基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接預(yù)測覆盆子治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用機制

何芳，余學(xué)英，李思齊

十堰市太和醫(yī)院 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 十堰 442000

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是由于絕經(jīng)后雌激素缺乏，加之遺傳、營養(yǎng)等因素引起的骨退行性慢性代謝性疾病，屬于原發(fā)性骨質(zhì)疏松的一種[1]。50～79 歲女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率為67.3%[2]，隨之而來的高醫(yī)療保健費用、身體殘疾、生活質(zhì)量降低等問題日益突出。且隨年齡的增長，該病發(fā)病率越高，故骨質(zhì)疏松癥及其并發(fā)癥的預(yù)防成為一個主要的公共衛(wèi)生問題。

覆盆子首載于《神農(nóng)百草經(jīng)》中，為薔薇科植物華東覆盆子Rubus chingiiHu 的干燥果實，具有益腎固精縮尿、養(yǎng)肝明目功效，亦是營養(yǎng)豐富的黃金水果，是一種藥食同源的藥材。覆盆子含有黃酮類（山柰酚-3-O-蕓香糖苷、覆盆子素A、覆盆子素B、椴樹苷等）、酚酸類（鞣花酸、抗壞血酸、沒食子酸等）、香豆素類（七葉內(nèi)酯等）等成分。覆盆子具有抗骨質(zhì)疏松、抗衰老[3]、抗癌[4]、抗炎、降糖以及調(diào)血脂等活性[5-6]。隨著人們養(yǎng)生觀念的轉(zhuǎn)化，抗骨質(zhì)疏松療效被現(xiàn)代學(xué)者關(guān)注較多。如覆盆子水煎液高、中、低劑量組（6、3、1.5 g/kg）可顯著降低血清中骨鈣素水平，增高骨力學(xué)強度與骨密度，改善骨質(zhì)中的鈣流失，升高血Ca2+水平、降低血P 水平，使血中Ca2+與P 保持一個恒定的比值，增強骨密度[7]；覆盆子中的覆盆子素A 和覆盆子素B 能抑制破骨細(xì)胞活性[8]。覆盆子復(fù)方骨痿Ⅰ號方[9]、益腎復(fù)原方[10]、龜鹿補腎膠囊[11]等均可用于骨質(zhì)疏松癥的治療。但覆盆子對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松治療的作用機制，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法對覆盆子治療骨質(zhì)疏松的成分、靶點、通路及作用機制進行預(yù)測，以期更好的開發(fā)利用覆盆子。

1 資料與方法

1.1 覆盆子活性成分及成分靶點的篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中以“覆盆子”為關(guān)鍵詞進行搜索，并以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲取符合條件的活性成分。同時，查詢中國知網(wǎng)、萬方、PubMed 等數(shù)據(jù)庫，補充覆盆子治療骨質(zhì)疏松的成分。使用ChemBioDraw 軟件繪制活性成分結(jié)構(gòu)，保存為mol2格式文件，導(dǎo)入到PharmMapper 平臺，進行靶點的反向預(yù)測，獲取成分靶點。并取Z-score 較大的50個靶點作為覆盆子活性成分的潛在作用靶點。

1.2 絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松相關(guān)靶點的收集

在GEO數(shù)據(jù)庫以“postmenopausal osteoporosis”為關(guān)鍵詞，物種為“Homo sapiens”，獲取相關(guān)基因矩陣數(shù)據(jù)文件。并以P＜0.01 和|log2FC|＞1.0 篩選差異基因，繪制火山圖。依據(jù) GeneCards、DisGeNET、OMIM、TTD 數(shù)據(jù)庫，以“postmenopausal osteoporosis”為關(guān)鍵詞進行檢索，篩選條件為“Homo sapiens”，Relevance score≥10（GeneCards）、GDA score≥0.3（DisGeNET）[12]，獲得絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的靶點信息。將GEO 數(shù)據(jù)庫差異基因與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的靶點信息合并去重，即為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥疾病靶點。

1.3 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

利用Cytoscape 3.7.2 和STRING 11.5 軟件，對上述收集到的活性成分與1.2 項下交集部分的靶點進行可視化網(wǎng)絡(luò)圖和靶點相互聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，獲取主要活性成分和核心基因靶點。

1.4 基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析

利用R Studio 軟件，以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，進行GO 富集分析和KEGG 代謝通路分析，繪制相應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 分子對接驗證

