牙鲆細(xì)胞因子M17蛋白原核表達(dá)及其多克隆抗體制備

蘇玉鳳　馬倩倩　孫敬鋒

摘??? 要：M17是魚(yú)類(lèi)細(xì)胞因子IL-6亞族家族的成員之一，具有細(xì)胞因子樣功能，在魚(yú)體內(nèi)發(fā)揮抗病毒和抗細(xì)菌的作用。為了制備牙鲆（Paralichthys olivaceus）M17蛋白的多克隆抗體，將M17基因插入pET-32a原核表達(dá)載體，構(gòu)建M17基因原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-M17。將構(gòu)建的質(zhì)粒pET-32a-M17轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)M17蛋白表達(dá)，利用Ni-NTA親和層析柱純化M17重組蛋白。利用純化的重組M17蛋白免疫小鼠獲得M17多克隆抗體（抗血清）。結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)后M17蛋白分子質(zhì)量大小約為50.0 ku，M17重組蛋白主要以包涵體表達(dá)為主；Ni-NTA親和層析柱純化后透析復(fù)性后M17重組蛋白濃度為597 μg·mL-1；多克隆抗體經(jīng)雙向瓊脂免疫擴(kuò)散法檢測(cè)抗體效價(jià)為1∶16，經(jīng)Western blotting分析可見(jiàn)單一目的條帶，說(shuō)明制備的多克隆抗體具有較強(qiáng)的特異性。綜上可知，M17重組蛋白表達(dá)成功，且制備的抗M17多克隆抗體可用于M17蛋白的生物學(xué)功能研究。

關(guān)鍵詞：牙鲆；M17蛋白；原核表達(dá)；重組蛋白；多克隆抗體

中圖分類(lèi)號(hào)：S96??? ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????????? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2023.08.008

Prokaryotic Expression and Polyclonal Antibody Preparation of M17 Protein in Flounder （Paralichthys olivaceus）

SU Yufeng， MA Qianqian， SUN Jingfeng

（College of Fisheries， Tianjin Agricultural University/Tianjin Key Laboratory of Aquatic Ecology and Aquaculture， Tianjin 300384， China）

Abstract： M17， a member of cytokine IL-6 subfamily， has cytokine-like functions and exerts antiviral and antibacterial effects in fish. To prepare polyclonal antibody against the M17 protein of Paralichthys olivaceus， the M17 gene was inserted into the pET-32a vector to construct a prokaryotic expression plasmid pET-32a-M17. The constructed plasmid pET-32a-M17 was transformed into competent E. coli BL21（DE3） cells， and the expression of M17 protein was induced by IPTG. The recombinant protein was purified by Ni-NTA affinity chromatography. The polyclonal antibody （antiserum） was obtained by immunizing mice with purified recombinant M17 protein.The results showed that the molecular weight of M17 protein was 50.0 ku， and the recombinant M17 protein was mainly expressed in inclusion body. After purification by Ni-NTA affinity chromatography， the concentration of M17 recombinant protein was 597 μg·mL-1. The titer of the polyclonal antibody was 1∶16 by double immunodiffusion. A single target band was observed by western blotting analysis， indicating that the prepared polyclonal antibody had a strong specificity. These results indicates that the recombinant M17 protein is successfully expressed， and the prepared anti-M17 polyclonal antibody could be used to study the biological function of M17.

Key words： Paralichthys olivaceus; M17 protein; prokaryotic expression; recombinant protein; polyclonal antibody

哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素（IL）-6細(xì)胞因子家族包括IL-6、抑癌素M（OSM）、IL-11、纖毛神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（CNTF）、心肌營(yíng)養(yǎng)素樣細(xì)胞因子（CLC）、白血病抑制因子（LIF）、心肌營(yíng)養(yǎng)素-1（CT-1）和IL-27[1-5]。IL-6細(xì)胞因子家族是造血、神經(jīng)內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)的主要參與者，既具有促進(jìn)炎癥的功能，也可以抵抗炎癥發(fā)作[2，6-7]。一些研究已證實(shí)，在魚(yú)類(lèi)中存在IL-6、IL-11、CNTF和M17等IL-6細(xì)胞因子家族，而M17被鑒定為可能是LIF和OSM的祖先分子的魚(yú)類(lèi)特異性分子[7]。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）屬鰈形目（Pleurone-ctiformes），鲆科（Bothidae），牙鲆屬（Paralichthys），是我國(guó)名貴的海產(chǎn)魚(yú)類(lèi)，但在養(yǎng)殖過(guò)程中會(huì)面臨如殺魚(yú)愛(ài)德華氏菌或鰻弧菌等各種病害威脅[8]。M17是魚(yú)類(lèi)細(xì)胞因子IL-6亞族家族的成員之一，M17具有細(xì)胞因子樣功能，在魚(yú)體內(nèi)發(fā)揮抗病毒和抗細(xì)菌的作用[9]。此外，Hanington等[7]研究發(fā)現(xiàn)，M17可誘導(dǎo)金魚(yú)巨噬細(xì)胞分化和一氧化氮的產(chǎn)生。M17在巨噬細(xì)胞亞群中的表達(dá)量比在單核細(xì)胞和祖細(xì)胞中高，而且在激活的巨噬細(xì)胞內(nèi)表達(dá)被上調(diào)，用重組的M17處理單核細(xì)胞亞群會(huì)加速單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化，說(shuō)明它在髓細(xì)胞生成中發(fā)揮重要作用。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，抑制M17在神經(jīng)系統(tǒng)中會(huì)延遲恢復(fù)視神經(jīng)損傷。目前，有關(guān)M17的分子生物學(xué)特征以及免疫生物學(xué)活性，特別是對(duì)魚(yú)類(lèi)機(jī)體非特異性免疫和特異性免疫調(diào)節(jié)作用的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究構(gòu)建M17的原核表達(dá)載體pET-32a-M17，利用原核表達(dá)M17制備M17多克隆抗體，為研究牙鲆M17的功能打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 基因、載體及試劑

