蘿卜硫素和萊菔素的酶法制備及影響因素研究進(jìn)展

孫協(xié)軍,曲楊,勵(lì)建榮*,李秀霞,崔方超,俞張富,沈榮虎

1(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧 錦州,121013)2(杭州蕭山農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,浙江 杭州,311200)

流行病學(xué)研究表明,西蘭花、蘿卜等十字花科蔬菜具有抗炎、抗癌、預(yù)防心血管疾病等功能作用,主要是由于這類(lèi)蔬菜富含硫代葡萄糖苷類(lèi)化合物,在蔬菜組織結(jié)構(gòu)被破壞后,釋放出硫代葡萄糖苷水解酶(黑芥子酶),酶解硫代葡萄糖苷產(chǎn)生葡萄糖、硫酸鹽和異硫氰酸酯等水解產(chǎn)物[1],其中的異硫氰酸酯具有抗氧化、抗菌、抗突變和抗癌等生物活性[2-3]。蘿卜硫素[1-異硫氰酸基-4-(甲基亞磺?；?丁烷]和萊菔素[4-異硫氰酸基-1-(甲基亞磺酰基)-1-丁烯]是蘿卜、西蘭花、花椰菜等十字花科蔬菜及種子中重要的異硫氰酸酯成分,雖然硫代葡萄糖苷可以被腸道菌群水解為蘿卜硫素等異硫氰酸酯化合物,但臨床試驗(yàn)表明其在人體內(nèi)的轉(zhuǎn)化效率很低[4],通常采用酶解法或化學(xué)合成法制備蘿卜硫素和萊菔素,但由于蘿卜硫素和萊菔素存在手性異構(gòu)現(xiàn)象,化學(xué)合成成本較高,因此,酶解法是制備蘿卜硫素和萊菔素的主要方法。

1 蘿卜等蔬菜中蘿卜硫素和萊菔素的分布及含量

蘿卜根莖主要含有蘿卜硫苷(glucoraphanin,C12H23NO10S3)和萊菔苷(glucoraphenin,C12H21NO10S3),其中,蘿卜硫苷含量達(dá)到74%,而萊菔苷的含量不到10%[5]。蘿卜硫素和萊菔素的前體物質(zhì)分別為蘿卜硫苷和萊菔苷這2種硫代葡萄糖苷類(lèi)化合物,在水溶液中,硫代葡萄糖苷水解酶分別從蘿卜硫苷和萊菔苷中分離出一個(gè)葡萄糖,生成性質(zhì)不穩(wěn)定的磺酸鹽中間產(chǎn)物,再經(jīng)過(guò)分子內(nèi)重排,形成蘿卜硫素和萊菔素(圖1)[4]。

圖1 酶解蘿卜硫苷和萊菔苷分別生成蘿卜硫素和萊菔素的途徑

蘿卜硫素和萊菔素在癌癥預(yù)防方面都有很好的效果[2-3]。萊菔素在烷基鏈上比蘿卜硫素多一個(gè)不飽和雙鍵,在體外抗誘變實(shí)驗(yàn)中,萊菔素活性是蘿卜硫素的1.3～1.5倍[6]。在我國(guó)民間的飲食習(xí)慣中,常把蘿卜或蘿卜葉等做成涼拌菜或直接食用,生蘿卜汁也用于治療包括百日咳、咳嗽、胃部不適等疾病,蘿卜籽可用來(lái)治療哮喘和其他胸部不適。PILIPCZUK等[7]通過(guò)C18固相萃取柱及HPLC-DAD-MS分析得到蘿卜中萊菔苷含量為0.204 μmol/g干重。蘿卜芽中硫代葡萄糖苷含量較高,是成熟蘿卜根的3.8倍,蘿卜芽中異硫氰酸酯含量是根的8.2倍,其含量與抗氧化活性正相關(guān),蘿卜芽中的萊菔素能誘導(dǎo)小鼠肝癌細(xì)胞醌還原酶作用,激活抗氧化反應(yīng)[4]。

