單細(xì)胞分析技術(shù)在炎癥和衰老領(lǐng)域中的研究進(jìn)展

侯雪冬 ，李錫勇 ，董文文，白駿恒，韓鵬飛

1.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院研究生處，山西長(zhǎng)治 046000；2.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院乳腺科，山西長(zhǎng)治 046000；3.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院骨科，山西長(zhǎng)治 046000

近年來，人口老齡化領(lǐng)域的研究取得了一些進(jìn)展，尤其在細(xì)胞衰老和炎癥方面。Baar MP等[1]和Baker DJ等[2]的研究發(fā)現(xiàn)清除衰老細(xì)胞可以明顯改善實(shí)驗(yàn)小鼠的健康狀態(tài)和生存活力。而與此同時(shí)，單細(xì)胞測(cè)序（分析）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，鑒于不同類型的細(xì)胞發(fā)生炎癥和衰老的模式或途徑不同，因此，將單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)與細(xì)胞衰老和炎癥領(lǐng)域研究二者相融合會(huì)更加有理論依據(jù)和應(yīng)用前景。

衰老及衰老相關(guān)的炎癥研究熱點(diǎn)更多著眼于該生物學(xué)事件的全過程，而目前單細(xì)胞測(cè)序更多的是橫向組學(xué)研究，即所有轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)都是單一細(xì)胞水平的橫斷面數(shù)據(jù)。除Schüssler-Fiorenza RoseSM等[3]少數(shù)已使用批量轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序外，仍然缺乏與衰老過程相關(guān)的單細(xì)胞水平縱向多組學(xué)研究。而鑒于在個(gè)體層面上，原則上可以從同一個(gè)體反復(fù)提取血液或組織樣本，因此，未來縱向多組學(xué)研究是可行的。另外，目前單細(xì)胞測(cè)序標(biāo)本是基于不同時(shí)間點(diǎn)的不同物種來源的差異性個(gè)體，涉及到與衰老全過程相關(guān)的RNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)變化缺乏時(shí)間軸上序列觀察（監(jiān)測(cè)），且Bahar R等[4]和Martinez-Jimenez CP等[5]研究發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加細(xì)胞轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性也隨之增大，因此縱向多組學(xué)研究也是必要的。

在大多數(shù)情況下，單細(xì)胞測(cè)序是基于預(yù)先公布的特定標(biāo)記基因來定義細(xì)胞類型的。目前，人們普遍認(rèn)為細(xì)胞衰老并不意味著細(xì)胞類型的改變，而是與年齡相關(guān)的特定細(xì)胞類型的狀態(tài)變化，尤其是生物學(xué)功能方面的退化，即細(xì)胞衰老的研究，聚焦在與細(xì)胞衰老相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)變化。例如，某種類型的細(xì)胞可處于“早期”或“晚期”以及“部分”或“完全”狀態(tài)。此外，結(jié)合細(xì)胞結(jié)局（死亡、發(fā)病和/或功能障礙）和組學(xué)數(shù)據(jù)可以選定預(yù)測(cè)衰老相關(guān)結(jié)局的生物標(biāo)志物。

1 細(xì)胞衰老與炎癥

最早關(guān)于細(xì)胞衰老的研究是Hayflick L等[6]1961開展的，其研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)人類二倍體成纖維細(xì)胞在培養(yǎng)過程中具有有限的復(fù)制潛能，隨后細(xì)胞進(jìn)入不可逆的復(fù)制停滯狀態(tài)。而Harley CB等[7]認(rèn)為這種細(xì)胞分裂的復(fù)制性衰老現(xiàn)象與端粒DNA的不斷丟失有關(guān)。由于DNA聚合酶具有5′->3′方向性，復(fù)制機(jī)制不能復(fù)制線性染色體的末端，因此，隨著時(shí)間的推移，DNA的丟失最終會(huì)觸發(fā)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，阻止細(xì)胞進(jìn)一步分裂。這種復(fù)制性衰老，也被R?hme D[8]稱為海弗利克極限，存在于許多物種中，并認(rèn)為其與最長(zhǎng)壽命相關(guān)，并由Harley CB等[7]總結(jié)為衰老的端粒理論。

