網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合生物信息學及分子對接探索黃芪甲苷抗肝癌的作用機制

張暉漢，鄧弘揚，徐小東

蘭州大學第二醫(yī)院 普通外科，甘肅 蘭州 730030

肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關死亡的第3 大原因，5 年生存率僅為18%[1]，即使施行了首次根治性切除，肝癌的5 年復發(fā)率仍高達70%[2]。經(jīng)動脈化療栓塞術的重復使用以及索拉菲尼化療也對肝癌患者產(chǎn)生諸多負面影響[3]。隨著現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，傳統(tǒng)中藥及其藥效成分具有的抗癌活性及其較小的細胞毒性逐漸受到了廣泛關注[4]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》曾記載黃芪有健脾益氣固表、脫毒生肌、利尿排膿等功效[5]。黃芪甲苷作為一種芳香族皂苷，是黃芪的最重要的藥效成分之一。有研究表明，黃芪甲苷在神經(jīng)保護[6]、抗纖維化[7]、抗炎[8]、抗氧化應激[9]及抗腫瘤[10]方面有廣泛的藥效作用。最近，多項研究報道黃芪甲苷在抗肝癌方面顯示出了良好前景[11-13]，但其具體作用機制尚不清楚，缺乏系統(tǒng)性研究。本研究利用生物信息學肝癌患者測序樣本及網(wǎng)絡藥理學[14]聯(lián)合分子對接的方法對黃芪甲苷抗肝癌的作用分子機制系統(tǒng)性探索，旨在為肝癌的臨床治療和基礎研究提供新思路。

1 材料和方法

1.1 黃芪甲苷靶點獲取

在 CTD 數(shù)據(jù)庫[15]和 OMIM 數(shù)據(jù)庫[16]以“astragaloside IV”為關鍵詞檢索黃芪甲苷的作用靶點。從PubChem 數(shù)據(jù)庫檢索黃芪甲苷“SDF”格式二維結構式，并將其輸入PharmMapper 數(shù)據(jù)庫[17]，依據(jù)結構預測黃芪甲苷靶點。用“org.Hs.eg.db”R包將靶點統(tǒng)一轉換為“Gene Symbol”格式，轉換失敗的靶點剔除，以3 個數(shù)據(jù)庫所得結果合并后作為所有黃芪甲苷藥效靶點。

1.2 TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)處理及肝癌靶點獲取

從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集轉錄組數(shù)據(jù)，其中包含了371 例肝癌組織和53 例癌旁組織。從GEO 數(shù)據(jù)庫下載GSE14520 數(shù)據(jù)集轉錄組數(shù)據(jù)[18]，其中包含225 例肝癌組織和220 例癌旁肝組織。以R 語言“l(fā)imma”包行差異分析，以P＜0.01 且lg2FC＞1 為標準篩選差異基因，結果以火山圖和熱圖呈現(xiàn)，且差異基因合并后納入肝癌治療靶點。此外，從CTD 數(shù)據(jù)庫和GeneCards 數(shù)據(jù)庫以“hepatocellular carcinoma”檢索肝癌靶點，其中GeneCards 結果僅relevance score≥20”的靶點。最后將差異基因和數(shù)據(jù)庫靶點合并作為所有肝癌預測靶點。

1.3 黃芪甲苷抗肝癌靶點預測及富集分析

將黃芪甲苷和肝癌靶點取交集得到黃芪甲苷抗肝癌靶點，并用“clusterProfiler”R 包行基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析，結果于條形圖和氣泡圖呈現(xiàn)。

1.4 核心靶點篩選

把黃芪甲苷抗肝癌靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫構建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡，物種設定為“homo sapiens”。將PPI 網(wǎng)絡導入Cytoscape 軟件，以CytoNCA 插件計算該網(wǎng)絡節(jié)點的 betweenness centralities（BC）、closeness centralities（CC）、degree cntralities（DC）、eigenvector centralities（EC）、local average connectivity-based method centralities（LAC）和network centralities（NC）6 項拓撲值，以大于該6 項指標中位數(shù)進一步篩選核心靶點，并對核心靶點KEGG 富集分析。

