亞精胺促進(jìn)線粒體自噬緩解急性胰腺炎的分子機(jī)制研究

巴穆登，阿布力克木·吾拉音，吳朝陽(yáng)

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院 急診創(chuàng)傷外科，新疆 烏魯木齊 830001

急性胰腺炎是一種胰腺炎性疾病，其發(fā)病率和死亡率都很高。急性胰腺炎的全球發(fā)病率為0.034%，并且在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)[1]。通常大多數(shù)患者表現(xiàn)為輕度急性胰腺炎，具有自限性，癥狀一般在1 周內(nèi)消退；約有20%的患者將發(fā)展為中度或重度急性胰腺炎，伴有胰腺/胰周組織壞死和/或器官衰竭，此類患者死亡率高達(dá)20%～40%[1]。隨著臨床管理水平的不斷提高，急性胰腺炎的全球總死亡率在持續(xù)下降，目前約為2%[1-2]。膽結(jié)石繼發(fā)的胰腺導(dǎo)管阻塞為急性胰腺炎最常見的病因；其次為酒精；其他原因包括內(nèi)鏡逆行胰膽管造影和各種藥物引發(fā)病理性細(xì)胞通路和細(xì)胞器功能障礙，上述病因均將導(dǎo)致急性胰腺炎的標(biāo)志性事件胰腺腺泡細(xì)胞死亡，以及局部或全身炎癥反應(yīng)的發(fā)生[3]。肥胖、膽石癥、高三酰甘油血癥和糖尿病與急性胰腺炎獨(dú)立相關(guān)[4]。

雖然急性胰腺炎的全球疾病負(fù)擔(dān)沉重，但目前仍未有治療或預(yù)防急性胰腺炎的有效藥物[5]。急性胰腺炎的臨床管理包括準(zhǔn)確的診斷，適當(dāng)?shù)姆衷\和高質(zhì)量的支持治療，對(duì)并發(fā)癥的監(jiān)測(cè)和治療，以及預(yù)防復(fù)發(fā)。在支持治療中，最為有效的是急性胰腺炎發(fā)病后最初的12～24 h 積極的進(jìn)行補(bǔ)液治療；超出24 h，則臨床意義不大。其次為急性胰腺炎發(fā)病24 h 后給予適當(dāng)?shù)倪M(jìn)食和腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)治療、內(nèi)鏡治療、在急性胰腺炎發(fā)病4 周后才開始進(jìn)行的廣譜抗生素治療，以及對(duì)積液和壞死的處理[4-5]。