然而，近年來，除端粒磨損作為誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的機(jī)制之外，Campisi J[9]和 Coppé JP 等[10]還發(fā)現(xiàn)各種類型的應(yīng)激，包括活性氧、輻射、DNA損傷劑和未折疊蛋白反應(yīng)都參與了細(xì)胞衰老的誘導(dǎo)過程[9-10]。因此，McHugh D等[11]認(rèn)為細(xì)胞衰老是細(xì)胞的一種特殊應(yīng)激反應(yīng)狀態(tài)，伴隨著廣泛的細(xì)胞形態(tài)和生化改變。另外，衰老細(xì)胞經(jīng)常分泌細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的炎癥混合物，形成所謂的衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）。這種旁分泌信號(hào)進(jìn)而產(chǎn)生組織重塑、慢性炎癥甚至腫瘤發(fā)生等一系列負(fù)面影響。

衰老細(xì)胞是復(fù)制停滯但存在分泌表型、應(yīng)激反應(yīng)和代謝改變的一些細(xì)胞。用于鑒定細(xì)胞衰老的關(guān)鍵標(biāo)志物是β-半乳糖苷酶 和p16（CDKN2A）或p21（CDKN1A），后者在大多數(shù)衰老細(xì)胞中表達(dá)。

2 單細(xì)胞測(cè)序

2009年首次實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞的全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，此后，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，從僅對(duì)人工挑選的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序，發(fā)展到對(duì)數(shù)十萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模多重測(cè)序，目前，單細(xì)胞測(cè)序已經(jīng)成為一種成熟且可獲得的技術(shù)，涉及單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)基因組、轉(zhuǎn)錄組或表觀基因組等多個(gè)領(lǐng)域。此外，隨著測(cè)序協(xié)議的出現(xiàn)，單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析方法也迅速興起。目前可用于單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)分析的工具資源已多達(dá)630多種。雖然在某些情況下，一套預(yù)定義的工具和參數(shù)可以提高單細(xì)胞測(cè)序的分析速度和數(shù)據(jù)的可重復(fù)性。然而，由于分析工具和計(jì)算方法的數(shù)量龐大，單細(xì)胞測(cè)序分析仍處于快速發(fā)展中。值得慶幸的是，單細(xì)胞測(cè)序工作流程的每個(gè)步驟均已進(jìn)行了基準(zhǔn)研究，因此，可根據(jù)項(xiàng)目需求選擇性使用。

3 細(xì)胞衰老的單細(xì)胞分析

3.1 多組織研究

Tabula Muris Consortium[12]在小鼠體內(nèi)進(jìn)行多組織研究，選取了6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的18個(gè)組織，1~30月，報(bào)告了約53萬個(gè)基因表達(dá)。值得注意的是，在老年小鼠中，表達(dá)衰老標(biāo)記物p16（CDKN2A）的細(xì)胞比例增加了一倍。Zhang W等[13]隨后對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，指出包括 Ubq、App、Ctnnb1、Mapk1、Rac1、Arf1和Junb等在內(nèi)的20個(gè)“衰老基因”，其表達(dá)在超過50%的細(xì)胞類型中隨年齡增加而顯著變化，故認(rèn)為其與細(xì)胞衰老有關(guān)。其中Ubq是唯一具有良好特征的基因，這表明蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)在小鼠衰老中發(fā)揮重要作用。另外，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路水平上，mTOR通路被發(fā)現(xiàn)顯著下調(diào)，這與衰老細(xì)胞轉(zhuǎn)錄下調(diào)的總體趨勢(shì)相匹配。

而Kimmel JC等[14]研究，分析了幼齡（7月齡）和老齡（21月齡）小鼠的約55 000個(gè)單細(xì)胞，分別來自肺、腎和脾臟。研究發(fā)現(xiàn)，與年齡相關(guān)的基因表達(dá)變化在很大程度上是細(xì)胞類型特異性的，而較少依賴于組織類型。此外，也發(fā)現(xiàn)了大約200個(gè)基因在5種以上的細(xì)胞類型中有不同水平的表達(dá)。這些基因優(yōu)先參與蛋白質(zhì)運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)及炎癥發(fā)生過程。