從TCMSP 數(shù)據(jù)庫、PubChem 數(shù)據(jù)庫以及PDB數(shù)據(jù)庫獲得覆盆子活性成分的三維結(jié)構(gòu)信息、靶蛋白的三維結(jié)構(gòu)；并利用AutodockTools 1.5.6 軟件對小分子和靶蛋白進行分子對接，采用pymol 軟件對對接結(jié)果進行驗證。

2 結(jié)果

2.1 覆盆子的活性成分

以O(shè)B≥30%，DL≥0.18 為篩選條件，從TCMSP 中篩選出符合條件的有7 個活性成分，根據(jù)文獻(xiàn)報道[8,13-22]查找出9 個覆盆子有效成分，最終得到覆盆子的潛在活性成分16 個，見表1。

表1 覆盆子活性成分Table 1 Active ingredients in Rubus idaeus

2.2 靶點的收集

GEO 篩選數(shù)據(jù)集中，選擇GSE230665 作為研究數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含12 例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥及3 例健康志愿者，利用GEO 2R 工具篩選、整理后得差異基因7 710 個，其中上調(diào)基因7 690 個，下調(diào)基因20 個，見圖1。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中中檢索到237 個覆盆子成分相關(guān)的靶點，從GeneCards、DisGeNET、OMIM、TTD 數(shù)據(jù)庫中分別檢索到絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)靶點1 225、308、45、36 個。刪除相同靶點，獲得絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥靶點1 336 個。將絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥靶點與活性成分靶點取交集，獲得覆盆子治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥潛在靶點63 個。

圖1 差異基因火山圖Fig.1 Differential gene volcano map

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖制作及分析

利用Cytoscape 3.6.0 軟件，構(gòu)建了覆盆子活性成分與靶點的可視化網(wǎng)絡(luò)圖，見圖2。從結(jié)果可知，活性成分的平均degree 值是12，其中β-谷甾醇、熊果酸、覆盆子素A、谷甾醇、覆盆子素B、鞣花酸、齊墩果酸的degree 值均大于12，分別為20、18、17、15、15、14、14，推測這7 個成分是與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥靶點作用較大的活性成分。

圖2 活性成分與靶點的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of active ingredients and targets

利用STRING 11.0 軟件，繪制77 個靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。從靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖及數(shù)據(jù)結(jié)果可知，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥靶點的平均degree 值是14，白蛋白（ALB）、酪氨酸蛋白激酶（SRC）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（CASP3）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、雌激素受體α（ESR1）、Harvey 肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、有絲分裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）degree 值均大于16，推測這9 個靶點可能是覆盆子對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥治療發(fā)揮作用較大的靶點。

圖3 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Target PPI network diagram

2.4 GO 和KEGG 富集分析

利用R Studio 軟件中CludterProfiler 文件包，以P＜0.05 作為篩選條件，對收集的主要靶點進行GO 分析，發(fā)現(xiàn)生物學(xué)過程（BP）有999 個條目，細(xì)胞組分（CC）有21 個條目，分子功能（MF）有78 個條目。選取了較顯著的前15 個條目進行了GO富集分析，發(fā)現(xiàn)BP 主要富集在激素介導(dǎo)的信號通路、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、對類固醇激素的反應(yīng)、細(xì)胞對類固醇激素刺激的反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)受體信號通路等；CC 主要富集在等離子膜筏（plasma membrane raft）、膜筏（membrane raft）、膜微疇（membrane microdomain）、膜區(qū)域（membrane region）等；MF 主要富集在類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、核受體活性（nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性（transcription factor activity）、類固醇結(jié)合（steroid binding）、激素受體結(jié)合（hormone receptor binding）等，見圖4。

圖4 GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

利用R Studio 軟件中CludterProfiler 文件包，對主要靶點進行KEGG 通路富集分析，得到108 條通路。以P＜0.05 為篩選條件，選取了前20 個degree值較高的通路進行了KEGG 代謝通路分析，主要有化學(xué)致癌–受體激活、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）–蛋白激酶B（Akt）信號通路信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、癌癥中的蛋白多糖等代謝通路，見圖5。

