鐵皮石斛的組織培養(yǎng)及種植技術(shù)研究進(jìn)展

王美娟，趙千里，柏冰洋，向松竹，洪承昊，3

（1.神農(nóng)架林區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院，湖北 神農(nóng)架 442400；2.神農(nóng)架林區(qū)松柏林場(chǎng)，湖北 神農(nóng)架 442400；3.湖北省林業(yè)科學(xué)研究院，湖北 武漢 430075）

鐵皮石斛（Dendrobium officinaleKimura）又名黑節(jié)草，是中國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，位列“中華九大仙草”之首［1，2］，被《中國(guó)藥典》（2015 版）等藥學(xué)典籍收錄［3］，其有效成分主要是多糖、生物堿等［4］，具有益胃生津、滋陰清熱、抗氧化、提高免疫力以及防癌抗癌等功效［5］。自然條件下附生于巖石或樹干上，喜半陰半陽(yáng)、溫暖、濕潤(rùn)且通風(fēng)排水良好的環(huán)境［6］。野生鐵皮石斛藥用價(jià)值高，市場(chǎng)價(jià)逐漸升高，引起人們大量采挖，加上野生鐵皮石斛對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較高，自然結(jié)實(shí)率低、種子自然萌發(fā)率低（低于3%）等原因［4］，導(dǎo)致鐵皮石斛野生資源瀕臨枯竭。

為有效保護(hù)野生資源，中國(guó)從20 世紀(jì)70年代開始了鐵皮石斛的繁殖研究［7，8］，在此基礎(chǔ)上開展了仿野生種植試驗(yàn)并取得了初步成功［9］。據(jù)報(bào)道，截至2021年8月貴州省石斛種植面積達(dá)1.13 萬(wàn)hm2，居全國(guó)第一，浙江、福建、云南、廣西、湖北等地也形成了種植產(chǎn)業(yè)。人工種植技術(shù)的研究既能滿足市場(chǎng)對(duì)藥用鐵皮石斛的需求，又能有效保護(hù)野生資源，本研究旨在總結(jié)鐵皮石斛人工種植技術(shù)，為鐵皮石斛的研究及種植提供技術(shù)參考。

1 鐵皮石斛的生物學(xué)特性

鐵皮石斛屬蘭科（Orchidaceae）石斛屬（DendrobiumSw.），多年生草本植物，附生、半自養(yǎng)半異養(yǎng)［10］。莖直立，圓柱形，不分枝，多節(jié)，常在中部以上互生3～5 枚葉；葉紙質(zhì)，長(zhǎng)圓狀披針形，先端鈍并且多少鉤轉(zhuǎn)，基部下延為抱莖的鞘，邊緣和中肋常帶淡紫色；葉鞘常具紫斑，老時(shí)其上緣與莖松離而張開，并且與節(jié)留下1 個(gè)環(huán)狀鐵青的間隙。總狀花序常從落了葉的老莖的上部發(fā)出，具2～3 朵花；花苞片干膜質(zhì)，淺白色；萼片和花瓣黃綠色，近相似，長(zhǎng)圓狀披針形，先端銳尖，具5 條脈；萼囊圓錐形，末端圓形；唇瓣白色，基部具1 個(gè)綠色或黃色的胼胝體，卵狀披針形，中部以下兩側(cè)具紫紅色條紋；唇盤密布細(xì)乳突狀的毛，并且在中部以上具1 個(gè)紫紅色斑塊；蕊柱黃綠色，先端兩側(cè)各具1 個(gè)紫點(diǎn)；蕊柱足黃綠色帶紫紅色條紋，疏生毛；藥帽白色，長(zhǎng)卵狀三角形?；ㄆ?～6 個(gè)月。

