo)記(molecular markers)4個主要階段。

1 形態(tài)學(xué)標(biāo)記

形態(tài)學(xué)標(biāo)記是與目標(biāo)性狀緊密連鎖、表型上可識別的等位基因突變體，即植物的外部特征特性。典型的形態(tài)學(xué)標(biāo)記用肉眼即可識別和觀察；廣義的形態(tài)學(xué)標(biāo)記還包括借助簡單測試即可識別的性狀，如生理特性、生殖特性、抗病蟲性等[5]。從形態(tài)學(xué)或表型性狀上來檢測遺傳變異是最古老也是最簡便易行的方法。通常所利用的表型性狀有2類，一類是符合孟德爾遺傳規(guī)律的單基因性狀，如質(zhì)量性狀、稀有突變等，另一類是由多基因決定的數(shù)量性狀[6]。由于自然界中單基因性狀較少，作為遺傳標(biāo)記，主要是用于一些農(nóng)作物、林木、園藝作物及其野生近緣種的遺傳多樣性研究，而且多用于研究交配系統(tǒng)、基因流和選擇等進(jìn)化因素。而數(shù)量性狀的變異則大量存在，對其進(jìn)行研究同樣能分析居群或個體的遺傳變異，并且結(jié)合數(shù)量遺傳學(xué)的方法來研究數(shù)量性狀的遺傳變異，通過特定的雜交試驗(yàn)和后代測定能分析性狀在親本與子代間的傳遞規(guī)律，并將影響變異的遺傳因素同環(huán)境因素區(qū)分開，從而確定遺傳因素在性狀變異中的相對重要性；同時能分析遺傳和環(huán)境的交互作用，甚至可以估算控制數(shù)量性狀的多基因的位點(diǎn)數(shù)目[2，3]。

形態(tài)學(xué)標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建[7]、品種演化與分布?xì)v史推測[8]、種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析[9，10]、種質(zhì)資源的分類與鑒定[11，12]、雜交親本的選配和核心種質(zhì)的構(gòu)建[13]等研究中。

雖然用形態(tài)學(xué)標(biāo)記研究遺傳多樣性具有簡便、易行、快速等特點(diǎn)，但是，由于表型性狀是基因型與環(huán)境共同作用的結(jié)果，往往因環(huán)境因素的影響而發(fā)生變化，有時表型性狀的變異并不能真實(shí)反映遺傳變異；同時，形態(tài)標(biāo)記數(shù)量有限，觀測標(biāo)準(zhǔn)容易受到觀測者的主觀判斷影響。因此，要更加準(zhǔn)確、全面地了解物種的遺傳多樣性，僅僅依賴形態(tài)標(biāo)記是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，還必須結(jié)合其他的標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)行更深層次的研究[14]。

2 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記主要是染色體的核型和帶型分析。染色體是遺傳物質(zhì)的載體，是基因的攜帶者。與形態(tài)學(xué)變異不同，染色體的變異必然會導(dǎo)致遺傳變異的發(fā)生，是生物遺傳變異的重要來源。研究表明，在任何生物的天然居群中，都存在或大或小的染色體變異。染色體的變異主要表現(xiàn)為染色體組型特征的變異，包括染色體數(shù)目的變異(整倍性或非整倍性)和染色體結(jié)構(gòu)的變異(缺失、易位、倒位、重復(fù)等)，染色體的形態(tài)(著絲點(diǎn)位置)、縊痕和隨體等核型特征也是多樣性的來源。染色體分帶(chromosome banding) 指借助于一套特殊的處理程序，使染色體顯現(xiàn)出深淺不同的帶紋，常見染色體帶型有C 帶、G 帶、R 帶、Q 帶等[15]。在植物中，染色體的多倍性現(xiàn)象廣泛存在，Lewin研究發(fā)現(xiàn)約7%的雙子葉植物有多倍現(xiàn)象，共涉及114科660屬2 800種[16]。

植物染色體的數(shù)目、形態(tài)等是最穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)特征之一，染色體的核型、帶型等是表明該種系統(tǒng)演化位置以及和近緣種親緣關(guān)系的重要依據(jù)，是探討植物親緣關(guān)系和進(jìn)化趨勢的一個重要途徑[17]。Tuna等[18]研究了無芒雀草(Bromusinermis)染色體的核型和帶型，推測四倍體無芒雀草可能是異源四倍體，八倍體無芒雀草不是由四倍體的染色體直接加倍形成的。Liu等[19]對山龍眼科Leucadendron屬27個物種的核型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)它們的染色體都具有對稱性，從細(xì)胞學(xué)的角度證明了該屬的原始性。汪衛(wèi)星等[20]比較番木瓜(Caricapapaya)的四倍體與二倍體植株的核型特征，發(fā)現(xiàn)二者沒有明顯的區(qū)別，由此認(rèn)為其四倍體是由二倍體直接加倍形成的同源四倍體。