3.2 單組織研究

相關(guān)學(xué)者研究數(shù)據(jù)顯示，與年輕小鼠相比，研究了10個(gè)衰老相關(guān)基因，這些基因在更多老年小鼠細(xì)胞中表達(dá)，尤其是在肝臟的庫普弗細(xì)胞中。而Franceschi C等[15]的研究則發(fā)現(xiàn)幾乎100%的庫普弗細(xì)胞中都存在于老年小鼠中，但在年輕小鼠的這些細(xì)胞中僅有37%出現(xiàn)。庫普弗細(xì)胞是常駐肝臟的巨噬細(xì)胞，衰老的庫普弗細(xì)胞吞噬和自噬能力降低，并表現(xiàn)出促進(jìn)炎癥的炎癥表型增加。尤其是白細(xì)胞介素-1b（interleukin 1b, IL-1b），它是一種參與炎癥的細(xì)胞因子，也是衰老相關(guān)分泌表型（senescence-associated secretory phenotype, SASP）的組成部分。此外，Elyahu Y等[16]發(fā)現(xiàn)在酒精性脂肪性肝炎的情況下，IL-1b與肝臟炎癥和細(xì)胞衰老有關(guān)。

3.2.1 血液和動(dòng)脈 由于血液標(biāo)本易于獲取，故首先被應(yīng)用于單細(xì)胞測(cè)序研究中。相關(guān)學(xué)者通過研究幼齡（3月齡）和老齡（21月齡）小鼠在接受體外免疫刺激前后1 500個(gè)幼稚CD4+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄模式發(fā)現(xiàn)，與幼齡小鼠相比，老齡小鼠參與免疫激活過程的基因?qū)Υ碳び休^低幅度反應(yīng)，且表現(xiàn)出更大的細(xì)胞間轉(zhuǎn)錄變異性，這提示免疫衰老。而Elyahu Y等[16]在研究了幼齡和老齡小鼠中約24 000個(gè)CD4+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組后，報(bào)告了免疫衰老特征性的幼稚CD4+細(xì)胞的減少。細(xì)胞毒性、耗竭和活化的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞由于其可表達(dá)炎性細(xì)胞因子（主要是IL-27、IFNb和IL-6），故被認(rèn)為可能反映了老齡小鼠的炎癥特征，而這3種CD4+亞型在幼齡動(dòng)物中卻很少觀察到。

Grover A等[17]在一項(xiàng)與年齡相關(guān)轉(zhuǎn)錄特征的研究時(shí)，通過對(duì)幼齡（2~3月齡）和老齡（20~25月齡）小鼠的造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells, HSC）進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)特定的“老”星狀細(xì)胞亞群的積累，血小板譜系基因表達(dá)上調(diào)的同時(shí)，還伴隨著與年齡相關(guān)的紅細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞減少的現(xiàn)象。但是，當(dāng)關(guān)鍵血小板編程因子FOG-1受損時(shí)，HSC生成淋巴樣細(xì)胞能力卻可以得到恢復(fù)。

Elyada E等[18]在單細(xì)胞水平上研究了幼齡（6歲）和老齡（20歲）食蟹猴主動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈的差異。他們檢測(cè)了近8 000個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞，平均每個(gè)細(xì)胞識(shí)別出了3 100個(gè)基因，其中有515個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，259個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，并且通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)FOXO3A是動(dòng)脈老化的關(guān)鍵調(diào)控因子。

3.2.2 胰腺 研究顯示，細(xì)胞衰老與胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic duct adenocarcinoma, PDAC）和糖尿?。?型和2型）的發(fā)展和治療有關(guān)。相關(guān)學(xué)者在研究胰腺衰老標(biāo)志物時(shí)發(fā)現(xiàn)，與年輕供體相比，在老年供體胰腺細(xì)胞中存在更高比例的p16（CDKN2A），并推測(cè)衰老胰腺中衰老細(xì)胞的比例增加，但由于細(xì)胞外基質(zhì)存在，可能會(huì)阻止旁分泌作用，因此衰老細(xì)胞周圍的正常細(xì)胞不會(huì)受到影響。