1.5 分子對接

從PDB 數(shù)據(jù)庫獲取核心靶點的PDB-ID，導入PyMOL 2.5.2 軟件中去除有機物和溶劑，保存為pdb格式備用。把黃芪甲苷的SDF 格式二維結構式于OpenBabel 2.3.2 軟件中轉換為pdb 格式。將核心靶點和黃芪甲苷的pdb 格式結構導入Autodock 4.2.6軟件行對接操作，以對接結合能最低的構象作為最終結果。若對接能量＜0 kcal/mol（1 cal＝4.4 J）則可以說明二者具有結合潛力，若對接能量＜?6 kcal/mol，說明二者有良好結合潛力，并于PyMOL軟件中呈現(xiàn)。

2 結果

2.1 黃芪甲苷靶點預測結果

依據(jù)PubChem 數(shù)據(jù)庫獲取的黃芪甲苷二維結構式，于PharmMapper 中預測到148 個靶點。OMIM和CTD 數(shù)據(jù)庫中分別得到674 個和39 個靶點。3個數(shù)據(jù)庫預測結果合并后去除重復共得到841 個黃芪甲苷靶點。

2.2 肝癌靶點預測結果

經(jīng)計算，TCGA-LIHC 數(shù)據(jù)集共得到2 917 個差異基因，其中1 162 個上調(diào)基因和1 755 個下調(diào)基因（圖1A、B），而GSE 14520 數(shù)據(jù)集共得699 個差異基因，其中283 個上調(diào)基因和416 個下調(diào)基因（圖1C、D）。從GeneCards 獲得relevance score≥20 靶點407 個。此外，從CTD 數(shù)據(jù)庫中獲得了69個肝癌靶點。4 項結果合并去除重復后得到3 564 個肝癌靶點。

圖1 差異分析結果Fig.1 Difference analysis result

2.3 黃芪甲苷抗肝癌靶點預測和富集分析結果

將黃芪甲苷和肝癌靶點取交集得到201 個黃芪甲苷抗肝癌靶點（圖2）。對這些靶點富集分析可知，生物過程（BP）顯著富集了老化、氧化應激反應、細胞對化學壓力的反應、對活性氧的反應、腺發(fā)育等，細胞組分（CC）顯著富集了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、含有膠原的細胞外基質(zhì)、基底膜、血液微粒等，分子功能（MF）顯著富集了細胞外基質(zhì)結構成分、固醇轉運蛋白活性、膽固醇轉移活性、氧氣結合、內(nèi)肽酶抑制劑活性。KEGG 富集分析顯著富集了磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）–蛋白激酶B（Akt）信號通路、relaxin信號通路、乙型肝炎、低氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路、表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑耐藥性等相關通路（圖3）。

圖2 黃芪甲苷和肝癌交集靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of astragaloside IV and liver cancer target intersection

圖3 黃芪甲苷抗肝癌靶點富集分析結果Fig.3 Enrichment analysis of astragaloside IV anti-liver cancer targets

2.4 核心靶點篩選結果

經(jīng)篩選，從201 個靶點中最終篩選出9 個黃芪甲苷抗肝癌的核心靶點，分別為基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、腫瘤壞死因子（TNF）、腫瘤蛋白p53（TP53）、白細胞介素（IL）-6、雷帕霉素激酶作用靶點（MTOR）、細胞凋亡相關半胱氨酸蛋白酶（CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、Akt1、白蛋白（ALB），見圖4。這些核心靶點與細胞凋亡、細胞衰老、癌癥中的碳代謝、乙型肝炎、丙型肝炎、IL-17 信號通路、鉑類耐藥、癌癥中的蛋白聚糖以及TNF 信號通路等密切相關，見圖5。

圖4 黃芪甲苷抗肝癌靶點網(wǎng)絡及核心靶點篩選結果Fig.4 Astragaloside IV anti-liver cancer target network and core target screening results

