低鹽咸鴨蛋腌制過程對蛋黃中游離氨基酸和風味的影響

何春霞,王修俊*,于沛,包歡歡,許九紅,李佳敏,馮廷萃

1(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽,550025)2(貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽,550025)3(鎮(zhèn)遠縣名城食品廠,貴州 黔東南苗族侗族自治州,557700)

三穗鴨是我國有名的地方鴨品種,其鴨蛋蛋白、蛋黃重量均優(yōu)于其他鴨[1],蛋白質含量豐富而均衡,營養(yǎng)價值很高[2-3]。三穗鴨蛋制品涉及咸鴨蛋、皮蛋等各種熟知的蛋制品行業(yè)[4-5],咸鴨蛋口感松沙,風味獨特,民間稱其為“青果”[6],咸鴨蛋黃是咸鴨蛋主要食用部位,除熟制直接食用外,還被廣泛應用于粽子、月餅、酥餅等[7],因此咸鴨蛋是三穗鴨蛋重要的加工制品。經(jīng)腌制而成的咸鴨蛋,其蛋白質被分解為氨基酸,易于吸收,具有極高的營養(yǎng)價值[8],但是傳統(tǒng)工藝腌制的咸鴨蛋存在蛋清鹽含量較高、咸味過重等問題,造成咸蛋清的浪費,而且高鹽食品的食用對人體健康不利。有部分學者提出咸蛋清再利用技術[9-10],但這無法擴大到居民生活,難以實現(xiàn)咸蛋清的再回收。在此背景下,低鹽咸鴨蛋腌制技術研究成為熱點,涌現(xiàn)了如負壓快速腌制技術[11-12]、磁電輔助快速腌制技術[13-15]、超聲波輔助快速腌制技術[16-18]、低鈉脈動壓快速腌制技術[19-20]等新興技術,低鹽咸鴨蛋的成功除了可以解決咸蛋清浪費的問題,也可以為咸鴨蛋加工節(jié)約部分成本。游離氨基酸是食品中重要的風味前體物質和呈味物質,其可以通過脫氫、轉氨、還原、脫羧等反應生成醇、酯、醛(尤其是含有氮、硫)等風味物質[21],蛋黃中的含硫氨基酸如甲硫氨酸可以降解產(chǎn)生硫醇,從而合成其他風味物質[22];游離氨基酸在滋味上的作用與其構型、環(huán)境pH、氨基酸組分、溫度等都有很大關系,如D-氨基酸多呈現(xiàn)甜味,而L-氨基酸可呈現(xiàn)酸、甜、苦、鮮、咸5種味覺[21],在蛋黃中的游離氨基酸主要呈現(xiàn)鮮、甜、苦的滋味[23]。孫靜等[24]通過對呈味氨基酸的閾值進行分析,比較了水腌咸鴨蛋與泥腌咸鴨蛋在口感上的差異,還對不同清洗消毒方式對咸鴨蛋呈味氨基酸含量及種類的影響進行了研究[25],這表明咸鴨蛋中的游離氨基酸含量和種類可以用于輔助判定咸鴨蛋的品質,但其并未對咸鴨蛋中主要的呈味氨基酸方面進行研究。明確咸鴨蛋中的主要呈味氨基酸,對提高咸鴨蛋口感、改善咸鴨蛋腌制方法、比較咸鴨蛋品質有著重要作用。主成分分析(principal component analysis,PCA)是一種降維統(tǒng)計方式[26],在蓮藕[27]、羊肚菌[28]、乳餅[29]等的游離氨基酸綜合評價上廣泛應用。本試驗研究三穗特色低鹽咸鴨蛋在腌制不同階段游離氨基酸的變化,并利用PCA探究對咸鴨蛋滋味影響最大的游離氨基酸種類。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

NaCl、香辛料、白酒(食品級),市售;磺基水楊酸、HCl(分析純)、CuSO4、K2SO4、NaOH,天津市瑞金特化學品有限公司;甲基紅指示劑,天津市登科化學試劑有限公司;溴甲酚綠指示劑、亞甲基藍指示劑,天津市科密歐化學試劑有限公司;H2SO4,成都金山化學試劑有限公司;硼酸,天津市永大化學試劑有限公司;95%乙醇、無水乙醚、石油醚,天津市富宇精細化工有限公司;碘,天津永晟精細化工有限公司;KI,天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司;混合氨基酸標品,日本和光藥業(yè)株式會社。

