臭氧處理對(duì)洞庭青鯽魚(yú)肉揮發(fā)性成分的影響

王伯華,王美焱,王晨曦,雷頌*

1(湖南文理學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,湖南 常德,415000)2(省部共建淡水魚(yú)類發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室魚(yú)類健康養(yǎng)殖分中心,湖南 常德,415000)(環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 常德,415000)

洞庭青鯽(Carassiusauratusvar.Dongting)是近年來(lái)在洞庭湖區(qū)澧水北民湖水域發(fā)現(xiàn)的天然二倍體鯽新品系[1],屬鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprininae)鯽屬(Carassius),在我國(guó)洞庭湖區(qū)廣泛分布,是湖南水域特有的魚(yú)類資源。洞庭青鯽與其他種鯽魚(yú)及同水域的彭澤鯽相比,具有生長(zhǎng)速度快,肌肉含量高,蛋白質(zhì)含量高,氨基酸種類齊全,味道鮮美等優(yōu)勢(shì),經(jīng)濟(jì)效益顯著[2-3]。

水產(chǎn)品的腥味一直是影響其品質(zhì)和消費(fèi)的關(guān)鍵因素。其腥味物質(zhì)并不是單一物質(zhì),是由多種揮發(fā)性物質(zhì)共同作用而成,主要有醛類、醇類、烴類、酮類、萜烯衍生物以及少量的硫醚、呋喃、萘類等[4]。隨著消費(fèi)水平的提高,人們對(duì)食品風(fēng)味的要求也不斷提高,而腥味嚴(yán)重限制了水產(chǎn)品的加工應(yīng)用。目前,水產(chǎn)品的脫腥方法[5-6]主要包括物理脫腥法、化學(xué)脫腥法、生物脫腥法和感官掩蔽脫腥法等[7]?；瘜W(xué)法中的臭氧脫腥法在水產(chǎn)品中的研究與應(yīng)用越來(lái)越廣泛,臭氧具有強(qiáng)氧化性,能夠在水中產(chǎn)生極活潑的單原子態(tài)氧和羥基自由基,可氧化水中的還原性物質(zhì),同時(shí)與一些有機(jī)物發(fā)生反應(yīng),改變腥味物質(zhì)的結(jié)構(gòu),生成腥味閾值更大或無(wú)腥味的物質(zhì),從而實(shí)現(xiàn)脫腥[4,8]。臭氧還具有殺菌和脫色作用,降低腥味的同時(shí)能提高魚(yú)肉白度,改善魚(yú)肉的質(zhì)構(gòu)特性和持水能力等特點(diǎn)[8-9],此外,臭氧作用后可分解成氧氣,應(yīng)用于食品中較為安全和高效。周鴻宇等[10]發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)漂洗相比,使用臭氧氣浮漂洗鰱魚(yú)糜可有效減輕魚(yú)糜腥味。杜國(guó)偉[11]發(fā)現(xiàn)臭氧處理可有效減輕或脫除35種以上鰱魚(yú)魚(yú)糜中的揮發(fā)性成分,提高鰱魚(yú)魚(yú)糜品質(zhì)。

目前,關(guān)于洞庭青鯽在腥味物質(zhì)分析及脫腥方面的研究較少。因此,本試驗(yàn)以洞庭青鯽為研究對(duì)象,采用頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法(headspace solid-phase microextraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)結(jié)合氣味活度值(odor activity value,OAV),通過(guò)偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)系統(tǒng)研究臭氧處理的脫腥效果,為提高洞庭青鯽的食用品質(zhì)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活洞庭青鯽,體重0.5～1.0 kg左右,由本實(shí)驗(yàn)室提供;NaCl、無(wú)水乙醇,均為分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;2,4,6-三甲基吡啶標(biāo)準(zhǔn)溶液,Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

OGP-YDZ10G型臭氧發(fā)生器,廣州奧普發(fā)環(huán)?？萍加邢薰?XH-C型旋渦混合器,常州越新儀器制造有限公司;PL203型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;7890B-5977型氣相色譜質(zhì)譜儀,安捷倫科技有限公司;50/30 μm CAR/PDMS/DVB固相微萃取頭,美國(guó)Supelco公司;Multifuge X1R型高速冷凍離心機(jī),賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品制備