巨自噬/自噬是一種進(jìn)化上保守的途徑，負(fù)責(zé)清除細(xì)胞溶質(zhì)蛋白質(zhì)聚集體、受損細(xì)胞器或入侵微生物。自噬的激活是機(jī)體應(yīng)對(duì)外在（環(huán)境）和內(nèi)在（代謝）壓力，在進(jìn)化上保守的適應(yīng)機(jī)制，其失調(diào)會(huì)導(dǎo)致各種疾病狀態(tài)，如神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、傳染性、自身免疫性疾病和癌癥等[6-7]。在多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物急性胰腺炎模型研究和急性胰腺炎患者的胰腺腺泡細(xì)胞中，能夠觀察到積聚有大量液泡，而這已被證明是與自噬功能異常相關(guān)的病理性液泡。由于自噬過(guò)程受損，這些液泡中含有未被正常降解的受損的長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)和其他損傷細(xì)胞器，并且這些病理性液泡將相互融合，在急性胰腺炎組織中呈現(xiàn)為空泡化的胰腺腺泡細(xì)胞[8-9]。特別是自噬功能異常后，胞質(zhì)內(nèi)過(guò)早激活的胰蛋白酶原未被及時(shí)降解，將進(jìn)一步破壞胰腺腺泡細(xì)胞胞質(zhì)細(xì)胞器，自噬泡內(nèi)大量未降解脂質(zhì)的積累還導(dǎo)致腺泡細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常，加劇腺泡細(xì)胞的炎癥水平[10]。亞精胺是一種天然多胺，可激活細(xì)胞的保護(hù)性巨自噬/自噬[11-12]。外源性補(bǔ)充亞精胺可延長(zhǎng)包括酵母、線蟲、果蠅和小鼠在內(nèi)的多個(gè)物種的壽命，并維持個(gè)體健康。在人類最近的流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，增加對(duì)富含亞精胺的食物的攝取能夠降低與心血管疾病和癌癥相關(guān)的總體死亡率[13]。亞精胺對(duì)自然衰老大鼠和D-半乳糖誘導(dǎo)的加速衰老模型具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。亞精胺通過(guò)上調(diào)衰老大鼠腦組織的自噬和線粒體自噬水平，降低腦組織中的促氧化劑和氧化應(yīng)激水平，減少神經(jīng)炎癥來(lái)對(duì)抗衰老引起的神經(jīng)損傷[12]。在研究擬向急性胰腺炎小鼠模型腹膜內(nèi)注射亞精胺治療或腹膜內(nèi)注射給予亞精胺＋線粒體自噬抑制劑環(huán)孢菌素A 處理，通過(guò)測(cè)定模型小鼠胰腺炎緩解情況，評(píng)價(jià)亞精胺的療效，并探索其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 20 只6～7 周齡雄性C57BL/6J 小鼠，體質(zhì)量18.0～20.0 g，購(gòu)自新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心（批號(hào)79011345）。飼養(yǎng)于恒溫（22～25 ℃）、恒濕、具備12/12 h 光暗循環(huán)的標(biāo)準(zhǔn)SPF 級(jí)動(dòng)物房。每4 只小鼠一個(gè)鼠籠。小鼠自由進(jìn)食和飲水。在造模實(shí)驗(yàn)開始前，先對(duì)小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，審批號(hào)KY202205130129。

1.1.2試劑 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶生物素-dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）試劑盒（DAB 法）（貨號(hào)T10245）購(gòu)自南京博恩生物（中國(guó)）公司。小鼠血清白細(xì)胞介素-6（IL-6，貨號(hào)ml063160）、腫瘤細(xì)胞壞死因子-α（TNF-α，貨號(hào)ml002095）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β，貨號(hào)ml037875）和超敏C 反應(yīng)蛋白（CRP，貨號(hào)ml038364）ELISA 試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物（中國(guó)）公司?？乖迯?fù)液（貨號(hào)R20911）購(gòu)自上海源葉生物（中國(guó)）公司。山羊血清購(gòu)自上海名勁生物（中國(guó)）公司。兔抗小鼠髓過(guò)氧化物酶（MPO）單抗（ab208670）、兔抗小鼠細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)型LC3（LC-3Ⅰ）/Ⅱ多抗（ab128025）、兔抗小鼠泛素結(jié)合蛋白（p62）單抗（ab109012）、兔抗小鼠NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）單抗（ab263899）、兔抗小鼠pro-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-1）＋p10＋p12 單抗（ab179515）、兔抗小鼠IL-1β單抗（ab254360）、兔抗小鼠PTEN 誘導(dǎo)假定激酶1（PINK1）單抗（ab300623）、兔抗小鼠Parkin 多抗（ab73015）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗（ab6721）兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單抗（Ab9485）均購(gòu)自Abcam 公司。蛋白酶抑制劑（貨號(hào)P2714）和磷酸酶抑制劑（貨號(hào)P2850）、亞精胺（貨號(hào)S2501）、環(huán)孢菌素A（貨號(hào)Y0002292）購(gòu)自Sigma-Aldrich（美國(guó)）公司。RIPA 裂解液（貨號(hào)89900）和JC-1 染料（貨號(hào)T3168）購(gòu)自Thermo Fisher（美國(guó)）公司。組織線粒體提取試劑盒（貨號(hào)C0010-50）購(gòu)自北京普利萊生物（中國(guó)）公司。