XHF-D高速勻漿機,寧波新芝生物科技股份有限公司;SIGMA2-16K高速離心機,德國西格瑪公司;GZX-GF101-3-BS-Ⅱ電熱鼓風干燥箱,上海賀德試驗設備有限公司;L-8800氨基酸分析儀,日本日立公司;FA2002B分析天平,上海越平科學儀器有限公司;PHS-3C pH計,上海鴻蓋儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 低鹽咸鴨蛋制作工藝

三穗麻鴨蛋→洗凈晾干→質量分數(shù)25%鹽水腌制8 d→取出晾干→第二階段腌制20 d→取樣檢測

咸蛋腌制液配制[m(腌制液)∶m(三穗鮮鴨蛋)=1∶1],第一階段腌制液為質量分數(shù)25%的食鹽溶液;第二階段腌制液根據(jù)總質量的百分比計算,食鹽質量分數(shù)10%、香辛料質量分數(shù)0.6%、白酒體積分數(shù)0.7%。

1.2.2 蛋黃蛋白質含量測定

按照GB 5009.5—2016 《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法執(zhí)行。

1.2.3 蛋黃游離氨基酸測定

將腌制完成的咸蛋熟制后去除蛋殼,分離蛋白蛋黃,在濾紙上滾動蛋黃完全去除蛋清,然后粉碎蛋黃。稱取1 g左右蛋黃粉碎樣品,用50 mL 0.01 mol/L HCl溶液浸提30 min;搖勻后過濾,準確吸取濾清液2 mL于離心試管中,加入體積分數(shù)8%磺基水楊酸2 mL,混勻,靜置15 min;3 000 r/min離心20 min;取上清液,過0.45 μm膜后上機測定。每組實驗做3個平行,計算平均值和標準偏差。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

在相同條件下對每個指標的測定次數(shù)不少于3次,數(shù)據(jù)記錄方式為平均數(shù)±標準差,結果采用Excel、SPSS 25.0進行統(tǒng)計分析,Origin 2021軟件畫圖,標準差表現(xiàn)為誤差線。

2 結果與分析

2.1 腌制過程中蛋黃蛋白質相對含量變化分析

以濕基為基準檢測腌制過程中咸鴨蛋蛋黃蛋白質相對含量的變化,結果如圖1所示。腌制過程中蛋白質相對含量呈增加趨勢,這與王兆燃等[8]的研究結果相同,原因是食鹽滲入蛋黃,由于濃度梯度差異導致蛋黃水分減少[30],因此蛋白質的占比增加。未腌制的蛋黃蛋白質含量為14.8%,腌制28 d時,隨著蛋黃中NaCl滲入量的增加,蛋黃水分含量不斷降低,蛋黃蛋白質含量增加至18.2%。

2.2 蛋黃游離氨基酸含量變化分析

游離氨基酸是食品中重要的滋味物質和風味前體物質,是衡量食品風味的一個重要指標。由表1可知,在腌制的不同時間咸蛋黃中的游離氨基酸種類沒有變化,均為16種,其中包括賴氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸7種必需氨基酸。與余平蓮[31]的研究結果相比少了半胱氨酸(Cys);比孫靜等[24]的水腌組多了天冬氨酸(Asp)、甲硫氨酸(Met),可能是因為鴨蛋品種、腌制方式等的差異。

表1 咸蛋腌制過程中蛋黃游離氨基酸組成變化 單位:mg/100 g

不同腌制時間的氨基酸種類雖然相同,但是在總含量上存在顯著性差異(P<0.05)。在腌制的0～7 d游離氨基酸總含量提升了18.69 %,天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、組氨酸、賴氨酸、脯氨酸含量提升顯著(P<0.05);7～14 d總含量提升了6.68 %,蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、精氨酸含量提升顯著(P<0.05);14～21 d總含量提升了3.71 %,天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、組氨酸、賴氨酸含量提升顯著(P<0.05),甲硫氨酸與蘇氨酸含量則顯著性下降(P<0.05);21～28 d總含量提升了11.41 %,蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、脯氨酸含量提升顯著(P<0.05),其中蘇氨酸與甲硫氨酸含量再次回升,并與14 d時無顯著性差異(P>0.05)。由此可見,0～7 d是游離氨基酸產(chǎn)生的關鍵時間,含量提升最多,提升含量的氨基酸種類達9種,多于其余階段。腌制結束后,蛋黃16種游離氨基酸的總量由0 d的28.52 mg/100 g增加至28 d的41.78 mg/100 g,含量提高了46.49 %。其中7種必需氨基酸總含量由13.45 mg/100 g增加至19.09 mg/100 g,占16種游離氨基酸總量的45.69 %。谷氨酸(Glu)是含量最高的游離氨基酸,腌制結束時達5.44 mg/100 g,甘氨酸(Gly)含量最低,腌制結束時僅為0.90 mg/100 g。