2 鐵皮石斛的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

目前，國(guó)內(nèi)鐵皮石斛的大規(guī)模育苗均采用組織培養(yǎng)的方法，該技術(shù)的研究已經(jīng)較為成熟，主要集中在外植體的選擇、最適培養(yǎng)基的優(yōu)化等方面。外植體主要有種子、試管苗原球莖和試管苗器官這3 種，其中種子作為外植體的萌發(fā)率最高，且隨著種子成熟度越高，萌發(fā)率也越高，利用老熟的種子，萌發(fā)率可以達(dá)到100%［11］。培養(yǎng)基為MS、B5、N6、RM 和Fonnesbech，隨著所選外植體不同，最適培養(yǎng)基也有所差異。考慮到材料來(lái)源和價(jià)格等因素，MS 培養(yǎng)基使用最為廣泛。

3 鐵皮石斛的人工培育技術(shù)

3.1 組織培養(yǎng)技術(shù)

目前，鐵皮石斛組織培養(yǎng)的外植體材料為種子和器官兩大類［12］，鐵皮石斛種子作為組織培養(yǎng)的外植體很容易誘導(dǎo)分化，但是由于種子培養(yǎng)易發(fā)生性狀分離，很難保持優(yōu)良性狀，因此，種子不是組培材料的最優(yōu)選擇。陳碧華等［13］利用鐵皮石斛無(wú)菌瓶苗莖段上2∕3 部分莖芽，湯久楊等［14］利用中科雙春1號(hào)鐵皮石斛生長(zhǎng)健壯的莖段上部帶節(jié)莖段，通過(guò)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)，均可獲得性狀優(yōu)良的組培苗，但是考慮到組培難易程度以及生產(chǎn)成本等因素，種子作為外植體依然是最普遍的培養(yǎng)方式。

3.2 消毒處理技術(shù)

根據(jù)不同的外植體，適用的消毒方式不同。湯久楊等［14］通過(guò)比較試驗(yàn)，75%C2H5OH振蕩消毒30 s+0.1%HgCl2振蕩消毒8 min+無(wú)菌水清洗5 次，污染率最低，外植體的發(fā)芽率最高，為最適的莖段消毒方式。用種子作為外植體的消毒方式相對(duì)簡(jiǎn)單且污染率較低，趙安然［15］選擇鐵皮石斛蒴果，割去頂部，置于無(wú)菌瓶中用乙醇消毒后用無(wú)菌水漂洗3～5 次。鄭慧俊等［16］研究表明，氯化汞處理14 min 種莢內(nèi)種子，無(wú)污染且成活率最高，達(dá)到100%，是較為合理的氯化汞處理時(shí)間。

3.3 培養(yǎng)基的配制

李志賢等［17］所用培養(yǎng)基搭配為誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0.3 g∕L 干酪素+30.0 g∕L 白糖+6.8 g∕L 卡拉膠，增殖 培養(yǎng)基為MS+1.0 mL∕L 6-BA+0.1 mg∕L NAA+0.5 mg∕L IAA+50.0 g∕L 椰子 汁+30.0 g∕L 白糖+6.8 g∕L 卡拉膠，生根培養(yǎng)基為1∕2 MS+0.1 mg∕L 6-BA+0.2 mg∕L NAA+1.0 mg∕L IBA+50.0 g∕L 椰子 汁+30.0 g∕L 白糖+6.8 g∕L 卡拉膠。湯久楊等［14］所用培養(yǎng)基最優(yōu)組合為 誘 導(dǎo) 培 養(yǎng) 基MS+2.0 mg∕L 6-BA+1.0 mg∕L NAA，增 殖 培 養(yǎng) 基 為Hyponex2+1.5 mg∕L 6-BA+0.5 mg∕L NAA+20% 香 蕉 泥，生 根 培 養(yǎng) 基 為MS+1.0 mg∕L NAA+1.0 mg∕L IBA。袁芳等［12］通過(guò)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度，篩選優(yōu)化出最適培養(yǎng)基配方，最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg∕L 6-BA+1.0 mg∕L IBA+60.0 g∕L土豆泥+0.5 g∕L活性炭+50.0 g∕L蔗糖+6.5 g∕L瓊脂，增殖和分化培養(yǎng)基為MS+2.5 mg∕L 6-BA+1.0 mg∕L IBA，生根培養(yǎng)基為MS+0.5 mg∕L NAA。

