長鏈非編碼RNA在腎癌中的研究進展

林永帥 張發(fā)財 楊建軍 梁國富 吳志平

腎癌又稱為腎細胞癌，是一種常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，主要起源于腎小管上皮[1]。2016年，WHO 將腎癌分為16 種不同的組織亞型，其中透明細胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）、乳頭狀細胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）和嫌色細胞癌（chromophobe renal cell carcinoma，CHRCC）為最常見的病理類型，分別占比70%～90%、10%～15%和3%～5%[2]。腎癌發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢[3]，在男性所有癌癥中占第6 位，在女性中占第10 位，分別占所有腫瘤診斷的5%和3%[4]。目前，腎癌診斷主要依靠CT 和MRI，由于對放化療不敏感，早期腎癌主要依靠手術(shù)治療[5]。近年來盡管腎癌治療水平有了較大的提高，但患者預(yù)后仍然很差。據(jù)報道，約25%～30%的腎癌患者在初步確診時存在轉(zhuǎn)移性疾病，且在根治性腎切除術(shù)后仍有20%～40%的患者出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[6]，給腎癌的診斷和治療帶來巨大的挑戰(zhàn)。因此，尋找更有效的腎癌早期診斷、治療方法和預(yù)測預(yù)后的新型生物標志物和靶點尤為重要。諸多研究表明，長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）可作為預(yù)測預(yù)后的新型生物標志物和靶點，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。隨著近年來高通量測序技術(shù)的發(fā)展，基于腫瘤標本的lncRNA 生物標志物的研究如火如荼。本文就lncRNA 在腎癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮的作用作一綜述，以期為腎癌的診療及預(yù)后評估提供新的思路和參考。

1 lncRNA

1.1 lncRNA 概述 人類基因組計劃的研究結(jié)果表明，正常人類基因組中只有2%的RNA 序列用來編碼蛋白質(zhì)，其余的大部分為非編碼RNA，類型包括lncRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）和環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）等[7]。lncRNA 是一類轉(zhuǎn)錄本序列長度超過200 個核苷酸、且不參與蛋白質(zhì)表達的RNA分子，大部分位于細胞核或細胞質(zhì)，也有一些lncRNA通過外泌體運輸傳播到相鄰細胞或血清，約占非編碼RNA 的80%[8-9]。lncRNA 在包括人類在內(nèi)的所有脊椎動物中普遍存在，由于缺乏有意義的開放閱讀框和蛋白質(zhì)編碼功能，lncRNA 曾經(jīng)被認為是轉(zhuǎn)錄“噪音”或RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能[10]。據(jù)估計，人體內(nèi)已探明的lncRNA 數(shù)量超過60 000 個，而且這個數(shù)量還在快速增加[11]。到目前為止，只有極少數(shù)lncRNA 的功能被注釋[12]。隨著分子生物學(xué)的持續(xù)發(fā)展，lncRNA 的生理生化功能正在被逐漸認識。當前研究認為，lncRNA 能夠與DNA、RNA 和（或）蛋白質(zhì)分子相互作用，調(diào)節(jié)生物體的生理功能，涉及基因調(diào)控、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的表觀遺傳控制，影響細胞穩(wěn)態(tài)的各個方面，包括增殖、凋亡、生長周期、侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。lncRNA 在腫瘤細胞中差異表達，并且與健康細胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細胞直接相關(guān)。探討lncRNA 在各種腫瘤疾病中的作用并尋找新的生物標志物和藥物靶點成為今后生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究的新熱點。

1.2 lncRNA 分類 不同lncRNA 位于不同的基因組位置并從不同的基因組位置轉(zhuǎn)錄，根據(jù)所在基因組位置lncRNA 可分為5 類[14]，其中轉(zhuǎn)錄本來源于兩條編碼蛋白基因的間隔區(qū)域的lncRNA 被稱為基因間lncRNA，來自注釋基因內(nèi)含子的被稱為內(nèi)含子lncRNA，來自編碼蛋白基因反向互補鏈的被稱為雙向lncRNA，由蛋白編碼基因的正義鏈轉(zhuǎn)錄而成的lncRNA 被稱為正義lncRNA，主要指來自蛋白編碼基因的外顯子，那些位于注釋轉(zhuǎn)錄單位的反義鏈上的lncRNA 則被稱為反義lncRNA。