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記直觀、穩(wěn)定，克服了形態(tài)標(biāo)記易受環(huán)境條件影響的缺點(diǎn)。隨著染色體技術(shù)的發(fā)展，如細(xì)胞原位雜交技術(shù)的應(yīng)用，在染色體水平上將揭示出更加豐富的遺傳多樣性。但是有些物種忍受染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目變異的能力較差而難以獲得相應(yīng)的標(biāo)記材料，某些物種雖有標(biāo)記材料，但常常伴隨著標(biāo)記對生物有害的表型效應(yīng)，使觀測和鑒定比較困難，而且大多數(shù)染色體的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記數(shù)目有限，導(dǎo)致該技術(shù)在較低分類階元的應(yīng)用受到限制[21，22]。

3 生物化學(xué)標(biāo)記

生物化學(xué)標(biāo)記是指利用植物代謝過程中具有特殊意義的生化成分或產(chǎn)物進(jìn)行品種鑒定和遺傳多樣性研究的技術(shù)。許多生物大分子或生物化合物都具有作為遺傳標(biāo)記的潛力。一些次生代謝物如香精油、類黃酮、糖苷類、類萜等都可以作為遺傳標(biāo)記來評價遺傳多樣性[23]，但由于分離和檢測這些分子的技術(shù)和手段比較復(fù)雜，很難適應(yīng)大群體的常規(guī)檢測，因而在實(shí)際研究中，用次生代謝物作為遺傳標(biāo)記的很少[24]。與此相反，許多蛋白質(zhì)(包括非酶蛋白和酶蛋白)分子數(shù)量豐富、分析簡單快速，能更好地反映遺傳多樣性，是比較理想的遺傳標(biāo)記。在非酶蛋白中，用的比較多的是種子貯藏蛋白[25～28]；在酶蛋白中，用的比較多的是同工酶(isoenzyme)[29，30]。同工酶是指具有相同催化功能而結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同的一類酶，其結(jié)構(gòu)的差異來自基因類型的差異，其電泳酶譜的多態(tài)性可能是由不同的基因引起的，也可能是由同一基因座位上的不同等位基因引起的，后者特稱為等位酶(allozymes)。

同工酶標(biāo)記(isoenzyme marker)是20世紀(jì)60年代興起的一門標(biāo)記技術(shù)，廣泛應(yīng)用于種群遺傳結(jié)構(gòu)與交配系統(tǒng)的研究，種群內(nèi)與種群間等位基因頻率的估測以及品種鑒定[31～34]等方面。

同工酶在生物界普遍存在，并以共顯性方式表達(dá)，幾乎不受環(huán)境因素的影響，表現(xiàn)出相對穩(wěn)定性。但是同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物，具有組織特異性，易受發(fā)育階段的影響[22]；只能檢測編碼蛋白的基因位點(diǎn)，不能檢測非結(jié)構(gòu)基因位點(diǎn)；加上能夠利用的具有多態(tài)性的同工酶種類有限，并且每種酶檢測的位點(diǎn)數(shù)目較少，多態(tài)性不高，因此在多數(shù)情況下，同工酶標(biāo)記沒有DNA標(biāo)記敏感，其多態(tài)性也沒有DNA標(biāo)記高[35，36]。

