布魯氏菌抗體鑭系高敏熒光快速檢測(cè)試劑盒的研制

章 健，侯 巍，張朝輝，曲 伍，李 勁，尹 杰，郇 敏，王澤洲，*

（1.成都微瑞生物科技有限公司，四川 成都 611731；2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；3.四川省甘孜州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 康定 626000；4.四川省涼山州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 西昌 615000；5.浙江省桐廬縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 桐廬 311500）

布魯氏菌病（簡(jiǎn)稱布?。┦怯刹剪斒蠗U菌引起的以生殖器官和黏膜發(fā)炎，流產(chǎn)、不育和多種組織局部病灶為特征的人畜共患慢性接觸性傳染病。在家畜中牛羊最常發(fā)生，豬次之，而且可傳染其他家畜和人，嚴(yán)重危害人類健康，同時(shí)給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。疫苗免疫是控制動(dòng)物布病的有效方法，目前常用的疫苗有豬型2 號(hào)苗，羊型5 號(hào)苗、A19 號(hào)苗。疫苗免疫后的抗體監(jiān)測(cè)，是控制和凈化布病的主要措施之一。目前國(guó)內(nèi)主要采用虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、ELISA、膠體金技術(shù)等檢測(cè)布病，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，普遍適用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。為了實(shí)現(xiàn)在基層和養(yǎng)殖場(chǎng)的快速即時(shí)檢測(cè)，本試驗(yàn)應(yīng)用鑭系元素作熒光標(biāo)記物研制了一種布魯氏菌抗體高敏熒光免疫層析快速檢測(cè)試劑盒（Bru-LFICA）。

1 材料與方法

1.1 材料 布魯氏菌脂多糖抗原（LPS）、布魯氏菌脂多糖抗原（LPS）單克隆抗體，鑭系熒光納米微球和Wellray?WR-1608高敏熒光分析儀；兔抗雞IgY 抗體、雞IgY 抗體；吸水紙、樣品墊、硝酸纖維素膜，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀亞胺，切條機(jī)和點(diǎn)膜噴金膜機(jī)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。牛、羊O型、A型口蹄疫陽(yáng)性血清，布魯氏桿菌陽(yáng)性血清及陰性血清均購(gòu)自青島立見診斷發(fā)展中心，臨床血清樣品由筆者單位收集保存。

制備包被膜、脂多糖LPS 抗原標(biāo)記微球、免疫競(jìng)爭(zhēng)法建立等均參照說(shuō)明書或按照相關(guān)要求操作［3-4］。

1.2 熒光免疫層析試紙條的組裝 在濕度小于30%，溫度20～25 ℃的環(huán)境下，把吸水紙、標(biāo)記物墊和樣品墊按順序粘貼在聚氯乙烯底板上形成微反應(yīng)體系，然后將其切割成0.5 cm寬，即成試紙條（圖1），將試紙條裝入卡殼中制成檢測(cè)卡，裝入鋁箔袋封存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 鑭系熒光免疫層析法結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 特異性試驗(yàn) 試驗(yàn)選用牛、羊O 型、A 型口蹄疫陽(yáng)性血清進(jìn)行布病抗體高敏熒光免疫層析檢測(cè)，同時(shí)設(shè)牛、羊布病陽(yáng)性、陰性對(duì)照，以確定該試驗(yàn)方法是否發(fā)生交叉反應(yīng)。

1.4 敏感性試驗(yàn) 將布病強(qiáng)陽(yáng)性血清按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560 倍比稀釋，每個(gè)稀釋度平行做4 個(gè)重復(fù)，用建立的Bru-LFICA 檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)，判斷其抗體效價(jià)。

1.5 重復(fù)性試驗(yàn)