Elyada E等[18]對(duì)PDAC中涉及的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts, CAFs）進(jìn)行了詳細(xì)研究，認(rèn)為CAFs通過修飾膠原交聯(lián)、分泌多種細(xì)胞因子（諸如趨化因子和生長(zhǎng)因子）以及招募免疫抑制細(xì)胞來促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，而?zdemir BC等[19]和Rhim AD等[20]研究顯示CAFs實(shí)際上限制了腫瘤的生長(zhǎng)。Elyada E等[18]在另一項(xiàng)對(duì)人類和小鼠胰腺細(xì)胞進(jìn)行的單細(xì)胞研究中，表明CAFs實(shí)際上是由不同亞型組成的異質(zhì)細(xì)胞群，例如肌成纖維細(xì)胞CAF（myCAF）、炎癥性CAF（iCAF）和抗原呈遞CAF（ap?CAF）。其中，iCAF與炎癥和細(xì)胞衰老密切相關(guān)，其表達(dá)的白細(xì)胞介素和細(xì)胞因子也具有SASP特征。

為了研究胰島衰老細(xì)胞如何參與人類和非肥胖糖尿?。╪on-obese diabetic, NOD）小鼠模型的1型糖尿?。╰ype 1 diabetes, T1D）的發(fā)展，Thompson PJ等[21]對(duì)8、14和16周齡NOD小鼠的21 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞scRNA-seq測(cè)序。他們發(fā)現(xiàn)β細(xì)胞成熟標(biāo)記物Ucn3在該簇中被發(fā)現(xiàn)耗盡，且通過去除抗衰老化合物（BCL-2抑制劑）可以防止NOD小鼠出現(xiàn)T1D，這表明免疫系統(tǒng)在T1D的情況下無法清除衰老細(xì)胞，因此認(rèn)為衰老可作為T1D的一種治療措施。

3.2.3 大腦 Ximerakis M等[22]在對(duì)幼齡和老齡小鼠的腦組織大約50 000個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行了研究，通過差異基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在許多細(xì)胞類型中，選定的轉(zhuǎn)錄基因組的表達(dá)變異系數(shù)在年輕細(xì)胞和衰老細(xì)胞之間存在差異，但是在大多數(shù)腦細(xì)胞類型中，衰老和衰老相關(guān)的通路上調(diào)的同時(shí)，核糖體蛋白的轉(zhuǎn)錄似乎也都是上調(diào)的。

而Kiss T等[23]研究描述了老齡小鼠大腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)，可以導(dǎo)致血管性認(rèn)知障礙和阿爾茨海默病等疾病。他們通過離心、過濾和分離從小鼠中提取和消化的腦組織，選定表達(dá)模式和預(yù)先編制的衰老標(biāo)志物列表（如CDKN2A和Bmi1）聚類鑒定衰老的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)約10%腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞衰老（相當(dāng)于75歲人類的生物學(xué)改變）。

小膠質(zhì)細(xì)胞，即大腦中的巨噬細(xì)胞，根據(jù)體外刺激方法，它們被分為靜息型、M1促炎型和M2抗炎型。Hammond TR等[24]進(jìn)行了小鼠腦小膠質(zhì)細(xì)胞從胚胎發(fā)育到老齡的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。他們發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞亞群在衰老過程中異質(zhì)性增加。一些衰老的小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Ccl4趨化因子且被認(rèn)為與炎癥相關(guān)。

3.2.4 肺臟 Angelidis I等[25]對(duì)幼齡（3月齡）和老齡（24月齡）動(dòng)物的約15 000個(gè)肺細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序，并確定了30種不同的細(xì)胞類型。通過單細(xì)胞scRNA-seq與蛋白組學(xué)相結(jié)合，試圖在基因轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平上發(fā)現(xiàn)折疊變化之間的顯著相關(guān)性，如Ⅳ型膠原mRNA水平呈年齡相關(guān)性下降，但蛋白水平卻呈年齡相關(guān)性上升趨勢(shì)。