1.3 lncRNA 的功能 大多數(shù)lncRNA 需要在功能上進行驗證，總結(jié)以往的研究可知，lncRNA 相關(guān)功能大致可分為5 類，一是調(diào)控表觀遺傳，如lncRNA HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA，HOTAIR）是腎癌轉(zhuǎn)移的重要啟動子，HOTAIR 可影響組蛋白H3賴氨酸27（histone H3 lysine 27，H3K27）甲基化及其靶基因的表達，從而介導(dǎo)腎癌的轉(zhuǎn)移[15]。二是充當誘餌，如p21 相關(guān)NcRNA DNA 損傷激活（p21 associated NcRNA DNA damage activated，PANDA）的lncRNA 可充當核轉(zhuǎn)錄因子NF-YA 的誘餌，以限制促凋亡基因的表達[16]。lncRNA 還充當共調(diào)節(jié)劑或共阻遏物，如被稱為類固醇受體RNA 激活劑（steroid receptor RNA activator，SRA）的lncRNA 可作為多種核類固醇受體的共激活劑，通過調(diào)節(jié)真核基因的表達充當催化性的RNA 轉(zhuǎn)錄本[17]。一些lncRNA 可與miRNA 相互作用，Zhao 等[18]發(fā)現(xiàn)lncRNA HOTAIR 通過靶向抑制miR-20a-5p 調(diào)節(jié)乳腺癌中高遷移率族蛋白A2（high mobility group protein A2，HMGA2）的表達。此外，lncRNA 可作為miRNA 的宿主基因，如lncRNA H19 作為宿主基因反向調(diào)節(jié)miR-675 的釋放，并抑制細胞增殖，從而響應(yīng)細胞應(yīng)激或癌變等相關(guān)信號的產(chǎn)生[19]。

2 lncRNA 影響腎癌發(fā)生、發(fā)展的機制

2.1 lncRNA 促進腎癌細胞增殖 正常細胞的生長依賴于生長因子的調(diào)節(jié)，但腫瘤細胞可以在很少或沒有生長因子的情況下繼續(xù)保持其增殖的能力[20]，而這一能力，可能與lncRNA 失調(diào)有關(guān)。Hong 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR 在腎癌組織中顯著上調(diào)，過表達HOTAIR 與腎癌患者的腫瘤-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移TNM 分期呈正相關(guān)。HOTAIR 還通過靶向負調(diào)控miR-217 表達促進腎癌細胞的增殖和遷移。提示HOTAIR 可作為一種新的腎癌生物標志物和潛在的治療靶點。Zhou 等[22]發(fā)現(xiàn)煙酰胺核苷酸轉(zhuǎn)氫酶反義RNA（nicotinamide nucleotide transhydrogenase antisense RNA，NNT-AS）1 可通過miR-137/Y-盒結(jié)合蛋白1（Y-box binding protein 1，YBX1）途徑促進ccRCC 的進展，敲除NNT-AS1 可明顯抑制ccRCC細胞增殖，NNT-AS1 也因此被認為是ccRCC 的一個有意義的治療靶點。Liu 等[23]發(fā)現(xiàn)，小核仁RNA 宿主基因（small nucleolar RNA host gene，SNHG）12 在腎癌中過表達，體外實驗證明SNHG12 過表達會增加腎癌細胞增殖，而敲低SNHG12 表達則可顯著降低腎癌細胞增殖、遷移和侵襲。從機制上講，SNHG12 過表達提高了細胞分裂周期相關(guān)蛋白3 的水平，從而參與腎癌的發(fā)生、發(fā)展。相比于鄰近正常組織，腎癌組織中l(wèi)ncRNA 核富集轉(zhuǎn)錄本（nuclear-enriched abundant transcript，NEAT）1 的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修飾更低，而NEAT1的高甲基化明顯抑制了腎癌細胞的增殖[24]。lncRNA DNAJC3-AS1 可能通過調(diào)節(jié)miR-27a-3p/正性調(diào)節(jié)區(qū)鋅指蛋白（PR domain zinc finger protein，PRDM）14 軸調(diào)控ccRCC 的進展，沉默lncRNA DNAJC3-AS1 則減少ccRCC 細胞的增殖、遷移和侵襲[25]。腎癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（renal cancer-associated transcript，RCAT）1 是腎癌的重要腫瘤啟動子，腎癌組織中RCAT1顯著上調(diào)，RCAT1通過保護E2F 轉(zhuǎn)錄因子（E2F transcription factor，E2F）2 免受miR-214-5p 介導(dǎo)的降解來促進腎癌細胞的增殖[26]。此外，lncRNA MIR4435-2HG 通過靶向miR-513a-5p/Kruppel 樣鋅指轉(zhuǎn)錄因子6（kruppel-like zinc finger transcription factor 6，KLF6）軸增加ccRCC 細胞的增殖和侵襲能力[27]。POU 3 類同源盒3（POU Class 3 Homeobox 3，POU3F3）過表達介導(dǎo)腎癌細胞中生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄本（growth arrest-specific transcript，GAS）5 的下調(diào)，從而干預(yù)腎癌細胞的生長[28]。?；撬嵘险{(diào)基因（taurine upregulated，TUG）1 能夠通過抑制miR-196a 表達促進體外腎癌細胞增殖、遷移和侵襲[29]。