咸蛋腌制過程中主要是食鹽的滲入改變了其性質,有學者表明游離氨基酸的含量變化源于食鹽對蛋白酶的抑制作用[32]。鹽對于不同酶的活性影響不同,研究表明食鹽對于超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)具有顯著影響,而對溶菌酶無太大影響[33];此外,鹽可以抑制馬鈴薯酪氨酸酶的活性,從而減緩其褐變[34];朱佳源等[35]研究發(fā)現(xiàn)適量食鹽可以提高木聚糖酶、纖維素酶的活性,淀粉酶活性隨鹽量升高而加強,但是會抑制蛋白酶活性。

2.3 蛋黃游離氨基酸與滋味關系分析

2.3.1 蛋黃呈味氨基酸變化分析

根據(jù)氨基酸的呈味特性,可將這16種氨基酸分類:天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)為鮮味氨基酸(delicate amino acid,DAA);蘇氨酸(Thr)、絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、組氨酸(His)、脯氨酸(Pro)為甜味氨基酸(sweet amino acid,SAA);纈氨酸(Val)、精氨酸(Arg)、甲硫氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)為苦味氨基酸(bitter amino acid,BAA);苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)為芳香族氨基酸(aromatic amino acid,AAA)[22]。

由圖2可知,4類呈味氨基酸在腌制過程中含量總體呈上升趨勢,芳香族氨基酸及苦味氨基酸隨腌制時間延長,含量顯著性增加;甜味氨基酸在0～14 d含量顯著性增加(P<0.05),14～21 d含量顯著性下降(P<0.05),21～28 d含量再次顯著性上升(P<0.05)并達到峰值;鮮味氨基酸含量在0～7 d顯著性上升(P<0.05),在7～14 d無顯著性變化(P>0.05),14 d后隨腌制時間延長含量顯著性增加(P<0.05)。腌制28 d結束后,鮮味氨基酸總量增加至11.73 mg/100 g,甜味氨基酸總量增加至10.17 mg/100 g,苦味氨基酸總量增加至13.85 mg/100 g,芳香族氨基酸增加至6.03 mg/100 g。0～7 d時在高濃度鹽水中腌制,鹽分主要滲透入蛋白部分,蛋黃部分鹽濃度較低,蛋白酶活性未受到抑制,游離氨基酸含量上升快;7 d后轉為較低濃度鹽水腌制,隨著蛋白中鹽分逐漸向蛋黃轉移,蛋白酶活性受到抑制[4],游離氨基酸含量受到了影響,但是游離氨基酸含量總體仍呈上升趨勢,這是由于試驗咸蛋是低鹽腌制,因此抑制作用不強。

圖2 呈味氨基酸含量變化圖

由圖3可知,鮮味、甜味、芳香族氨基酸含量均在腌制的0～7 d變化量最大,鮮味氨基酸總量增加至9.81 mg/100 g,甜味氨基酸總量增加至8.30 mg/100 g,芳香族氨基酸總量增加至4.73 mg/100 g,苦味氨基酸在21～28 d變化量最大,由11.93 mg/100 g增加至13.85 mg/100 g,其次是0～7 d,由9.62 mg/100 g增加至11.01 mg/100 g。數(shù)據(jù)表明腌制第一階段,是呈味氨基酸產(chǎn)生的關鍵階段。

圖3 腌制不同時間呈味氨基酸變化量

由圖4可知,咸鴨蛋黃在呈味特性上的規(guī)律為:苦味氨基酸>鮮味氨基酸>甜味氨基酸>芳香族氨基酸。在呈味氨基酸總量中苦味氨基酸含量占比最高,達33.15%,鮮味氨基酸含量占比28.08%,甜味氨基酸含量占比24.34%,芳香族氨基酸含量占比14.43%。

圖4 腌制期間咸蛋黃呈味特性雷達圖

2.3.2 蛋黃游離氨基酸主成分分析

將咸蛋腌制過程中檢測到的各種游離氨基酸作為自變量,對其進行主成分分析,得出主成分的相關矩陣特征值、方差貢獻率以及累計貢獻率,判斷對于咸蛋滋味有主要貢獻作用的氨基酸種類,結果如表2、圖5所示。