1.5.1 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn) 在相同條件下選取12份布病抗體水平不同的血清，每份血清樣本平行做8個(gè)重復(fù)，用組裝的Bru-LFICA試劑盒檢測(cè)（批號(hào)為20170912），然后對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5.2 批間重復(fù)性試驗(yàn) 在相同條件下選取12份布病抗體水平不同的血清，分別用4 批Bru-LFICA 試劑盒檢測(cè)（批號(hào)分別為20170426、20170616、20171123、201780119），然后對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 試劑盒的組裝及穩(wěn)定性試驗(yàn) Bru-LFICA試劑盒由熒光檢測(cè)儀、檢測(cè)卡、連接線組成。試劑盒置4 ℃保存，分別于保存后60、120、180、240、300、360、420、480、540 d 對(duì)布病陽(yáng)性和陰性參考血清進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 比對(duì)試驗(yàn) 選用221 份牛血清樣本進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)，選用203 份牛血清樣本進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)，選用31份陰、陽(yáng)性牛血清和31份陰、陽(yáng)性羊血清樣本進(jìn)行布病間接ELISA 試驗(yàn)，選用100份陰、陽(yáng)性牛血清樣本進(jìn)行美國(guó)ELISA檢測(cè)，同時(shí)用Bru-LFICA試劑盒檢測(cè)，比較其敏感性、特異性和符合率。

1.8 應(yīng)用試驗(yàn) 用本次研制的Bru-LFICA 試劑盒檢測(cè)各地市送檢的布病樣本1 736 份，了解布病血清抗體陽(yáng)性率。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)定條件的選擇 按照鑭系熒光免疫層析法的操作步驟，選擇標(biāo)記比例為1∶25 的免疫微球；選擇樣本稀釋倍數(shù)為10 倍的加樣量；選擇檢測(cè)時(shí)間為加樣后15 min。

2.2 檢測(cè)結(jié)果的判讀 加樣后，由于層析作用液體向前移動(dòng)，先后與包被在T 線和C 線上的抗體形成復(fù)合物，這時(shí)試紙條經(jīng)熒光檢測(cè)設(shè)備掃描顯示出2 條熒光帶（圖2）。C 線熒光掃描值基本一致，T 線值隨加樣中抗體濃度的增加而降低。相應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果以濃度為橫坐標(biāo)，阻斷率（1-T/T0）為縱坐標(biāo)，經(jīng)數(shù)據(jù)線性回歸處理后，擬合得出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3）。當(dāng)樣本為陰性時(shí)，布魯氏菌抗體濃度很低，T 線熒光值很高；當(dāng)樣本為陽(yáng)性時(shí)，布魯氏菌抗體濃度越高，T線熒光值越低，甚至檢測(cè)不出信號(hào)。無(wú)論是陽(yáng)性還是陰性結(jié)果，C 線總能顯示熒光，如果C 線沒(méi)有熒光顯現(xiàn)，無(wú)論T 線有無(wú)，結(jié)果均判為無(wú)效。

圖2 熒光微球免疫層析技術(shù)檢測(cè)布魯氏菌抗體的掃描圖譜

圖3 熒光微球免疫層析技術(shù)檢測(cè)布魯氏菌抗體的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 特異性試驗(yàn) 本試驗(yàn)用牛、羊O 型、A 型口蹄疫陽(yáng)性血清，經(jīng)Bru-LFICA 檢測(cè)，結(jié)果得出阻斷率（1-T/T0）值均低于10%（表1），呈陰性反應(yīng)；對(duì)牛、羊布魯氏菌陽(yáng)性血清都呈陽(yáng)性反應(yīng)；對(duì)牛、羊布魯氏菌陰性血清都呈陰性反應(yīng)。表明該方法與牛、羊O型、A型口蹄疫陽(yáng)性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，顯示出很好的特異性。

表1 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 敏感性試驗(yàn) 當(dāng)布病強(qiáng)陽(yáng)性血清稀釋至1∶640時(shí)，高敏熒光檢測(cè)仍為陽(yáng)性，而虎紅平板凝集試驗(yàn)只能檢測(cè)到1∶80 倍稀釋（表2）。證明該方法敏感性很好。

表2 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)分別小于5%和10%。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 試劑盒穩(wěn)定性試驗(yàn) 如表3 所示，Bru-LFICA試劑盒保存540 d后用于檢測(cè)陽(yáng)性血清、陰性血清，其變異系數(shù)均小于10%，說(shuō)明該診斷試劑盒保存18個(gè)月仍然穩(wěn)定有效，進(jìn)一步的穩(wěn)定性試驗(yàn)還在進(jìn)行中。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 比對(duì)試驗(yàn)