4 鐵皮石斛的栽培技術(shù)

4.1 影響因素

1）栽培基質(zhì)及配比。鐵皮石斛的種苗移栽成活率與栽培基質(zhì)有密切聯(lián)系，一般要求基質(zhì)疏松透氣，既保水又瀝水，目前用于鐵皮石斛栽培基質(zhì)的有水苔、珍珠巖、花生殼、椰殼類、甘蔗渣、磚碎、樹皮、刨花、菌糠、木糠、木炭、泥炭等［1］。黃靖等［18］利用松樹皮、椰糠、谷殼、腐殖土4種栽培基質(zhì)進(jìn)行煉苗的比較研究。結(jié)果表明，以松樹皮為基質(zhì)，栽培苗在萌芽數(shù)、株高方面表現(xiàn)良好。祝菊紅等［19］通過(guò)改變松樹皮和磚渣基的配比，比較研究發(fā)現(xiàn)松樹皮∶磚渣=7∶3 是最優(yōu)基質(zhì)配比。陳爾等［20］對(duì)鐵皮石斛生根培養(yǎng)基進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)生根的最優(yōu)培養(yǎng)條件為MS + 2.0 mg∕L NAA+ 1.0 g∕L 活性炭+ 150.0 g∕L 香蕉汁。崔之益等［21］分析了9 種栽培基質(zhì)，綜合比較瓶苗移栽成活率、株高、莖長(zhǎng)、莖粗以及生物量等生長(zhǎng)指標(biāo)，篩選出最優(yōu)基質(zhì)為松樹皮+花生殼+馬占相思樹皮的等體積混合基質(zhì)。

2）環(huán)境條件。鐵皮石斛幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)與環(huán)境的溫度、濕度、光照度等因子有緊密聯(lián)系，石斛幼苗生長(zhǎng)的不同時(shí)期對(duì)環(huán)境條件的要求也不同［6，22-24］。蔡永萍等［25］的研究表明，鐵皮石斛全年有效積溫為2256 ℃，最適生長(zhǎng)溫度是23 ℃。張宇斌等［26］在人工培養(yǎng)箱中進(jìn)行的研究也表明了這一觀點(diǎn)，即在溫 度 為20～25 ℃、濕 度 為80% 以 上、光 照 度 為240 μmol∕（m2·s）時(shí)，鐵皮石斛具有最大凈光合速率，該條件是鐵皮石斛生長(zhǎng)的最佳條件。艾娟等［27］關(guān)于不同溫度對(duì)鐵皮石斛光合作用和多糖含量影響的研究表明，較高的溫度有利于鐵皮石斛營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，但不利于多糖的積累。鐵皮石斛生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境濕度要求也較高，空氣濕度比基質(zhì)濕度更重要，要求空氣濕度與溫度成正比，高溫要求高濕，低溫要求低濕，高溫高濕的條件下要求通風(fēng)良好，濕度在60%～90%時(shí)可保持生長(zhǎng)旺盛［23］。鐵皮石斛喜半陰半陽(yáng)的環(huán)境，忌陽(yáng)光直射，最適光照度為20000 lx 左右［28］。一般情況下，晴天的光照度為100000 lx，因此需要遮陰棚或林下種植，可進(jìn)行鐵皮石斛林下栽培的林分郁閉度為30%～70%［6，17，29］。