牙鲆M17基因M17的全長(zhǎng)cDNA由天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室克隆于pMD18-T載體上。原核表達(dá)載體pET-32a、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌Rosetta（DE3）由天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。限制性?xún)?nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ ，寶生物工程（大連）有限公司；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），北京索萊寶科技有限公司；Ni-NTA親和層析柱、蛋白Marker，Merck公司；羊抗鼠IgG-HRP、Anti-His Antibody、Western-blotting硝酸纖維素膜，北京天根生化科技有限公司；健康BALB/c小鼠10只，雌性，4～5周齡，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 M17原核表達(dá)載體構(gòu)建

PCR擴(kuò)增M17的ORF區(qū)的引物采用生物軟件BioEdit設(shè)計(jì)，由華大基因合成，預(yù)期擴(kuò)增片段為600 bp。上游引物M17-F：5'-CGCGGATCCAATGGTTATG

TAAAGAGAATGA-3'，并引入一個(gè)上游BamH I限制性位點(diǎn)（下劃線）；下游引物M17-R：5'-CCCAAGCTTGTATCCCCCTGCAGACTTTG-3'，引入一個(gè)Hind III限制性位點(diǎn)（下劃線）。以pMD18-T-M17為模板，M17-F和M17-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。95 ℃預(yù)變性12 min；94 ℃變性30 s，56.3 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸90 s，連續(xù)30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切、凝膠純化后連接到同酶雙酶切的pET-32a表達(dá)載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中。陽(yáng)性克隆經(jīng)菌落PCR和DNA測(cè)序證實(shí)。理論上，得到的重組質(zhì)粒pET-32a-M17可以表達(dá)C端帶有額外6-His標(biāo)簽的M17融合蛋白，這有利于通過(guò)Ni2+螯合親和純化融合蛋白。

1.3 M17重組蛋白表達(dá)與可溶性檢測(cè)

陽(yáng)性克隆菌株經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，將表達(dá)菌株pET-32a-M17置于LB/Amp液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。次日，按照體積比1∶100加入到200 mL同樣的培養(yǎng)液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)。當(dāng)菌液OD600 nm達(dá)到0.5～0.6時(shí)，分別加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，37℃誘導(dǎo)4 h，取出50 mL菌液12 000 r·min-1離心10 min收集菌體沉淀。將菌體重懸于15 mL的PBS緩沖液中，超聲破碎菌體（超聲程序?yàn)椋?00 W，工作5 s，間歇10 s，共8 min），12 000 r·min-1離心10 min分別收集上清液和沉淀，并以未用IPTG誘導(dǎo)，未超生破碎菌液和pET-32a空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）做對(duì)照，進(jìn)行12% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)分析。

1.4 M17重組蛋白純化

按照Merck公司Ni-NTA親和層析柱說(shuō)明書(shū)純化表達(dá)蛋白。步驟如下，對(duì)單克隆陽(yáng)性菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，參照1.3離心收集100 mL菌液的菌體并加入4 mL預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液，重懸菌體，超聲波破碎，4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀。加入與5 mL預(yù)冷含6 mol·L-1鹽酸胍的1×結(jié)合緩沖液，重懸沉淀，冰浴1 h，4 ℃下12 000 r·min-1離心30 min，去除不溶成分。用0.45 μm濾膜過(guò)濾，取上清液。將上清加到1 mL50% Ni-NTA His·Bind樹(shù)脂懸浮液中，4 ℃輕柔混勻（300 r·min-1），室溫結(jié)合60 min。加樣至空色譜柱中，除去柱下端封閉蓋子，以4 mL Bufffer B漂洗雜蛋白2次，以0.5 mL Bufffer C洗脫目的蛋白4次。對(duì)純化的蛋白進(jìn)行透析和濃縮，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定樣品中蛋白的濃度并通過(guò)SDS-PAGE電泳和Western blotting進(jìn)行驗(yàn)證，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 多克隆抗體制備及檢測(cè)