在不同的蔬菜和種子中,蘿卜硫素和萊菔素的含量存在較大差異。蘿卜硫素在蘿卜根及蕓薹屬蔬菜中含量較高[8],甘藍(lán)屬蔬菜的主要異硫氰酸酯化合物為蘿卜硫素,而萊菔素則在蘿卜種子中含量較高,占其異硫氰酸鹽總量的60%以上[9],含量可達(dá)到7 mg/g[10]。泰國(guó)鼠尾蘿卜種子含有2 315.6 μg/g萊菔素和3.5 μg/g蘿卜硫素[11]。未發(fā)芽的西蘭花種子中硫代葡萄糖苷和蘿卜硫素含量最高,在種子發(fā)芽過(guò)程中這2種物質(zhì)含量逐漸降低,而硫代葡萄糖苷水解酶的活性在發(fā)芽過(guò)程中逐漸增高[12]。LIM等[13]測(cè)得Taeback和Chungwoon plus兩種蘿卜種子的萊菔素含量較高,分別為10.5和5.9 mg/g鮮重,但在種子發(fā)芽的3 d內(nèi),萊菔素含量迅速降至3.0 mg/g鮮重以下。SIVAKUMAR等[14]對(duì)幼苗萌發(fā)后第3天和第9天的18種蕓薹屬蔬菜中蘿卜硫素含量分析結(jié)果表明,3 d幼苗中蘿卜硫素含量最高,其最高的甘藍(lán)San martino幼苗蘿卜硫素含量為2.21 mg/g干重,在第9 d降為1.53 mg/g干重。新鮮西蘭花的小花、葉、莖中蘿卜硫素含量分別為585、420和229 μg/g干重,整棵新鮮西蘭花蘿卜硫素含量為280 μg/g干重,在冰箱冷藏和冷凍貯藏7 d后整棵西蘭花蘿卜硫素含量分別降低了14%和29%[5]。蘿卜硫素在體內(nèi)吸收后,與谷胱甘肽結(jié)合,通過(guò)硫醚氨酸途徑代謝,其體內(nèi)主要代謝產(chǎn)物為N-乙酰半胱氨酸和半胱氨酸復(fù)合物,蘿卜硫素、蘿卜硫素半胱氨酸、蘿卜硫素-N-乙酰半胱氨酸,這幾種成分可作為西蘭花攝入量是否適合的標(biāo)志化合物[8]。

2 蘿卜硫素和萊菔素的穩(wěn)定性及影響因素

蘿卜硫素在堿性條件下迅速降解,在低pH和低溫條件下比較穩(wěn)定。蘿卜硫素在大于60 ℃高溫條件下不穩(wěn)定,在pH 2.2、60 ℃加熱6 h后,蘿卜硫素的保留率仍可以達(dá)到95.1%,而在pH 6.0的相同溫度時(shí)間條件下,蘿卜硫素的保留率僅為32.1%[19]。西蘭花提取液中蘿卜硫素的降解速率常數(shù)低于蘿卜硫素標(biāo)準(zhǔn)溶液,說(shuō)明食品基質(zhì)對(duì)其有一定的保護(hù)作用。在50 ℃加熱9 h內(nèi),蘿卜硫素穩(wěn)定性不受影響[20],60 ℃時(shí),當(dāng)pH從2.2增至6.0,蘿卜硫素的降解速率常數(shù)k從0.01 h-1增加到0.10 h-1,在75、82、90 ℃條件下降解系數(shù)隨pH的變化也出現(xiàn)相似的趨勢(shì),相同pH條件下,當(dāng)溫度升高15 ℃時(shí),k值增加2.4～5.0倍[21]。羥丙基環(huán)糊精和大豆分離蛋白包被的萊菔素微膠囊在90 ℃處理168 h,含量比沒(méi)包被的萊菔素高20%,且其降解速率顯著降低[22]。

3 蘿卜等蔬菜中蘿卜硫素和萊菔素的酶法制備途徑

植物細(xì)胞中硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷水解酶是相互分離的,前者存在于細(xì)胞液泡中,而后者存在于特定的蛋白體中,當(dāng)蘿卜等十字花科蔬菜采摘后被切碎或粉碎時(shí),自身組織結(jié)構(gòu)被破壞,內(nèi)源硫代葡萄糖苷水解酶被釋放出來(lái),與硫苷接觸后會(huì)破壞其糖苷鍵,生成硫酸鹽、葡萄糖和各種苷元,苷元再經(jīng)過(guò)非酶的分子內(nèi)重排,生成異硫氰酸鹽、硫氰酸鹽或腈等成分,整個(gè)水解過(guò)程稱(chēng)為硫苷-黑芥子酶系統(tǒng)。

硫代葡萄糖苷水解酶(黑芥子酶)是一種糖蛋白,糖側(cè)鏈的多樣性導(dǎo)致了黑芥子酶具有多種同工酶,維生素C是黑芥子酶的輔因子,有維生素C存在條件下,黑芥子酶的活性顯著增加[23]。采用共價(jià)交聯(lián)的方式將蘿卜中提取得到的黑芥子酶固定化,酶解效率提高到2.91倍[24]。以最長(zhǎng)柔性間隔的癸二胺固定化黑芥子酶用于萊菔素的生產(chǎn),萊菔苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)到93.25%,且固定化酶在10 d后依舊保持95%的活性[25]。LX-1000EP樹(shù)脂帶有含環(huán)氧丙基官能團(tuán),能和黑芥子酶共價(jià)結(jié)合,提供酶的活性和穩(wěn)定性,在循環(huán)使用10次以后,酶活力仍可達(dá)到初始酶活力的80%以上[26]。