3）施肥。一般情況下，使用肥料可顯著改善栽培土壤或基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)成分比例關(guān)系，合理施用有機(jī)肥和化肥均能對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)起促進(jìn)作用，目前研究人員主要研究的化肥主要有奧綠肥、花多多、正光樂(lè)禾液和碘肥等，有機(jī)肥有花生麩、蝦類發(fā)酵液、竹醋液、沼液、牛糞、羊糞、藻泥、梔子渣以及山茶粕等［30-38］。錢仁卷等［34］研究比較了有機(jī)肥、水溶性肥料和緩釋肥對(duì)1～2年生盆栽鐵皮石斛生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)緩釋肥（奧綠肥）能明顯提高一年生和二年生鐵皮石斛的多糖含量、浸出物含量和氨基酸含量。王再花等［32］比較了花多多、花生麩、蝦類發(fā)酵液肥料處理出瓶苗齡6 個(gè)月的鐵皮石斛，發(fā)現(xiàn)花多多和花生麩可顯著提高鐵皮石斛的新芽增量，蝦類發(fā)酵液可以提高鐵皮石斛多糖含量。金錦游［31］通過(guò)稀釋的竹醋液和沼液處理鐵皮石斛幼苗，稀釋1000 倍和1500 倍的竹醋液均對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，多糖和生物堿含量也較對(duì)照組顯著增加；50%的沼液可促進(jìn)鐵皮石斛幼苗的生長(zhǎng)和生物堿的積累，但是高濃度的沼液會(huì)抑制鐵皮石斛幼苗的生長(zhǎng)，沼液原液處理會(huì)出現(xiàn)“燒葉”現(xiàn)象。

4）內(nèi)生真菌。鐵皮石斛主要生長(zhǎng)在巖石和古樹的樹干上，其根系經(jīng)常暴露在空氣中，生存條件無(wú)機(jī)氮含量低，因此與微生物協(xié)同共生是鐵皮石斛適應(yīng)自身與生存環(huán)境自然選擇的結(jié)果。McKendrick等［39，40］從鐵皮石斛原球莖中分離得到革菌屬Thelephora真菌，并認(rèn)為對(duì)于特定蘭科植物種子有專一的真菌可以促進(jìn)其種子萌發(fā)，并且Guo 等［41］從鐵皮石斛根中分離出石斛小菇Mycena dendrobii。米春意［42］研究發(fā)現(xiàn)，低氮脅迫的鐵皮石斛根部含有類芽孢桿菌（Paenibacillus）、克雷伯菌（Klebsiella）、菊歐文氏桿菌（Dickeya）等固氮菌，其中優(yōu)勢(shì)菌種為類芽孢桿菌，并且寡氮可以促進(jìn)鐵皮石斛多糖和類黃酮的積累。楊建文等［43］利用膠膜菌屬真菌S7（Tulasnellasp.）培養(yǎng)物在6 種培養(yǎng)基上進(jìn)行鐵皮石斛種子萌發(fā)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)S7 具有促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā)的作用。周瑩等［44］從43 個(gè)鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株中篩選出DCR2Trichoderma polysporum菌株，同時(shí)接種該菌株和白絹病致病菌的鐵皮石斛植株葉和莖的發(fā)病率明顯低于其他菌株處理且死亡率為0，這表明DCR2 菌株能有效地抑制鐵皮石斛白絹病的發(fā)生。相關(guān)學(xué)者的研究結(jié)果表明，真菌對(duì)促進(jìn)鐵皮石斛種子萌發(fā)、提高產(chǎn)量、促進(jìn)分蘗、促進(jìn)生物堿、多糖合成、抑制某些病菌的繁殖等有顯著效果［42，45-47］。有效利用內(nèi)生真菌可大大提高鐵皮石斛的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時(shí)還可以減少病蟲害的發(fā)生，因此內(nèi)生真菌對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)發(fā)育的影響是一個(gè)值得關(guān)注的研究方向。

4.2 種植模式

鐵皮石斛的栽培方式目前已有較多研究，根據(jù)種植模式的不同，大體上可分為大棚種植和林下仿野生種植，林下仿野生種植根據(jù)附著物的不同，主要可分為貼樹種植和貼石種植，其中貼石種植更貼近于鐵皮石斛生長(zhǎng)的原生態(tài)，但因其生長(zhǎng)條件要求高、產(chǎn)量有限、操作困難等原因，導(dǎo)致該方式不易規(guī)?；茝V，目前林下實(shí)踐較多的主要是貼樹種植。