將純化復(fù)性M17蛋白用于免疫10只小鼠制備抗體。免疫前，每只小鼠尾靜脈取血1 mL，血液在37 ℃放置1 h后，置于4 ℃過(guò)夜，然后在4 ℃下以5 000 r·min-1離心20 min。收集血清作為陰性對(duì)照。具體免疫方案如表1所示。首次免疫將M17蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合乳化后，背部和腹腔多點(diǎn)皮下注射免疫小鼠。2周后，使用弗氏不完全佐劑乳化重組蛋白，采用腹腔皮下注射，加強(qiáng)免疫2次，每次間隔7 d。之后采用腹腔皮下注射M17蛋白4次，每次間隔7 d。第7次免疫5 d后，通過(guò)眼球采小鼠血，根據(jù)上述方法收集抗血清并隨后在-80 ℃保存直至進(jìn)一步使用。采用雙向瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散法檢測(cè)抗體效價(jià)，并采用Western blotting檢測(cè)抗血清特異性。

1.6 雙向瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)定抗血清效價(jià)

采用雙向瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散法檢測(cè)抗體效價(jià)，具體步驟參照張淑莉等[11]方法。將培養(yǎng)皿洗凈烘干高壓滅菌備用，配制1%生理鹽水瓊脂，倒平板，厚約2～3 mm，待瓊脂凝固后，用打孔器打孔（孔徑3 mm，孔間距5 mm），呈梅花形，挑去孔內(nèi)瓊脂。用移液器加樣，中心孔加抗原原液約20 μL，周?chē)骺装错樞蛞来渭尤?0 μL倍比稀釋抗血清，抗體分別是1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64，注意加樣時(shí)以注滿(mǎn)為度，不要有氣泡。加完樣后將培養(yǎng)皿置于濕盒內(nèi)，放入恒溫箱37℃擴(kuò)散24 h，觀察有無(wú)沉淀線產(chǎn)生，以出現(xiàn)明顯沉淀線的最高稀釋度作為檢測(cè)血清效價(jià)。

1.7 Western blotting檢測(cè)分析

用12%的SDS-PAGE將蛋白質(zhì)分離后，將凝膠浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中，在300 mA下，使用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到膜上60 min。在室溫下，將膜在5%脫脂奶粉中孵育1 h，然后用PBST洗滌3次（每次10 min）。將膜與Anti-His Antibody（1∶300）或制備的抗M17多克隆抗體（1∶300）在4 ℃孵育過(guò)夜。洗滌3次后，將膜與二抗（HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，稀釋度為1∶500）在37 ℃孵育1 h。然后用PBST洗滌3次，用PBS洗滌1次。使用DAB顯色液避光顯色，觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET-32a-M17重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定結(jié)果

采用PCR方法從pET-32a模板中擴(kuò)增出編碼M17蛋白的開(kāi)放讀碼框。在引物中設(shè)計(jì)BamH I和Hind III位點(diǎn)，便于克隆到pET-32a載體中。將600 bp的PCR產(chǎn)物克隆到pET-32a載體中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α。通過(guò)PCR和酶切篩選克?。▓D1），菌落PCR鑒定結(jié)果顯示，在600 bp處附近出現(xiàn)單一、明亮的目的條帶，而陰性對(duì)照則無(wú)目的條帶（圖1-A）。雙酶切驗(yàn)證結(jié)果可見(jiàn)在600 bp和6 300 bp處有電泳條帶（圖1-B）。

2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性檢測(cè)結(jié)果

pET-32a-M17重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)后取樣，SDS-PAGE結(jié)果顯示約50 ku左右出現(xiàn)表達(dá)條帶，其大小與M17預(yù)測(cè)分子量一致。此外，誘導(dǎo)組的上清液中沒(méi)有明顯的條帶出現(xiàn)（圖2樣品g），而沉淀中出現(xiàn)明顯條帶（圖2樣品h）。這說(shuō)明目的蛋白主要在包涵體中表達(dá)。而陰性對(duì)照組pET-32a空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和不誘導(dǎo)，以及pET-32a-M17重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）不誘導(dǎo)均未見(jiàn)目的條帶（圖2樣品a、b、c、d、e），與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3 重組蛋白純化及Western blotting檢測(cè)結(jié)果