2.2 lncRNA 調(diào)控腎癌細胞的凋亡 細胞凋亡指在生理和病理條件下發(fā)生的有序和協(xié)調(diào)的程序性細胞死亡，細胞的功能性凋亡對器官發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[30]。細胞凋亡由許多配體啟動，包括通過外源性途徑調(diào)節(jié)特定的膜死亡受體和通過內(nèi)源性途徑調(diào)節(jié)線粒體中的B 細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白家族并介導(dǎo)凋亡[31]。腫瘤細胞可以通過多種方式逃避細胞凋亡，從而獲得區(qū)別于正常生理細胞的凋亡抗性。lncRNA 在調(diào)控腫瘤細胞凋亡中發(fā)揮了不可或缺的作用。有研究表明，與正常細胞相比，腎癌細胞中特定的lncRNA 表達模式發(fā)生了變化。Chen 等[32]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（colon cancer-associated transcript，CCAT）1 在腎癌組織和細胞系中的相對表達量明顯高于對照組，敲除CCAT1 可降低細胞活力，加速腎癌細胞系的凋亡。進一步研究表明，CCAT1/Livin 軸可能在其中發(fā)揮著重要的作用，CCAT1 通過增強Livin蛋白穩(wěn)定性并上調(diào)Livin 蛋白的表達水平，抑制腎癌細胞凋亡并增加細胞的活力。腎癌中漿細胞瘤變異易位（plasmacytoma variant translocation，PVT）1 基因通常表達上調(diào)，敲除腎癌細胞中的PVT1 可導(dǎo)致髓樣細胞白血?。╩yeloid cell leukemia，Mcl）-1 基因的下調(diào)。研究表明，Mcl-1 是Bcl-2 家族的重要成員，可作為抗凋亡因子參與調(diào)節(jié)細胞死亡[33]。因此，上調(diào)PVT1 可導(dǎo)致腎癌細胞死亡信號抗性，使其存活率增加。SNHG16主要位于ccRCC 細胞的細胞質(zhì)中，研究發(fā)現(xiàn)SNHG16可以顯著抑制ccRCC 細胞的凋亡，其機制可能是SNHG16 作為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與ccRCC 細胞中的miR-1301-3p 相互作用，上調(diào)了STARD9 蛋白的表達[34]。此外，有研究報道lncRNA POU3F3 相鄰非編碼轉(zhuǎn)錄本（POU3F3 adjacent non-coding transcript，PANTR）1 是一種致癌的基因間lncRNA，來源于編碼蛋白的POU3F3 基因，位于染色體2q12.1 上。在敲除PANTR1 后，腎癌細胞中負責(zé)直接執(zhí)行人類細胞凋亡的半胱天冬酶（Caspases）-3 和Caspases-7 活性顯著升高，從而誘導(dǎo)細胞凋亡[35]。體外和體內(nèi)實驗表明，敲除遠端HOXA 轉(zhuǎn)錄物（HOXA transcript at the distal tip，HOTTIP）促進腎癌細胞凋亡作用可能部分通過激活Bcl-2/Caspase-3 通路來實現(xiàn)。進一步研究發(fā)現(xiàn)HOTTIP 可能通過促進EZH2 和LSD1 結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平間接影響大腫瘤抑制激酶（large tumor suppressor kinase，LATS）2 的下游靶標表觀遺傳，從而導(dǎo)致腎癌細胞的抗凋亡[36]。在另一項研究中，尿路上皮癌胚抗原（urothelial carcinoma antigen，UCA）1 在晚期腎癌患者中表達顯著升高，UCA1 作為miR-129 的ceRNA，增強了腎癌細胞中靶基因SRY 基因相關(guān)的HMG 盒（SRY-related HMG-box，SOX）4 的表達，UCA1 的下調(diào)可顯著誘導(dǎo)細胞凋亡[37]。lncRNA DARS-AS1 通過miR-194-5p/DARS 信號傳導(dǎo)在ccRCC中發(fā)揮抗凋亡作用[38]。lncRNA 母系表達基因（maternally expressed gene，MEG）3 過表達可降低Bcl-2 的表達并增強Caspase-9 蛋白的表達，推測其可能通過激活線粒體途徑誘導(dǎo)腎癌細胞凋亡[39]。