4 DNA分子標(biāo)記

形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和同工酶標(biāo)記都是基因表達(dá)的結(jié)果，是對基因的間接反映，標(biāo)記數(shù)目有限、多態(tài)性較差。DNA分子標(biāo)記是以個體間核苷酸序列差異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平上遺傳變異的直接反映，能更準(zhǔn)確地揭示種、變種、品種、品系乃至無性系間的差異。與前3種標(biāo)記相比，DNA標(biāo)記具有以下優(yōu)越性：(1)較高的可靠性，直接以DNA的形式表現(xiàn)，不受環(huán)境因素、取樣部位和發(fā)育階段的影響，不存在基因表達(dá)與否的問題；(2)數(shù)量多，遍及整個基因組；(3)多態(tài)性高，自然存在著許多變異；(4)表現(xiàn)為“中性”，不影響目的基因的表達(dá)，與不良性狀無必然的連鎖；(5)有許多分子標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性，能夠鑒別純合基因型與雜合基因型[37，38]。由于分子標(biāo)記的巨大優(yōu)越性，近年來在生物科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用相當(dāng)廣泛。根據(jù)所依賴的技術(shù)手段的不同，DNA分子標(biāo)記可分為3大類：第一類是以雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如限制性片段長度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，簡稱RFLP)標(biāo)記、數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)多態(tài)性(variable number of tandem repeats，簡稱VNTR)標(biāo)記；第二類是基于PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphism DNA，簡稱RAPD)標(biāo)記、任意PCR(arbitrary primed PCR，簡稱AP-PCR)標(biāo)記、DNA指紋(DNA amplified fingerprints，簡稱DAF)標(biāo)記、序列特征化擴(kuò)增區(qū)域(sequence-characterized amplified regions，簡稱SCAR)標(biāo)記、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 (amplified fragment length polymorphism，簡稱AFLP) 標(biāo)記、簡單重復(fù)序列 (simple sequence repeats，簡稱SSR)標(biāo)記、內(nèi)部簡單重復(fù)序列(inter-simple sequence repeat，簡稱ISSR)標(biāo)記等；第三類是基于測序和DNA芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tags，簡稱EST)標(biāo)記和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，簡稱SNP)標(biāo)記等[39]。隨著分子生物學(xué)研究的重心逐漸從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)向功能基因組學(xué)轉(zhuǎn)變，高等植物的分子標(biāo)記也開始由過去基于基因組DNA 隨機(jī)開發(fā)的、位置不確定的DNA標(biāo)記向代表轉(zhuǎn)錄譜和其他編碼序列的分子標(biāo)記以及具有相應(yīng)功能的功能標(biāo)記發(fā)展。Andersen 和 Lübberstedt根據(jù)分子標(biāo)記的發(fā)展過程定義了相應(yīng)的3種類型的分子標(biāo)記，即隨機(jī)DNA標(biāo)記(random DNA marker，簡稱RDM)、基因靶向標(biāo)記(gene targeted marker，簡稱GTM)和功能標(biāo)記(functional marker，簡稱FM)。隨機(jī)DNA標(biāo)記指的是來自于基因組中隨機(jī)的多態(tài)性位點(diǎn)的標(biāo)記；基因靶向標(biāo)記是來自于基因轉(zhuǎn)錄區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)的標(biāo)記；功能標(biāo)記也是來自于基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的多態(tài)性位點(diǎn)，但它的多態(tài)性能造成所在基因編碼的表型性狀的變異[40]。

自20世紀(jì)90年代以來，DNA分子標(biāo)記一直是生命科學(xué)領(lǐng)域活躍發(fā)展的一種生物技術(shù)，不僅應(yīng)用廣泛，而且新的分子標(biāo)記種類不斷涌現(xiàn)。各種類型的標(biāo)記層次特點(diǎn)不同，都有各自的優(yōu)勢和局限性。理想的DNA分子標(biāo)記應(yīng)具備以下特點(diǎn)：(1)遺傳多樣性高；(2)共顯性遺傳；(3)在基因組中大量存在且分布均勻；(4)表現(xiàn)為“中性”，對目標(biāo)性狀表達(dá)無不良影響，與不良性狀無必然連鎖；(5)穩(wěn)定性、重現(xiàn)性高；(6)信息量大，分析效率高；(7)檢測手段簡單快捷，易于實(shí)現(xiàn)自動化；(8)開發(fā)成本和使用成本低[41]。但是迄今為止，沒有一種標(biāo)記能完全滿足上述特性。因此，在具體的研究中，應(yīng)該根據(jù)所分析材料的遺傳背景、研究狀況、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊约皩?shí)驗(yàn)條件來選用最合適的標(biāo)記技術(shù)，或同時采用幾種方法進(jìn)行，以便多層次、多角度、更全面、更準(zhǔn)確地揭示物種或種群的遺傳多樣性水平。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和生物技術(shù)的不斷完善，相信越來越多的分子標(biāo)記技術(shù)將被開發(fā)，為人類揭開生物之謎提供更有效的工具。

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2010-07-01

陳珊珊(1988-)，女，湖北天門人，研究方向?yàn)閳@林植物應(yīng)用.

周明芹，E-mail: zhoumingqin@126.com.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.03.019

Q3-3

A

1673-1409(2010)03-S054-04