鮮活洞庭青鯽去內(nèi)臟、去鱗、去頭、去尾,清洗干凈后去皮剔骨采肉,按料液比1∶5(g∶mL)加蒸餾水漂洗3次,4 ℃、5 000 r/min離心10 min后去上清液,即得試驗(yàn)樣品。

1.3.2 臭氧脫腥處理

向0～4 ℃蒸餾水(pH自然,約為7)中通入臭氧20 min,制得質(zhì)量濃度約為2.5 mg/L的臭氧水。取一定質(zhì)量的洞庭青鯽魚(yú)肉樣品,按料液比1∶3(g∶mL)加入上述臭氧水,分別浸泡5、10、15、20 min,浸泡處理的同時(shí)持續(xù)通入臭氧,以維持臭氧濃度。未經(jīng)臭氧處理的樣品記為浸泡0 min。處理后各樣品于4 ℃、5 000 r/min離心10 min后去上清液備用。

1.3.3 感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

參照杜國(guó)偉[11]的綜合評(píng)分法進(jìn)行改良,將脫腥前后的樣品由10名(5男5女)經(jīng)培訓(xùn)的食品專業(yè)學(xué)生根據(jù)感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行感官評(píng)分,腥味評(píng)分為0～5分,無(wú)腥味記5分,腥味很輕記4分,腥味較輕記3分,腥味一般記2分,腥味較重記1分,腥味極重記0分。得分取平均值,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

1.3.4 揮發(fā)性成分分析方法

樣品前處理:稱取3 g洞庭青鯽魚(yú)肉,加入0.15 g NaCl并攪勻,轉(zhuǎn)至15 mL頂空瓶中,添加33 μL的內(nèi)標(biāo)物(采用乙醇稀釋的2,4,6-三甲基吡啶,91.7 μg/mL),蓋緊瓶蓋。將頂空瓶在80 ℃平衡15 min,頂空瓶中插入老化好的SPME萃取頭(250 ℃老化120 min),推出纖維頭,80 ℃吸附萃取40 min后迅速取出,將SPME纖維頭在氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)樣口高溫下吸附解析5 min后,通過(guò)GC-MS進(jìn)行分析鑒定。

氣相條件:色譜柱:Rxi-1MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)毛細(xì)管柱;升溫程序:初始溫度35 ℃保持3 min,以10 ℃/min升至200 ℃,再以20 ℃/min升至260 ℃保持8 min;進(jìn)樣口溫度250 ℃;載氣(He)流速1.5 mL/min;不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源,離子源溫度230 ℃,接口溫度280 ℃,電子能量70 eV,質(zhì)量掃描范圍30～500m/z。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

定性分析:根據(jù)GC-MS分析得到揮發(fā)性成分的總離子色譜圖,利用計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行檢索,參照NIST14.L譜庫(kù)檢索比對(duì),結(jié)合保留指數(shù)(retention index,RI)和相關(guān)文獻(xiàn)資料,進(jìn)行定性分析,并描述特征風(fēng)味。

參照劉青青等[12]的方法,以2,4,6-三甲基吡啶(內(nèi)標(biāo)),采用內(nèi)標(biāo)物定量法按公式(1)計(jì)算魚(yú)肉中各揮發(fā)性成分的含量:

(1)

式中:x待測(cè),待測(cè)組分的絕對(duì)含量,μg/g;A待測(cè),待測(cè)組分峰面積;A內(nèi)標(biāo),內(nèi)標(biāo)物峰面積;m內(nèi)標(biāo),內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量,μg;m,樣品質(zhì)量,g。

1.3.6 主體揮發(fā)性風(fēng)味成分評(píng)定方法

OAV是指各個(gè)風(fēng)味物質(zhì)的濃度與閾值之比,可評(píng)價(jià)各化合物對(duì)總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)。采用OAV法鑒別關(guān)鍵特征性風(fēng)味物,參照朱文政等[13]的方法,按公式(2)計(jì)算:

(2)

式中:w,各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的絕對(duì)含量,μg/g;T,各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)應(yīng)的閾值,μg/g。

當(dāng)OAV>1時(shí),表示該揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為關(guān)鍵化合物,對(duì)總體風(fēng)味起主要作用;當(dāng)0.1