3.1 酶解溫度的選擇

黑芥子酶的熱穩(wěn)定性較差,在50 ℃左右性質(zhì)比較穩(wěn)定。西蘭花中的黑芥子酶最適pH為6.2,最適溫度為60 ℃左右[23],生西蘭花在組織結(jié)構(gòu)破壞后,異硫氰酸酯的產(chǎn)生量顯著增加,但1 000 W微波加熱1 min后,蘿卜硫素?fù)p失了65.9%[27]。在家用微波爐烹調(diào)1 min后,產(chǎn)生異硫氰酸酯的量下降了近40%,而外源硫代葡萄糖苷水解酶的加入使得熟西蘭花異硫氰酸酯的含量提高了38%[28],950 W微波加熱19 min可完全滅活西蘭花和紅色卷心菜中的黑芥子酶[3],但低功率短時(shí)間微波處理有助于蘿卜硫素的釋放[29-30]。在低微波功率(180 W,24 min)和中等微波功率(540 W,8 min)條件下,紅球甘藍(lán)的硫代葡萄糖苷水解酶活性損失很小,而在900 W下加熱4.8 min,紅球甘藍(lán)的硫代葡萄糖苷酶完全失活[31]。這是由于上皮硫特異蛋白(epithiospecifier protein,ESP)在60～70 ℃加熱5～10 min會(huì)變性失活,但100 ℃加熱5 min以上才能滅活黑芥子酶[32]。

西蘭花中ESP的存在會(huì)導(dǎo)致大量的硫苷轉(zhuǎn)化成有害的腈類(lèi)物質(zhì),影響蘿卜硫苷向蘿卜硫素的轉(zhuǎn)化,但是ESP較黑芥子酶的熱穩(wěn)定性差,整個(gè)酶解體系加熱到50～60 ℃會(huì)導(dǎo)致ESP變性失活,而硫代葡萄糖苷水解酶的活性得到保留[33]。在均質(zhì)前將西蘭花的小花和芽加熱到60 ℃,ESP活性顯著降低,蘿卜硫素生成量增加,而腈類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生量降低,但加熱到70 ℃后,西蘭花小花中蘿卜硫素和腈類(lèi)物質(zhì)的生成量均降低,說(shuō)明黑芥子酶活性也受到了影響。姜睿等[34]采用預(yù)加熱的方式鈍化ESP,提高了萊菔素的提取效率。低功率微波加熱能有效鈍化ESP蛋白,避免低活性腈類(lèi)物質(zhì)生成[35]。

PONGMALAI等[36]以水為提取溶劑,超聲波和微波協(xié)同提取卷心菜中芥子苷,在超聲波提取過(guò)程中,水溫從48 ℃升到61 ℃,黑芥子酶一直保持較高活性,芥子苷的提取率相對(duì)較低,在超聲波作用之后將水溫降至48 ℃開(kāi)始微波輔助提取,并在微波輔助提取4 min后,將水溫升高到96 ℃,芥子酶活性損失了86%[36]?？傮w來(lái)說(shuō),低功率短時(shí)間微波處理對(duì)黑芥子酶活性影響較小,可以促進(jìn)蘿卜硫素的形成[29-30, 35]。相比于生西蘭花和100 ℃加熱組,600 MPa高靜水壓處理顯著增加了西蘭花異硫氰酸酯的生成量,芥子苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)到70.4%,這是由于高壓對(duì)葉片的擠壓損傷激活了黑芥子酶-芥子苷-異硫氰酸酯反應(yīng)體系[37]。4 ℃貯藏4個(gè)月的2個(gè)品種蘿卜根中黑芥子酶活性分別從0.31和0.32 U/g鮮重降到了0.10和0.06 U/g鮮重,而萊菔素的提取量也分別由66.0和69.2 μg/g分別降到了12.7和41.2 μg/g,說(shuō)明低溫長(zhǎng)時(shí)間貯藏也會(huì)影響蘿卜黑芥子酶活性,從而降低萊菔素的生成量[38]。

表1為近年來(lái)從十字花科蔬菜及其種子中提取蘿卜硫素和萊菔素的酶解條件,大部分研究者采用的酶解方式為物料粉碎后,室溫條件下內(nèi)源葡萄糖苷水解酶自然水解,所需時(shí)間20 min～24 h不等,為提高酶解效率,也可將酶解溫度設(shè)定在35～55 ℃[5,39-40]。而額外添加硫代葡萄糖苷水解酶則只需酶解20 min左右即可達(dá)到最佳酶解效果[31, 41]。