利用Ni-NTA親和層析柱對(duì)M17重組蛋白的富集作用，通過(guò)洗脫液洗脫后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)可看見(jiàn)在50 ku左右有目的蛋白條帶，條帶單一清晰（圖3-A），純化透析得到的M17重組蛋白濃度為579 μg·mL-1（表2），其Western blotting顯示Anti-His Antibody能特異性識(shí)別大小約為50 ku的條帶，其大小與SDS-PAGE結(jié)果一致，表明Anti-His Antibody所識(shí)別蛋白即為目的蛋白，且具有良好的生物活性（圖3-B）。

2.4 免疫效價(jià)及特異性檢測(cè)結(jié)果

純化復(fù)性后的M17重組蛋白免疫小鼠制備M17多克隆抗體，采用瓊脂糖雙向擴(kuò)散法檢測(cè)其抗體效價(jià)結(jié)果表明該多克隆抗體的抗體效價(jià)達(dá)1∶16（圖4-A），可進(jìn)行抗原特異性識(shí)別。進(jìn)一步采用Western blotting檢測(cè)多克隆抗體的特異性，結(jié)果顯示，各孔上等量的純化的M17蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，利用不同稀釋倍數(shù)的血清作為一抗在相同的孵育時(shí)間進(jìn)行Western blotting，均在50 ku處可見(jiàn)單一條帶，且1∶400倍稀釋血清的條帶最深，為最佳稀釋濃度（圖4-B）。

3 討論與結(jié)論

免疫系統(tǒng)主要功能是防御和維護(hù)機(jī)體自身穩(wěn)定，細(xì)胞因子是魚(yú)類(lèi)免疫系統(tǒng)的重要組成部分。細(xì)胞因子M17是神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的參與者，在魚(yú)體內(nèi)可發(fā)揮抗病毒和抗細(xì)菌的作用[9]。在國(guó)外研究中，M17已在鯉魚(yú)、金魚(yú)、斑馬魚(yú)、綠斑點(diǎn)河豚和虎河豚中被報(bào)道[7，9-10]。然而，M17的研究目前僅涉及克隆基因以及分析細(xì)菌、脂多糖和肽聚糖對(duì)M17在魚(yú)體內(nèi)表達(dá)的影響。有關(guān)M17的分子生物學(xué)特征以及免疫生物學(xué)活性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究利用原核表達(dá)M17制備M17多克隆抗體，為研究牙鲆M17的功能打下基礎(chǔ)。

基因重組技術(shù)在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室是一項(xiàng)非常重要的技術(shù)，可使目的DNA在外源宿主細(xì)胞中繁殖并表達(dá)以產(chǎn)生重組蛋白[12]。根據(jù)表達(dá)宿主的不同，蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)可分為原核和真核表達(dá)系統(tǒng)。其中，真核表達(dá)系統(tǒng)具有翻譯后加工修飾的功能，但成本高。原核表達(dá)系統(tǒng)是研究最多、掌握最成熟的表達(dá)系統(tǒng)，不僅成本低，表達(dá)效率還高，適用于制備多克隆抗體[13-14]。pET系列載體具有構(gòu)建效率高、蛋白表達(dá)量高、標(biāo)簽小、易分離純化等優(yōu)勢(shì)[15]。pET-32a表達(dá)載體在N-端和C-端均有His-Tag標(biāo)簽，后續(xù)可采用Ni-NTA親和層析柱對(duì)蛋白進(jìn)行純化。因此，本研究采用pET-32a表達(dá)載體構(gòu)建pET-32a-M17重組質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在IPTG誘導(dǎo)下M17重組蛋白主要在包涵體中得到高效的表達(dá)。而包涵體形成的主要原因是原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏翻譯后修飾過(guò)程和輔助蛋白折疊的機(jī)制，使得外源基因沒(méi)有辦法達(dá)到自發(fā)折疊和卷曲，從而不能形成具有一定結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)，只能以不溶性沉淀物的形式表達(dá)[16]。包涵體的聚集不會(huì)使酶或蛋白失活[17]。因此，本研究采用包涵體的純化方法直接純化M17重組蛋白用于制備M17的多克隆抗體，發(fā)現(xiàn)抗體能與純化的M17蛋白發(fā)生特異反應(yīng)，為今后開(kāi)展 M17蛋白的表達(dá)定位、Western blotting、免疫沉淀等試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。本研究成功誘導(dǎo)表達(dá)M17蛋白并制備了M17多克隆抗體，為進(jìn)一步開(kāi)展M17蛋白功能與作用機(jī)制的研究提供了重要保障。

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收稿日期：2023-04-18

基金項(xiàng)目：天津市海水養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（ITTMRS2021007）

作者簡(jiǎn)介：蘇玉鳳（1996―），女，廣東高州人，在讀碩士生，主要從事魚(yú)類(lèi)疾病與免疫學(xué)研究。

通訊作者簡(jiǎn)介：孫敬鋒（1976—），男，山東泰安人，教授，博士，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物疾病與免疫防控研究。