1.1.3儀器 ECLIPSE Ni-E 光學(xué)顯微鏡購(gòu)自Nikon（日本）公司。Infinite F50 熒光酶標(biāo)儀購(gòu)自Tecan（美國(guó)）公司。

1.2 方法

1.2.1急性胰腺炎小鼠模型構(gòu)建 通過(guò)每小時(shí)向小鼠腹膜內(nèi)注射1 次50 μg/kg 的蛙皮素（蛙皮素溶于無(wú)菌生理鹽水中），連續(xù)注射10 次，構(gòu)建急性胰腺炎小鼠模型。在末次注射結(jié)束后24 h，眼眶靜脈叢采集小鼠外周靜脈血，通過(guò)ELISA 測(cè)定血清胰蛋白酶水平，以及細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、CRP的水平判定造模成功的情況。

1.2.2分組和處理 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組、模型組、亞精胺組、亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組，每組5 只。模型組小鼠按照1.2.1 項(xiàng)下急性胰腺炎小鼠模型構(gòu)建的方法注射蛙皮素建模；對(duì)照組按照同模型組的處理方式注射等體積無(wú)菌生理鹽水；亞精胺組在模型小鼠連續(xù)10 次注射蛙皮素結(jié)束后，立即腹膜內(nèi)注射100 mmol 的亞精胺（溶于200 μL PBS 中）[13]；亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組在模型小鼠給予亞精胺治療的同時(shí)，腹膜內(nèi)注射10 mg/kg 的環(huán)孢菌素A[14]。

1.2.3蘇木精–伊紅（HE）染色 采用CO2窒息法安樂死小鼠后，迅速取小鼠胰腺組織，然后將其于4 ℃在4%甲醛中固定48 h[15]。然后對(duì)固定好的組織進(jìn)行石蠟包埋和切片，切片厚度為4 μm。隨后使用HE 染色試劑盒對(duì)切片進(jìn)行HE 染色。在Nikon光學(xué)顯微鏡下，以200 倍放大觀察組織切片中10 個(gè)不同的視野，以評(píng)估胰腺組織損傷的嚴(yán)重程度。

1.2.4TUNEL 染色 使用TUNEL 試劑盒進(jìn)行染色確定胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的情況。具體實(shí)驗(yàn)操作步驟遵循試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。在Nikon 光學(xué)顯微鏡下對(duì)完成TUNEL 染色的切片進(jìn)行觀察和拍照。使用Image-Pro Plus v6.0 對(duì)圖像進(jìn)行分析，將具有深棕色細(xì)胞核的腺泡細(xì)胞計(jì)數(shù)為TUNEL 陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.5ELISA 法檢測(cè)炎性因子水平 從小鼠眼眶靜脈叢采集血液樣本，將血樣加入至肝素抗凝管中，輕輕混勻后，保存于4 ℃冰箱，并于24 h 內(nèi)進(jìn)行ELISA 測(cè)定。使用ELISA 試劑盒對(duì)血清IL-6、TNF-α、IL-1β、CRP 的水平進(jìn)行測(cè)定，具體的測(cè)定步驟按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.6免疫組織化學(xué)染色（IHC）事先制備好胰腺組織切片，方法如前1.2.3 項(xiàng)下所述。將切片完全浸沒入抗原修復(fù)液中，使用微波爐高火加熱至沸騰，然后繼續(xù)加熱10 min；再?gòu)奈⒉t取出，將抗原修復(fù)液自然冷卻至室溫。取出切片，向切片滴加3%的雙氧水，室溫下避光封閉30 min；再向切片上滴加含4%山羊血清的封閉緩沖液，室溫下封閉切片1 h；然后向切片滴加髓過(guò)氧化物酶（MPO）一抗工作液（稀釋度為1∶250），4 ℃下共同孵育過(guò)夜；次日向切片滴加山羊抗兔IgG H&L（HRP）二抗工作液（稀釋度為1∶500），室溫下共同孵育1 h。再向切片滴加生物素底物，室溫下共同孵育30 min；向切片滴加DAB 顯色液，室溫下避光顯色5～10 min。然后在Nikon 光學(xué)顯微鏡下鏡檢、觀察和拍照。