正如Enge M等[26]通過富集分析發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞類型中膽固醇的生物合成增加一樣，他們觀察到慢性炎癥，并且認(rèn)為氣道上皮細(xì)胞的相對(duì)頻率改變是肺衰老的標(biāo)志，并進(jìn)一步推測(cè)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的失調(diào)和上皮細(xì)胞衰老有關(guān)。而Reyfman PA等[27]基于對(duì)不同年齡的8名健康供體和8例肺纖維化患者的約76 000個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在源自纖維化肺組織的肺泡Ⅱ型干細(xì)胞群體中，復(fù)制性衰老的1 311基因特征得分最高。

3.2.5 皮膚 Solé-Boldo L等[28]從男性供體受陽光保護(hù)的腹股溝皮膚區(qū)域收集15 000多個(gè)皮膚細(xì)胞，并在樣本中發(fā)現(xiàn)了14種已知細(xì)胞類型，其中，他們根據(jù)聚類（t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding,t-SNE）圖和GO術(shù)語富集分析識(shí)別出4種成纖維細(xì)胞亞型（包括分泌性乳頭狀成纖維細(xì)胞、分泌性網(wǎng)狀成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)成纖維細(xì)胞和促炎成纖維細(xì)胞）。此外，他們比較了年輕與老年捐贈(zèng)者的樣本，以研究年齡依賴性變化，揭示成纖維細(xì)胞具有一組特定亞型的“皮膚衰老相關(guān)分泌蛋白”（skin-aging associated secreted proteins, SAASP），這與之相關(guān)學(xué)者的研究結(jié)果保持一致。但值得注意的是，研究皮膚衰老過程必須特別小心，因?yàn)槿祟惐┞对陉柟庀碌摹肮饫匣睍?huì)強(qiáng)烈影響衰老相關(guān)過程，這成為研究的主要混雜因素。

3.2.6 肌肉 Hernando-Herraez I等[29]在使用來自幼齡（2月齡）和老齡（25月齡）小鼠的377個(gè)單肌肉干細(xì)胞同時(shí)，根據(jù)標(biāo)記Pax7對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類，并檢測(cè)相同細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化。他們發(fā)現(xiàn)在幼齡小鼠和老齡小鼠的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平的異質(zhì)性增加。在單細(xì)胞水平上，啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化程度與基因表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)。

3.3 體外研究

Tang H等人報(bào)道的衰老細(xì)胞體外研究，通過培養(yǎng)HCA2成纖維細(xì)胞直至復(fù)制性衰老，并對(duì)來自早期、中期和晚期傳代的總共1200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)和端粒侵蝕研究[30]。他們還對(duì)早期傳代細(xì)胞進(jìn)行輻射應(yīng)激以誘導(dǎo)細(xì)胞過早衰老（Stress in?duced premature senescence, SIPS）并分析了其中的400個(gè)細(xì)胞。通過t-SNE的可視化分析不同傳代的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)晚期傳代衰老細(xì)胞比輻射應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞異質(zhì)性更高，并進(jìn)一步證實(shí)，細(xì)胞衰老不僅在不同的細(xì)胞類型中存在差異，而且還取決于引起衰老狀態(tài)的應(yīng)激源。

Aarts M等[31]采用文庫干預(yù)方法與單細(xì)胞測(cè)序相結(jié)合的方法，基于人類原代成纖維細(xì)胞（IMR90）表達(dá)的重編程因子，以利識(shí)別出最適合抑制細(xì)胞衰老的shRNA。他們鎖定得分最高的4個(gè)靶基因分別為p21、MTOR、MYOT和UBE2E1，并認(rèn)為后兩者可作為肌節(jié)部分和E2泛素結(jié)合酶新的候選基因。而Banito A等[32]也報(bào)道了轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的重編程應(yīng)激可降低iPSC生成的效率并進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞衰老。

綜上所述，細(xì)胞衰老標(biāo)志物表達(dá)頻率和總量的增加，以及轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性增加（通常是由DNA雙鏈斷裂等損傷引起的），這些是單細(xì)胞研究揭示最常見的細(xì)胞衰老模式，伴隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，將為未來衰老方面的研究提供更廣闊的應(yīng)用前景和理論貢獻(xiàn)。