大棚種植的優(yōu)勢(shì)是易于控制溫度、濕度、光照、水肥等影響因子，并能夠通過(guò)化學(xué)防治的方法減少病蟲害，相應(yīng)的大棚種植的鐵皮石斛產(chǎn)量也會(huì)更高。研究表明相比于其他種植方式，大棚仿野生栽培鐵皮石斛長(zhǎng)勢(shì)最好、莖生物總重最高［48］，羅在柒等［49］的研究同樣也指明了這一點(diǎn)，即在收獲枝條的生物量方面，4 種栽培方式表現(xiàn)為大棚＞巖石仿野生＞仿野生貼樹干＞盆栽，因此，大棚種植是提高鐵皮石斛產(chǎn)量的一個(gè)重要途徑。

林下仿野生種植是一種仿照鐵皮石斛在自然界生長(zhǎng)的人工種植模式，種植密度相對(duì)較低，鐵皮石斛的生長(zhǎng)相對(duì)較慢，且對(duì)病蟲害有一定的抵抗能力，較少需要化肥農(nóng)藥處理。另外，由于晝夜溫差大、寡氮等因素影響，仿野生種植鐵皮石斛的多糖和甘露糖等有效成分積累要優(yōu)于大棚種植［50］，因此品質(zhì)上高于大棚種植的鐵皮石斛，但是其缺點(diǎn)在于產(chǎn)量相對(duì)較低，人工管理成本高。楊貞等［51］的研究表明，同一品種鐵皮石斛仿野生栽培與大棚種植相比，莖的多糖和石斛堿含量，前者分別是后者的1.16 和1.70倍，這表明仿野生栽培更有利于有效營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，藥用價(jià)值更高；羅在柒等［49］通過(guò)對(duì)4 種不同種植方式下鐵皮石斛生物學(xué)性狀、多糖以及4 種單糖含量的分析認(rèn)為，仿野生栽培方式較傳統(tǒng)盆栽和設(shè)施大棚的品質(zhì)好，其中巖石仿野生栽培模式較好。

林下仿野生貼樹種植模式中，貼附樹的郁閉度、樹皮粗糙程度、樹皮的裂紋特征、樹皮水分等都是影響鐵皮石斛品質(zhì)的主要因素，因此，在選擇貼附樹時(shí)，應(yīng)選擇樹皮粗糙、凹凸明顯、樹冠傘形、樹葉茂密的樹種，如龍眼、荔枝、松樹、杉樹等［52］。樹種的選擇也跟地域有關(guān)，淳安縣的香樟、杉木和毛竹上栽培的鐵皮石斛，均能正常生長(zhǎng)且品質(zhì)較佳，但杉木附生鐵皮石斛的總多糖含量最高［53］；在華南地區(qū)種植鐵皮石斛，檀香或降香黃檀是較好的附生樹種［21］；峨眉地區(qū)則可采用李樹栽培鐵皮石斛的技術(shù)模式，充分利用栽培果樹李樹的林地資源的同時(shí)又栽培鐵皮石斛，生產(chǎn)成本低，是當(dāng)?shù)匕l(fā)展鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)的重要途徑［54］。另外，王金旺等［55］探索了一種將鐵皮石斛栽培在開有孔洞的新伐毛竹中的栽培方式，該方式可有效破除活樹附生的林分密度限制及作業(yè)難度和環(huán)境的障礙，同時(shí)與活樹、巖壁附生栽培產(chǎn)品相比，其多糖、粗纖維及蛋白質(zhì)含量并無(wú)差異，而且還具有材料獲取便利、能充分利用空間的優(yōu)勢(shì)，因此該方式可作為新型栽培方式推廣應(yīng)用。