圖5 KEGG 通路分析Fig.5 KEGG channel analysis

2.5 分子對接結(jié)果

選取degree 值靠前的β-谷甾醇（C3）、熊果酸（C11）、覆盆子素A（C15）、谷甾醇（C4）、覆盆子素B（C16）、鞣花酸（C1）、齊墩果酸（C10）7 種成分與degree 值較大的ALB、SRC、CASP3、MMP9、ESR1、HRAS、PPARG、MAPK1、MAPK14 進行對接，對接結(jié)果見表2，熱圖見圖6。從對接結(jié)果可知，結(jié)合能位于?6.9～?12.4 kcal/mol（1 cal＝4.4 J），表示成分與靶點的結(jié)合能力較強。結(jié)合能較強的部分受體與配體的對接模式見圖7，對接結(jié)果表明受體與配體結(jié)合比較牢固。

圖6 分子對接結(jié)合能相關(guān)熱圖Fig.6 Molecular docking binding energy-related heat map

圖7 分子對接模式圖Fig.7 Molecular docking model diagram

表2 成分與靶點對接的結(jié)合能Table 2 Binding energy of components docking with targets

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對覆盆子中治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的活性成分、靶點、通路等進行了預(yù)測。研究發(fā)現(xiàn)，覆盆子治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的主要成分可能是β-谷甾醇、熊果酸、覆盆子素A、谷甾醇、覆盆子素B、鞣花酸、齊墩果酸等。研究發(fā)現(xiàn)覆盆子素A、覆盆子素B 等具有很強的抑制破骨細(xì)胞分化和骨吸收的活性。β-谷甾醇可調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞保護因子與破骨分化因子的平衡，促進骨組織的修復(fù)[23]；谷甾醇、β-谷甾醇具有雌激素樣作用，提高成骨細(xì)胞護骨素（OPG）與破骨細(xì)胞分化因子（ODF）的比值[24]，從而促進成骨作用。張洪然等[25]將大鼠酒精性骨質(zhì)疏松模型ig 給予熊果酸研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)8 周后，骨損傷明顯改善，骨小梁變粗，且可以連接成網(wǎng)，脂多糖降低，Ⅰ型膠原羧基端交聯(lián)肽降低，明顯改善骨質(zhì)疏松的狀態(tài)。鞣花酸一方面通過抑制破骨前體細(xì)胞分化而抑制破骨代謝[26]，另一方面通過促進骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）中Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）、堿性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型膠原蛋白（ColⅠ）以及β 連環(huán)蛋白（β-catenin）表達(dá)，抑制其成脂分化，促進BMSCs 的成骨分化，其機制可能與激活Wnt/β-catenin 信號通路有關(guān)[27]。

研究中發(fā)現(xiàn)ALB、SRC、CASP3、MMP-9、ESR1、HRAS、PPARG、MAPK1、MAPK14 9 個靶點的degree 值較高，推測其可能在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥治療中發(fā)揮重要作用。MAPK1、MAPK9、MAPK14 是MAPK 家族的重要成員[28]，主要作用于MAPK 信號通路，促進與骨形成相關(guān)的信號蛋白的合成與釋放[29]，參與骨骼的發(fā)育、重塑和修復(fù)。CASP3 是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用靶點，一般骨質(zhì)疏松患者的CASP3 增加，與骨質(zhì)疏松患者成骨細(xì)胞的凋亡有關(guān)[30]。而KEGG 過程主要集中在化學(xué)致癌–受體激活、PI3K-Akt 信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、MAPK 信號通路、癌癥中的蛋白多糖等。PI3K-Akt 信號通路是一種重要通路，主要參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖凋亡及骨代謝異常，研究發(fā)現(xiàn)激活PI3K-Akt 信號通路，可以增加骨小梁的不規(guī)則性，使破骨細(xì)胞增多[31]。作用于脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路，可引起氧化低密度脂蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，從而引起成骨細(xì)胞的異常生長[32]。且將主要活性成分與關(guān)鍵靶點進行對接，結(jié)果顯示結(jié)合能位于?6.9～?12.4 kcal/mol，對接較為牢固，表明本研究對覆盆子治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的預(yù)測結(jié)果較為可靠。

綜上可知，覆盆子可通過β-谷甾醇、熊果酸、覆盆子素A、谷甾醇、覆盆子素B、鞣花酸、齊墩果酸等多個活性成分與ALB、SRC、CASP3、MMP9、ESR1、HRAS、PPARG、MAPK1、MAPK14 等多個靶點相結(jié)合，作用于多個通路而發(fā)揮治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突