2.3 lncRNA 影響腎癌細胞周期 細胞周期是一個高度調(diào)節(jié)的過程，使細胞生長、遺傳物質(zhì)復(fù)制和細胞分裂成為可能。完整的細胞周期包括DNA 合成前期（G1期）、DNA 合成期（S 期）、DNA 合成后期（G2期）、有絲分裂期（M 期）和處于靜止狀態(tài)的靜止期（G0期）。細胞周期由核心細胞周期機制驅(qū)動，其物質(zhì)基礎(chǔ)包括細胞周期蛋白及其催化伙伴、細胞周期蛋白依賴性激酶等[40]。當前研究認為lncRNA 對腎癌細胞周期具有重要的調(diào)控作用。如lncRNA LOC653786 的沉默可降低叉頭轉(zhuǎn)錄因子（forkhead transcription factor，F(xiàn)OX）M1 蛋白的表達從而誘導(dǎo)腎癌細胞周期停滯在G1期[41]。lncRNA 轉(zhuǎn)移相關(guān)性肺腺癌轉(zhuǎn)錄本（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript，MALAT）1 通過降低miR-203 的表達減少G0/G1期腎癌細胞的百分比，而敲除MALAT1 則會逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象[42]。lncRNA KCNQ1DN在腎癌組織和細胞系中下調(diào)，敲除KCNQ1DN 可顯著上調(diào)細胞周期蛋白D1，下調(diào)p27 mRNA 和蛋白質(zhì)水平，并增強腎癌細胞的G1進程，而lncRNA KCNQ1DN的過表達則導(dǎo)致腎癌的G1期細胞周期停滯[43]。通過與EZH2 相互作用，lncRNA LINC-PINT 過表達導(dǎo)致腎癌的G1期細胞百分比顯著下降，同時S 期細胞百分比增加[44]。此外，NEAT1 在腎癌組織和細胞系中上調(diào)，體外敲除試驗發(fā)現(xiàn)，NEAT1 導(dǎo)致G0/G1期細胞積累，與對照相比，S 期細胞數(shù)量減少，這一過程可能是通過miR-34a/肝細胞生長因子受體（c-metprotoncogene，c-Met）軸實現(xiàn)的[45]。lncRNA GIHCG 能夠加速腎癌細胞的細胞周期進程，敲除GIHCG 則顯著抑制了腎癌細胞從G0/G1期向S 期的進展[46]。敲除Xist 基因5'端（five prime to Xist，F(xiàn)TX）抑制了腎癌細胞中G0/G1期的集落形成并導(dǎo)致細胞周期阻滯[47]。lncRNA X 染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄本（X inactive specific transcript，XIST）的過表達在體外顯著誘導(dǎo)細胞G0/G1停滯并在體內(nèi)抑制腫瘤生長，其機制可能是lncRNA XIST 直接與miR-106b-5p 相互作用并增加p21 的表達，從而在腎癌中發(fā)揮抑癌作用[48]。