5 鐵皮石斛的病蟲害防治

鐵皮石斛藥用價(jià)值日益凸顯，種植技術(shù)也逐漸成熟，其種植規(guī)模也隨之增大，這使得鐵皮石斛病蟲害的發(fā)生也呈現(xiàn)出差異大、日趨嚴(yán)重等特點(diǎn)［56］。林下仿野生種植由于通風(fēng)條件好、種植密度不大，鐵皮石斛病蟲害較少，可能輕微發(fā)生黑斑病，可采用修剪病枝等方式進(jìn)行管理，大多不需要使用藥物防治［23］。大棚、盆栽等大規(guī)模種植的病蟲害發(fā)生率相對(duì)較高，多采用防治結(jié)合的方法。預(yù)防方法結(jié)合嚴(yán)控種源、基質(zhì)滅菌、栽培管理、物理防治以及生物防控等方法，降低病蟲害的傳播［2，57］。

鐵皮石斛的常見病害有疫病、輪斑病、黑斑病、炭疽病、白絹病、根腐病、銹病、軟腐病、霜霉病等，目前病害防治的主要方法是化學(xué)藥物防治。防治炭疽病、黑斑病、疫病和軟腐病，可噴施枯草芽孢桿菌800 倍稀釋液；防治根腐病和白絹病可使用木霉菌1200 倍稀釋液進(jìn)行灌根；防治疫病可噴施1%申嗪霉素懸浮劑1000 倍稀釋液或10%多抗霉素可濕性粉劑600 倍稀釋液［57］。

危害鐵皮石斛的主要害蟲有蝸牛、蛞蝓、蚧殼蟲、紅蜘蛛、菌蠅、薊馬、蚜蟲等，防蟲方法主要是物理防治和化學(xué)農(nóng)藥相結(jié)合，首先清理田間雜草，破壞害蟲的繁殖環(huán)境，然后再針對(duì)不同的害蟲采用不同的化學(xué)藥劑。蝸牛和蛞蝓采用蝸蝓克進(jìn)行防治，該產(chǎn)品對(duì)蝸牛和蛞蝓具有毒性，而對(duì)高等動(dòng)物無(wú)明顯毒性［58］；紅蜘 蛛可采 用40% 三氯 殺螨醇800～1000 倍稀釋液間隔10 d，分2 次噴霧即可毒殺去除；蚧殼蟲采用40%樂(lè)果乳油1000 倍稀釋液或50%馬拉硫磷1000 倍稀釋液噴霧，一般連續(xù)3 次，每次間隔7～10 d 可以根治［2］；對(duì)于蚜蟲則可以采用黃板結(jié)合天然除蟲菊素進(jìn)行防治［58］。對(duì)于蟲害也可采用生物天敵的方法對(duì)其進(jìn)行綠色防控，如利用胸窗螢火蟲防治蝸牛，利用寄生蜂等防治蚜蟲，利用食蟲虻和撲食螨等防治斜紋夜蛾和紅蜘蛛等害蟲［57］。

6 小結(jié)

當(dāng)前，鐵皮石斛相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，其使用范圍從入藥治病擴(kuò)大到食用養(yǎng)生，市場(chǎng)需求逐年擴(kuò)大，大棚種植很大程度上緩解了緊張的市場(chǎng)供求關(guān)系，但是在人們?cè)絹?lái)越重視鐵皮石斛品質(zhì)的今天，市場(chǎng)上綠色無(wú)公害、有效成分含量高的產(chǎn)品更受歡迎，價(jià)格也遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)品，因此，如何提高其品質(zhì)、生產(chǎn)綠色無(wú)公害產(chǎn)品成為今后的發(fā)展趨勢(shì)。

鐵皮石斛的品質(zhì)受種質(zhì)、種植技術(shù)、種植環(huán)境、內(nèi)生真菌等因素的影響，要想提高鐵皮石斛的產(chǎn)量和品質(zhì)，仍需要在相關(guān)方面進(jìn)行探索，特別是迫切需要進(jìn)行本土化培育和栽培的優(yōu)化研究，從而更好、更快地在不同產(chǎn)區(qū)高質(zhì)量發(fā)展相關(guān)產(chǎn)業(yè)。