1.2.7Western blotting 法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 使用添加有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解胰腺組織。使用含5%脫脂奶粉的TBS 溶液，在室溫下封閉PVDF 膜1 h。向PVDF 膜上滴加一抗工作液，并在4 ℃條件下使膜與一抗工作液共同孵育過(guò)夜。次日，向PVDF 膜上滴加二抗工作液，并在室溫下使膜與二抗工作液共同孵育1 h。向PVDF 膜上滴加ECL 超敏化學(xué)發(fā)光底物，對(duì)目的條帶進(jìn)行顯影。使用Image J v1.8.0 對(duì)目的條帶LC-3Ⅰ、LC-3Ⅱ、p62、NLRP3、Caspase-1、cleaved-Caspase-1、IL-1β、PINK1、Parkin 和GAPDH 的灰度值進(jìn)行定量分析。

1.2.8線粒體膜電勢(shì)測(cè)定 使用組織線粒體提取試劑盒從胰腺組織中提取線粒體。使用染料JC-1 測(cè)定線粒體膜電位的水平。具體方法為將組織用PBS沖洗去除殘余血液，然后在冰冷的線粒體裂解試劑中將胰腺組織勻漿。隨后將勻漿液以1 000 ×g，在4 ℃條件下離心5 min。棄沉淀，收集含有線粒體的上清液，再以3 500 ×g在4 ℃條件下離心10 min。再次棄沉淀，收集純化好的含有線粒體的上清液，置于冰上備用。向此純化好的含有線粒體的上清液中加入JC-1 染色液。將上述混合液以每孔200 μL的體積加入至96 孔板中。每組樣品設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，分別對(duì)應(yīng)每個(gè)分組中的5 只小鼠。同時(shí)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線孔。使用熒光酶標(biāo)儀對(duì)每孔的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品孔中膜電位進(jìn)行定量。

1.2.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 定量數(shù)據(jù)以5 次獨(dú)立樣本測(cè)定結(jié)果的表示。使用GraphPad Prism v6.0 軟件對(duì)計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多組間差異的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 亞精胺對(duì)急性胰腺炎小鼠胰腺組織損傷程度的影響

如圖1 染色結(jié)果所示，與對(duì)照組胰腺組織相比，模型組胰腺組織呈現(xiàn)出炎癥表型，表現(xiàn)為胰腺組織中浸潤(rùn)了大量中性粒細(xì)胞（圖中紅色箭頭所示），腺泡細(xì)胞腫脹和壞死；亞精胺組胰腺組織的炎癥程度大大減弱，表現(xiàn)為幾乎不存在中性粒細(xì)胞的大量浸潤(rùn)，腺泡細(xì)胞腫脹程度明顯減弱，基本無(wú)腺泡細(xì)胞壞死；亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組胰腺組織的炎癥程度呈嚴(yán)重狀態(tài)，表現(xiàn)為存在大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（圖中紅色箭頭所示），腺泡細(xì)胞嚴(yán)重腫脹。

圖1 HE 染色觀察亞精胺對(duì)急性胰腺炎小鼠胰腺組織的影響（×200）Fig.1 Effect of spermidine on pancreatic tissue of mice with acute pancreatitis observed by HE staining(×200)

如圖2 TUNEL 染色結(jié)果所示，與對(duì)照組胰腺組織相比，模型組胰腺組織TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，胰腺組織中浸潤(rùn)大量中性粒細(xì)胞（圖中紅色箭頭所示）。與模型組相比，亞精胺組胰腺組織TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，胰腺組織中僅浸潤(rùn)少量中性粒細(xì)胞（圖中紅色箭頭所示）。與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組胰腺組織TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，胰腺組織中存在中性粒細(xì)胞大量浸潤(rùn)（圖中紅色箭頭所示）。