表1 不同蔬菜來(lái)源蘿卜硫素和萊菔素的酶解條件

3.2 物料粒度的影響

一般通過(guò)粉碎或研磨的方式釋放黑芥子酶,種子加水高速均質(zhì)或蔬菜直接高速均質(zhì)方法也經(jīng)常被采用[39,43-44],55 MPa高壓均質(zhì)使物料細(xì)胞被破壞,原有光滑的表面變?yōu)樾∑瑺罱Y(jié)構(gòu)和碎片,傳質(zhì)效率提高,有利于硫苷和黑芥子酶接觸,小于8 000 psi的均質(zhì)壓力可取得很好的提取效果[45]。但均質(zhì)壓力、研磨頻率或時(shí)間的增加并不能持續(xù)提高蘿卜硫素得率,甚至降低了蘿卜硫素的得率,可能是由于高頻高壓導(dǎo)致物料細(xì)胞破碎并聚集,另一個(gè)可能的原因是黑芥子酶的活性受到影響[29, 45]。綜上所述,粉碎或研磨可促進(jìn)黑芥子酶的充分釋放,高壓均質(zhì)可提高酶解效率從而提高異硫氰酸酯的提取效率,但均質(zhì)或研磨的物料過(guò)細(xì)會(huì)影響提取效率。

3.3 酶解pH的影響

硫代葡萄糖苷在不同pH條件下生成的水解產(chǎn)物不同,在中性和偏酸性(pH 3～8)條件下,水解產(chǎn)物以異硫氰酸酯為主。因此,大部分異硫氰酸酯提取的前處理工藝中未調(diào)節(jié)pH[46]或加入pH 7.0的PBS[10,41],也有一些將pH調(diào)節(jié)為偏酸性,如加入pH 4.5檸檬酸緩沖液[39],但pH 3.0是已有報(bào)道中較低的水解pH條件,與自然pH水解相比,pH 3.0酸性條件下水解則能增強(qiáng)硫代葡萄糖苷酶水解能力,形成更多的異硫氰酸酯成分[47]。也有研究表明,當(dāng)水解pH為5.0左右時(shí),萊菔素得率較高,而硫代葡萄糖苷水解生成蘿卜硫素的最適pH略高,為pH 6～7[5, 48],ZHANG等[48]考察了pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)和溫度(45、55、65、75、85 ℃)對(duì)西蘭花黑芥子酶活性的影響,結(jié)果表明,在pH 4～8和30～75 ℃范圍內(nèi)黑芥子酶活性都保持的很好,在pH 4～6和溫度30～60 ℃范圍內(nèi)酶穩(wěn)定性良好,但在65 ℃加熱60 min后,西蘭花黑芥子酶已經(jīng)失活。這與LOMELINO等[49]和SANGTHONG等[50]對(duì)黑芥子酶活性適宜溫度的研究結(jié)果是一致的,酶解溫度不能超過(guò)65 ℃。另外,不同部位蔬菜的基質(zhì)不同,水解生成蘿卜硫素的最適溫度和pH條件也有所差異。樣品水解后,一般采用調(diào)節(jié)pH為1～2去除水解液中蛋白質(zhì)[10, 39, 41],酶解后降低pH來(lái)提高萊菔素等異硫氰酸酯化合物的生成量。

4 總結(jié)與展望

隨著營(yíng)養(yǎng)健康研究的深入,富含抗癌成分——蘿卜硫素和萊菔素的蘿卜屬、蕓薹屬等十字花科蔬菜越來(lái)越受到人們的關(guān)注,如何在加工過(guò)程中減少其活性成分的損失,成為眾多研究者和消費(fèi)者關(guān)注的重點(diǎn)。蘿卜硫素和萊菔素不耐熱,但60 ℃以下溫度的加熱烹調(diào)對(duì)蘿卜硫素和萊菔素穩(wěn)定性沒(méi)有顯著影響,改變蘿卜、西蘭花等富含異硫氰酸酯化合物的烹調(diào)方式,采用短時(shí)間快炒及速燙等對(duì)芥子酶活性影響較小的加工方式,以攝入更多對(duì)身體健康有益的蘿卜硫素和萊菔素等功效因子,以及開(kāi)發(fā)高催化活性的硫代葡萄糖苷水解酶(黑芥子酶)生產(chǎn)技術(shù),是有必要的。減少化學(xué)試劑的使用,建立綠色環(huán)保的蘿卜硫素和萊菔素制備方法是今后的研究方向和趨勢(shì)。