2.7.1 高敏熒光與虎紅平板、試管凝集試驗(yàn)的比較 選用203份牛血清同時(shí)進(jìn)行高敏熒光和虎紅平板凝集試驗(yàn)，結(jié)果表明其敏感性為100.00%，特異性為80.80%，符合率為88.18%。且高敏熒光方法的敏感性更高，能夠檢出虎紅平板漏檢的陽(yáng)性樣本。

選用221份牛血清同時(shí)進(jìn)行高敏熒光和試管凝集試驗(yàn)，結(jié)果表明其敏感性為100.00%，特異性為88.97%，符合率為93.21%。且高敏熒光方法能檢出試管凝集試驗(yàn)漏檢的陽(yáng)性樣本。

2.7.2 高敏熒光與中監(jiān)所ELISA方法的比較 選用31 份牛血清同時(shí)用中監(jiān)所牛布病間接ELISA與高敏熒光法檢測(cè)，結(jié)果表明其敏感性為100.00%，特異性為93.75%，符合率為96.77%。選用31 份羊血清同時(shí)用中監(jiān)所羊布病間接ELISA與高敏熒光法檢測(cè)，結(jié)果表明其敏感性、特異性和符合率均為100.00%。

2.7.3 高敏熒光與美國(guó)ELISA 方法的比較 試驗(yàn)選用100 份牛血清，同時(shí)用美國(guó)產(chǎn)ELISA 與高敏熒光法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明其敏感性為79.59%，特異性為94.12%，符合率為87.00%。

2.8 應(yīng)用試驗(yàn)

2.8.1 采集同一養(yǎng)羊場(chǎng)的血清，同時(shí)進(jìn)行虎紅平板試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)和高敏熒光法檢測(cè)，結(jié)果得出：虎紅平板試驗(yàn)的陽(yáng)性檢出率為53.72%，試管凝集試驗(yàn)的陽(yáng)性檢出率達(dá)到77.98%，高敏熒光法的陽(yáng)性檢出率達(dá)到92.44%（表4）。

表4 三種方法檢測(cè)布魯氏菌陽(yáng)性血清的檢出率比較

2.8.2 應(yīng)用本次研制的Bru-LFICA 試劑盒檢測(cè)各地市送檢的1 736 份樣本，檢出血清抗體陽(yáng)性134份，陽(yáng)性率為7.72%。

3 討論

3.1 試管凝集試驗(yàn)是我國(guó)法定的布病檢測(cè)方法，但操作繁瑣、費(fèi)時(shí)、不適于大批量抗體檢測(cè)，也受人為主觀因素的影響［5］。ELISA是目前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的免疫檢測(cè)技術(shù)，具有敏感性高、特異性強(qiáng)、人為因素影響相對(duì)較小，檢查微量、無(wú)輻射、高通量等優(yōu)點(diǎn)，但需要比較完備的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，操作人員得具有一定的專業(yè)技術(shù)水平和經(jīng)驗(yàn)，檢測(cè)一批樣品的流程至少需要2～4 h，在基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場(chǎng)的推廣應(yīng)用受到了一定的限制［6］。PCR 方法通常用作抗原檢測(cè)，需要專門的實(shí)驗(yàn)室、儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員，且成本較高。

3.2 鑭系高敏熒光免疫層析方法（LFICA）是結(jié)合了時(shí)間分辨熒光免疫分析法和層析技術(shù)而建立起來(lái)的一種超微量快速免疫檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、無(wú)污染，且測(cè)定范圍寬，試劑盒壽命長(zhǎng)，操作簡(jiǎn)單和無(wú)放射性等優(yōu)點(diǎn)。本研究建立的Bru-LFICA，既具有膠體金免疫層析法（GICA）簡(jiǎn)單、方便、快捷、適于基層等優(yōu)點(diǎn)，又具有ELISA敏感、特異、微量等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)專用設(shè)備檢查克服主觀臆斷，采用鑭系元素作熒光標(biāo)記克服了產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定的缺陷，檢測(cè)時(shí)間從2～4 h縮短到15～20 min，檢測(cè)不需要專業(yè)技術(shù)人員，檢測(cè)設(shè)備小巧便于攜帶，尤其適用于基層獸醫(yī)部門、養(yǎng)殖場(chǎng)和技術(shù)服務(wù)人員。