圖2 TUNEL 染色觀察亞精胺對(duì)急性胰腺炎小鼠胰腺組織的影響（×200）Fig.2 Effect of spermidine on pancreatic tissue of mice with acute pancreatitis was observed by TUNEL staining (×200)

2.2 亞精胺對(duì)急性胰腺炎小鼠血清炎性因子和胰腺組織MPO 水平的影響

如圖3 血清ELISA 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β、CRP 的水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，亞精胺組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β、CRP 的水平明顯降低（P＜0.05）。與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A組血清IL-6、TNF-α、IL-1β、CRP 的水平明顯升高（P＜0.05）。

圖3 ELISA 法測(cè)定亞精胺對(duì)急性胰腺炎小鼠血清炎性因子水平的影響（，n =5）Fig.3 Effect of spermidine on serum inflammatory factors in mice with acute pancreatitis was determined by ELISA (,n =5)

如圖4 IHC 染色結(jié)果所示，與對(duì)照組相比，模型組MPO IHC 陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)明顯增多。與模型組相比，亞精胺組MPO IHC 陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)明顯降低。與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組MPO IHC 陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)明顯增多。

圖4 IHC 檢測(cè)亞精胺對(duì)急性胰腺炎小鼠胰腺組織MPO 的影響（×200）Fig.4 Effect of spermidine on MPO in pancreatic tissue of mice with acute pancreatitis detected by IHC (×200)

2.3 亞精胺對(duì)急性胰腺炎小鼠胰腺組織的巨自噬水平

如圖5 所示，與對(duì)照組相比，模型組胰腺組織中巨自噬標(biāo)志物L(fēng)C-3Ⅰ/Ⅱ值明顯增高，p62 表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。與模型組相比，亞精胺組胰腺組織中LC-3Ⅰ/Ⅱ值明顯增高，p62 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組胰腺組織中LC-3Ⅰ/Ⅱ值明顯降低，p62 的表達(dá)水平明顯增高（P＜0.05）。

圖5 亞精胺對(duì)急性胰腺炎小鼠胰腺組織相關(guān)蛋白的影響（，n =5）Fig.5 Effects of spermidine on pancreatic tissue-related proteins in mice with acute pancreatitis (,n =5)

與對(duì)照組相比，模型組胰腺組織中炎癥小體標(biāo)志物NLRP3、IL-1β、cleaved-Caspase-1 的表達(dá)水平明顯增高（P＜0.05）。與模型組相比，亞精胺組胰腺組織中NLRP3、IL-1β、cleaved-Caspase-1 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組胰腺組織中NLRP3、IL-1β、cleaved-Caspase-1 的表達(dá)水平明顯增高（P＜0.05）。Caspase-1 的表達(dá)水平在各組間沒有明顯差異。

2.4 亞精胺對(duì)小鼠胰腺組織的線粒體自噬水平的影響

如圖6A 線粒體膜電勢(shì)水平結(jié)果所示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠線粒體跨膜電位明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，亞精胺組線粒體跨膜電位明顯升高（P＜0.05）；與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組線粒體跨膜電位明顯降低（P＜0.05）。如圖6B、C 結(jié)果所示，與對(duì)照組相比，模型組胰腺組織中PINK1 和p-Parkin 表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，亞精胺組胰腺組織中PINK1和p-Parkin 的表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組胰腺組織中PINK1 和p-Parkin 的表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。Parkin 的表達(dá)水平在各組間沒有明顯差異。

圖6 亞精胺對(duì)急性胰腺炎小鼠胰腺組織線粒體自噬水平的影響（，n =5）Fig.6 Effect of spermidine on mitochondrial autophagy in pancreatic tissue of mice with acute pancreatitis (,n =5)