表2 成分特征值、方差貢獻率及累計貢獻率

圖5 主成分分析碎石圖

經(jīng)主成分分析共提取4個主成分,前2個主成分的成分特征值均大于1,且累積貢獻率高達97.188%,其中主成分1貢獻率最大為61.016%,表明主成分1對咸蛋黃影響程度最大,故選取前2個主成分作為有效成分。主成分特征向量與載荷值矩陣如表3所示,載荷數(shù)值表示影響程度,正負表示方向。

表3 主成分特征向量與載荷矩陣

各成分的載荷系數(shù)決定著咸蛋黃中各游離氨基酸對主成分影響程度大小,載荷系數(shù)越大,則該物質對主成分的貢獻越大。由表3可知,第1主成分中除甲硫氨酸(Met)外,其余15種可檢出游離氨基酸均有較高相關性(均大于0.8),其中相關性較為突出的是脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)、異亮氨酸(Ile)(均大于0.98),為咸蛋的滋味提供了重要作用;對第2主成分貢獻較大的物質是甲硫氨酸(Met)。因此,可認為檢出的16種游離氨基酸均對咸鴨蛋蛋黃腌制過程中的滋味有貢獻作用,但是脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)、異亮氨酸(Ile)8種呈味氨基酸對咸鴨蛋黃的滋味影響最大。8種氨基酸中4種呈味氨基酸各占2種,鮮味氨基酸含量為7.62 mg/100 g,甜味氨基酸含量為3.9 mg/100 g,苦味氨基酸含量為5.54 mg/100 g,芳香族氨基酸含量為6.03 mg/100 g,鮮味氨基酸含量最高。分析結果表明,雖然苦味氨基酸在含量上高于鮮味、甜味、芳香族氨基酸(圖2～圖4),但咸鴨蛋黃中氨基酸的呈味是以鮮味為主,芳香族、苦味、甜味氨基酸為輔的共同作用。

2.3.3 不同腌制時間咸鴨蛋黃的綜合評價

由于主成分分析中前2個指標反映了咸鴨蛋黃腌制過程中16種游離氨基酸信息的97.188%,因此利用主成分分析對不同腌制時間的咸蛋黃游離氨基酸進行綜合評價可行。采用PCA法得到2個新綜合指標Y1、Y2,得到其線性關系為:

Y1=0.26ωAsp+0.23ωThr+0.26ωSer+0.26ωGlu+0.24ωGly+0.26ωAla+0.25ωVal+0.19ωMet+0.26ωIle+0.25ωLeu+0.26ωTyr+0.26ωPhe+0.25ωHis+0.24ωLys+0.26ωArg+0.26ωPro

Y2=-0.07ωAsp+0.43ωThr+0.14ωSer-0.06ωGlu+ 0.30ωGly-0.07ωAla +0.08ωVal+0.61ωMet-0.11ωIleH-0.15ωLeu-0.04ωTyr-0.08ωPhe-0.27ωHis-0.43ωLys-0.08ωArg-0.02ωPro

式中,數(shù)字部分是特征向量值,ω+氨基酸名稱縮寫代表不同腌制時間各氨基酸的含量。

以2個主成分所對應的特征值占所提取主成分總的特征值之和的比例作為權重,構建主成分綜合模型:Y=0.933Y1+0.067Y2,算出綜合主成分值,即綜合評分。由表4可知,隨著腌制時間的延長,綜合評分逐漸升高,評分最高的是腌制28 d的咸鴨蛋。

表4 不同腌制時間咸鴨蛋黃的成分得分和綜合評價

3 結論

在腌制過程中,咸鴨蛋黃所含的蛋白質相對含量顯著升高,提高了1.23倍;在不同腌制時間咸鴨蛋黃中檢測出的游離氨基酸種類相同,含有包括7種必需氨基酸在內的16種游離氨基酸,但是游離氨基酸總含量在不同腌制時間有顯著性差異(P<0.05),28 d腌制結束的咸蛋黃總游離氨基酸含量相比于0 d提高了46.49%。0～7 d是呈味氨基酸上升最快的階段,苦味氨基酸總含量最高,占總游離氨基酸含量的33.15%,鮮味氨基酸含量占比28.08%,甜味氨基酸含量占比24.34%,芳香族氨基酸含量占比14.43%。

對咸鴨蛋黃游離氨基酸進行主成分分析得出16種游離氨基酸對咸鴨蛋黃的滋味均有貢獻作用,而脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)、丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、精氨酸(Arg)、異亮氨酸(Ile)8種氨基酸對咸蛋黃滋味影響最大,其中鮮味氨基酸含量高于其余3種,咸鴨蛋黃中氨基酸呈味是以鮮味為主,甜味、芳香族、苦味氨基酸相輔的共同作用。