圖5 核心靶點KEGG 富集分析Fig.5 Enrichment analysis of core targets

2.5 分子對接結果

將核心靶點與黃芪甲苷對接后，發(fā)現(xiàn)這些核心靶點與黃芪甲苷均有結合潛力，其中IL-6、CASP3、ALB 與黃芪甲苷有良好結合潛力，見圖6、表1。

表1 核心靶點與黃芪甲苷的分子對接結果Table 1 Molecular docking results of core targets with astragaloside IV

圖6 靶點對接結果Fig.6 Molecular docking results of targets

3 討論

肝癌作為全球癌癥死亡的主要原因之一，盡管在診斷和治療方面取得了重大進展，但預后依然不盡人意，尤其是晚期肝癌患者可選的治療方式十分有限[19]，探索新的治療方法或許能為肝癌患者帶來新希望。傳統(tǒng)中草藥以多靶點作用、不良反應小、毒性低等優(yōu)點，在抗腫瘤領域逐漸受到關注[20]。作為黃芪的主要藥效成分之一的黃芪甲苷，其抗肝癌作用已被多項研究證實[21-22]。探索該藥效作用，可為進一步應用提供依據(jù)。

本研究共篩選出201 個黃芪甲苷抗肝癌靶點，說明黃芪甲苷通過多靶點發(fā)揮抗肝癌作用。GO 富集分析結果提示黃芪甲苷的抗肝癌作用很可能與老化、氧化應激以及脂質(zhì)代謝等過程相關。此外，對靶點KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)的多條通路與肝癌密切相關，如PI3K-Akt 通路[23]、relaxin 通路[24]、乙肝[25]、HIF-1 信號[26]、EGFR 酪氨酸激酶抑制劑耐藥性[27]，這些通路均為介導肝癌進展的重要途徑，表明本研究所篩選靶點具有可靠性。

為了進一步明確黃芪甲苷抗肝癌的核心靶點，本研究利用201 個靶點構建PPI 網(wǎng)絡，并通過該網(wǎng)絡6 項拓撲值篩選出了9 個核心靶點。MMP-9 是基質(zhì)金屬蛋白酶的一種，它可以負向調(diào)節(jié)異檸檬酸脫氫酶2，從而促進細胞遷移和肝癌轉移[28]。TNF與肝細胞凋亡中代償性肝細胞增殖有關，推動了肝細胞向肝癌發(fā)展[29]。TP53 在13%～48%的肝癌病例中有突變[30]，它在肝癌中誘導細胞生長停滯或凋亡，是一個抑癌基因。IL-6 可以磷酸化并激活轉錄激活因子3（STAT3），導致肝癌細胞增殖、耐藥、侵襲轉移等[31]。MTOR 是PI3K-Akt 通路下游分子，是參與肝癌發(fā)病的經(jīng)典失調(diào)通路[32]。CASP3 是抑制肝癌及減輕肝損傷的關鍵因子[33]。MAPK3 被證實可以靶向血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）促進肝癌血管生成[34]。Akt1 與細胞存活、增殖、代謝等過程相關，對腫瘤生長至關重要[35]。ALB 被證實是影響肝癌患者總生存期的獨立危險因素[36]?？傊@些核心靶點均在肝癌的進展中起關鍵作用，這在對它們的KEGG 富集中得到佐證，也證實了黃芪甲苷抗肝癌的潛在價值。本研究最后對核心靶點與黃芪甲苷的分子對接發(fā)現(xiàn)IL-6、CASP3、ALB 與黃芪甲苷有良好結合潛力，說明它們可能是黃芪甲苷抗肝癌的關鍵作用靶點，這為進一步研究提供了參考。

綜上，本研究通過網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合生物信息學及分子對接系統(tǒng)性探索了黃芪甲苷抗肝癌的作用機制，結果一方面證實了黃芪甲苷的抗肝癌的潛在價值，一方面說明黃芪甲苷通過多靶點以及多通路實現(xiàn)該功能，為后續(xù)研究及肝癌臨床治療提供了理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突