3 討論

急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制的核心細(xì)胞事件為病理性胞質(zhì)內(nèi)鈣信號(hào)增強(qiáng)，線粒體功能障礙，腺泡細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)胰蛋白酶原過(guò)早激活，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）受損和自噬受損[4,11,16-17]。腺泡細(xì)胞中Ca2+濃度的病理性升高是急性胰腺炎的中心事件，它介導(dǎo)促細(xì)胞死亡和促炎途徑，如胰蛋白酶原的過(guò)早激活、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體功能障礙[18]。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+超載導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔在高電導(dǎo)狀態(tài)下打開，這一過(guò)程導(dǎo)致生成ATP 所必需的線粒體膜電勢(shì)喪失，引起ATP 合成停滯[18-19]。而ATP 的耗竭又將導(dǎo)致ATP–依賴性細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，如自噬和UPR 功能受損；以及引起ATP–依賴性光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+通道（SERCAs）和質(zhì)膜Ca2+通道（PMCA）的功能被破壞，使得細(xì)胞無(wú)法清除過(guò)多的胞質(zhì)Ca2+而使有毒的高濃度的Ca2+永久存在于胞質(zhì)內(nèi)。繼發(fā)于細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體功能障礙將最終導(dǎo)致腺泡細(xì)胞壞死。本次研究中也顯示，與對(duì)照組相比，模型組腺泡細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電勢(shì)水平明顯降低，表明線粒體功能明顯受損。已有研究證明，在急性胰腺炎和重癥急性胰腺炎小鼠模型中，線粒體功能均受損。PINK1 和PARK2 基因敲除小鼠對(duì)重癥急性胰腺炎的發(fā)作更敏感[20]。許多學(xué)者認(rèn)為，提高線粒體自噬水平，及時(shí)、有序的清除局部受損的線粒體和壞死腺泡細(xì)胞，將損傷局限在小范圍內(nèi)，防止繼發(fā)性損傷和炎癥反應(yīng)的擴(kuò)大，對(duì)防止急性胰腺炎的惡化十分關(guān)鍵。線粒體自噬屬于巨自噬，涉及選擇性靶向和吞噬線粒體，通過(guò)溶酶體降解去除受損線粒體。該途徑的激活是因線粒體受損的程度超出了其他質(zhì)量控制方法能夠解決的能力，或者在細(xì)胞需要去除線粒體以用于代謝或發(fā)育等目的的情況下[21]。因受損的線粒體不僅缺乏制造ATP 和其他生物活性物質(zhì)的能力，而且還會(huì)釋放更高水平的活性氧自由基（ROS）。這又會(huì)成為反饋信號(hào)，進(jìn)一步增強(qiáng)ROS 的積累，激活NLRP3炎癥小體，并使細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)和DNA 的氧化損傷敏感。同時(shí)，缺陷線粒體的積累還將通過(guò)釋放前–死亡分子導(dǎo)致細(xì)胞死亡[22]。因此，在線粒體損傷的情況下，線粒體自噬去除故障線粒體，可將胞內(nèi)線粒體種群維持在最佳狀態(tài)[21]。亞精胺是一種小分子細(xì)胞巨自噬/線粒體自噬誘導(dǎo)劑。亞精胺通過(guò)誘導(dǎo)自噬，吞噬和更新衰老和受損神經(jīng)元，提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類個(gè)體的認(rèn)知能力，在阿爾茲海默癥和帕金森病中起到保護(hù)功效[23-25]。亞精胺通過(guò)誘導(dǎo)自噬和抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠肺泡細(xì)胞死亡緩解博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[26]。但亞精胺是否能夠用于緩解急性胰腺炎尚未有明確報(bào)道。在本次研究中，給予急性胰腺炎小鼠模型以亞精胺治療，或給予急性胰腺炎小鼠模型以亞精胺＋線粒體自噬抑制劑環(huán)孢菌素A 處理，結(jié)果顯示，給予急性胰腺炎小鼠模型以亞精胺治療，與模型組相比，亞精胺組腺泡細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電勢(shì)水平明顯升高。使用Western blotting 法針對(duì)線粒體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)也表明，與對(duì)照組相比，模型組PINK1 和p-Parkin的表達(dá)水平明顯增強(qiáng)；與模型組相比，亞精胺組PINK1 和p-Parkin 的表達(dá)水平進(jìn)一步上調(diào)。這表明當(dāng)急性胰腺炎發(fā)生后，線粒體自噬被激活，而亞精胺處理能夠進(jìn)一步增強(qiáng)這種線粒體自噬的水平。與此同時(shí)，與模型組相比，亞精胺組腺泡細(xì)胞內(nèi)巨自噬水平明顯上調(diào)，表現(xiàn)為L(zhǎng)C-3Ⅰ/Ⅱ的水平進(jìn)一步增強(qiáng)，p62 的表達(dá)水平進(jìn)一步降低。腺泡細(xì)胞內(nèi)NLRP3 炎癥小體的水平明顯降低，表現(xiàn)為與模型組相比，亞精胺組腺泡細(xì)胞中NLRP3、IL-1β、cleaved-Caspase-1 的表達(dá)水平均明顯降低；小鼠全身性炎癥水平明顯下調(diào)，表現(xiàn)為與模型組相比，亞精胺組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-1β、CRP 的水平均明顯降低；小鼠胰腺組織MPO 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少。與模型組相比，HE 染色顯示亞精胺組胰腺組織的炎癥程度大大減弱，幾乎不存在中性粒細(xì)胞的大量浸潤(rùn)，腺泡細(xì)胞腫脹程度明顯減弱；TUNEL 染色顯示亞精胺組胰腺組織TUNEL 染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。而使用環(huán)孢菌素A 抑制線粒體自噬后，亞精胺緩解急性胰腺炎小鼠胰腺組織損傷的功效被大大阻斷。表現(xiàn)為與亞精胺組相比，亞精胺＋環(huán)孢菌素A 組上述檢測(cè)指標(biāo)均發(fā)生逆轉(zhuǎn)。