2.4 lncRNA 介導(dǎo)腎癌細胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） EMT 是一種賦予上皮腫瘤細胞間質(zhì)特性的過程，包括減少黏附和增加運動性，EMT 過程中上皮細胞失去黏附連接，頂-基底外側(cè)極性被剝奪，獲得遷移潛力并轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型，EMT 也被認為是癌癥轉(zhuǎn)移早期階段的關(guān)鍵步驟[49]。在胚胎發(fā)育過程中，胚胎細胞通過EMT 以遷移到遠處，隨后遵循相反的過程，即間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)換（mesenchymal-epithelial transition，MET），以分化成各種細胞類型。同樣，癌細胞在原發(fā)性腫瘤分層期間重新激活EMT 程序，遷移到遠處器官，并形成繼發(fā)性腫瘤[50]。越來越多研究表明，lncRNA 通過與miRNA 競爭性結(jié)合、調(diào)節(jié)mRNA 表達水平及激活相關(guān)信號通路等方式影響EMT 過程，促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Hong 等[51]發(fā)現(xiàn)，腎癌細胞中l(wèi)ncRNA EMBP1 通過轉(zhuǎn)錄后機制結(jié)合并負調(diào)控miR-9-5p，敲除EMBP1，上皮標志物上皮鈣黏蛋白E（E-cadherin）和claudin 蛋白上調(diào)，間充質(zhì)標志物波形蛋白（vimentin）下調(diào)，表明EMBP1/miR-9-5p 軸通過調(diào)控細胞EMT 從而促進腎癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。結(jié)直腸腫瘤差異表達（colorectal neoplasia differentially expressed，CRNDE）基因在ccRCC 組織及細胞系中高表達，通過靶向調(diào)控miR-136-5p，介導(dǎo)ccRCC 細胞EMT[52]。相關(guān)性分析證實，lncRNA LINC00961 的表達與腎癌患者特異性生存呈負相關(guān)，LINC00961 過表達可抑制EMT 相關(guān)的生物標志物Slug 和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）的表達，從而介導(dǎo)腎癌細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移[53]。而lncRNA LOC648987 可上調(diào)腎癌細胞中vimentin 和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP-9）的表達以促進EMT[54]。Xiong 等[55]通過微陣列評估發(fā)現(xiàn)lncRNA HEIRCC 在腎癌組織和細胞中過表達，并與腎癌腫瘤分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，HEIRCC 的敲除導(dǎo)致E-cadherin上調(diào)以及N-cadherin 和vimentin 下調(diào)。此外，對EMT轉(zhuǎn)錄因子的分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性HEIRCC 表達的缺失明顯降低了E-盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger E-box binding protein 1，ZEB1）的數(shù)量，而Snail 和Slug 的數(shù)量沒有顯著變化。表明HEIRCC 是一種新的EMT 正性調(diào)節(jié)因子，在腎癌細胞的EMT 過程中發(fā)揮功能。

3 小結(jié)與展望

隨著RNA 測序技術(shù)的進步，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)與報道，它們已被證明在癌癥的診斷、預(yù)后和治療中具有價值，這為進一步探索它們在癌癥中的功能和作用開辟了可能。在人類腎癌組織中及細胞系中，許多致瘤性lncRNA 表達上調(diào)，異常lncRNA 表達是腎癌患者預(yù)后不良的標志?；谀壳暗难芯?，本文總結(jié)了一些最新發(fā)現(xiàn)的經(jīng)過實驗驗證能夠調(diào)控腎癌發(fā)生、發(fā)展的lncRNA，重點闡述了這些lncRNA 已確認的功能和機制，包括在調(diào)控腎癌細胞增殖、凋亡、細胞周期及介導(dǎo)EMT 方面的潛在作用。然而，由于數(shù)量龐大，功能復(fù)雜，lncRNA 的研究尚處于初級階段，大多數(shù)lncRNA 的生物學(xué)和分子特征仍然未知，lncRNA 在腎癌調(diào)控中的機制仍不完全清楚，需要更多的研究來闡明lncRNA 與腎癌的關(guān)系，以了解lncRNA 在腎癌中的具體作用和功能。毫無疑問，在未來，隨著lncRNA 在腎癌發(fā)病機制中的研究逐步深入，其在腎癌診斷、治療及預(yù)后中將發(fā)揮出更大的功能。