PINK1/Parkin 驅(qū)動(dòng)的線粒體自噬是最具特征的線粒體自噬經(jīng)典途徑[27]。在健康線粒體中，PINK1被導(dǎo)入線粒體內(nèi)膜，在那里它暴露于線粒體蛋白酶髓磷脂蛋白0（MPP）和早老素相關(guān)菱形樣蛋白（PARL）并被其切割降解。當(dāng)線粒體膜電勢(shì)喪失，線粒體去極化，或錯(cuò)誤折疊的線粒體蛋白積累后，PINK1 向內(nèi)膜的導(dǎo)入被阻止。因此PINK1 被穩(wěn)定在線粒體外膜表面，然后通過(guò)其激酶活性，將p-Parkin 和線粒體外膜表面數(shù)種泛素化蛋白因子[28]。然后，p-Parkin 被募集到這些線粒體和泛素化途徑中的多種表面蛋白上，這些蛋白中的一些作為自噬受體的信號(hào)，而另一些則是蛋白酶體的作用靶點(diǎn)，隨后參與降解損傷線粒體，而這些都是線粒體自噬過(guò)程必不可少的成分[29]。該途徑還包含1個(gè)放大環(huán)，其中p-Parkin 促進(jìn)其被進(jìn)一步的募集和磷酸化，導(dǎo)致更多的p-Parkin 被泛素化和依次在線粒體外膜表面的積累，建立降解信號(hào)[30-31]。本次研究中結(jié)果也明確顯示，使用環(huán)孢菌素A 阻斷線粒體自噬后，PINK1 和p-Parkin 的水平明顯降低，說(shuō)明其介導(dǎo)的線粒體自噬過(guò)程被顯著抑制，亞精胺的功效被抵消。綜上所述，亞精胺可能通過(guò)促進(jìn)線粒體自噬來(lái)發(fā)揮保護(hù)急性胰腺炎小鼠胰腺組織功效的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突