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 24.0進(jìn)行顯著性分析,用Origin 2017和Excel 2016繪圖,用SIMCA-P 14.1軟件分析OPLS-DA結(jié)果,繪制得分圖和載荷圖,進(jìn)行變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)值分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同臭氧處理時(shí)間洞庭青鯽魚(yú)肉的腥味評(píng)定

臭氧本身具有強(qiáng)氧化作用,臭氧浸泡處理樣品后,可起到一定的脫腥作用,臭氧脫腥后的腥味評(píng)分如圖1所示。由圖1可知,經(jīng)過(guò)臭氧處理,腥味有所下降,隨著臭氧處理時(shí)間的增加,脫腥效果呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì),臭氧處理5～10 min時(shí),感官評(píng)分較高,脫腥效果較好;臭氧處理時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng),其感官評(píng)分反而有所下降,脫腥效果減弱。

圖1 不同臭氧處理時(shí)間腥味評(píng)分

2.2 脫腥前后洞庭青鯽魚(yú)肉的揮發(fā)性成分分析

對(duì)不同臭氧水浸泡時(shí)間的洞庭青鯽魚(yú)肉進(jìn)行揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè),通過(guò)HS-SPME-GC-MS技術(shù)共檢出35種成分,揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量和相對(duì)含量如圖2和圖3所示。

圖2 不同臭氧處理時(shí)間洞庭青鯽肉中的揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)量

圖3 不同臭氧處理時(shí)間洞庭青鯽肉中的揮發(fā)性物質(zhì)相對(duì)含量

檢測(cè)出的35種揮發(fā)性化合物中包含醇類物質(zhì)6種,醛類物質(zhì)13種,酮類物質(zhì)1種,烷烴類物質(zhì)7種,酯類物質(zhì)5種,其他類物質(zhì)3種。其中醇類、醛類、其他類物質(zhì)的數(shù)量隨著臭氧處理時(shí)間的增加,呈現(xiàn)先減少再增加的趨勢(shì),在處理10～15 min時(shí)這3類揮發(fā)性物質(zhì)的數(shù)量較少,三者的相對(duì)含量變化情況也與此類似。烷烴類物質(zhì)的數(shù)量沒(méi)有發(fā)生變化,但其相對(duì)含量隨時(shí)間的延長(zhǎng)先增加再減少,在10 min相對(duì)含量達(dá)到最大。檢測(cè)到的酮類和酯類物質(zhì)較少,相對(duì)含量也較低。

2.3 臭氧處理對(duì)洞庭青鯽魚(yú)肉脫腥效果的影響

2.3.1 醛類物質(zhì)

醛類化合物是水產(chǎn)品中重要的特征性風(fēng)味,其主要源于不飽和脂肪酸的氧化,低分子質(zhì)量的醛類物質(zhì)具有較低的閾值,產(chǎn)生特殊氣味。由表1可知,醛類物質(zhì)的總含量在各處理組中均為最高,臭氧處理后魚(yú)肉中醛類物質(zhì)的總含量都降低了,其中十七碳醛和典型腥味物質(zhì)(E,E)-2,4-庚二烯醛化合物被徹底脫除,對(duì)臭氧較為敏感且有腥味的正壬醛、正己醛[14]經(jīng)臭氧處理后,含量均有所降低,臭氧處理10 min時(shí),(E)-2-癸烯醛和(E)-2-壬烯醛等腥味物質(zhì)[15]被徹底脫除,具有苦杏仁味的4-乙基苯甲醛含量顯著性降低。當(dāng)臭氧處理時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí),醛類物質(zhì)含量反而有所上升,并且新增了正庚醛。正庚醛存在于多種水產(chǎn)品中,具有油脂味和腥臭味[16],產(chǎn)生的原因可能是臭氧加速了脂質(zhì)氧化,導(dǎo)致了醛類物質(zhì)含量的增加[17]。

表1 不同臭氧處理時(shí)間洞庭青鯽魚(yú)肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

2.3.2 醇類物質(zhì)

醇類物質(zhì)主要由脂肪酸氫過(guò)氧化物降解或醛酮類等羰基化合物還原產(chǎn)生[16],閾值較低,對(duì)洞庭青鯽總體風(fēng)味有一定修飾作用。經(jīng)臭氧脫腥后,醇類物質(zhì)總含量下降,2-辛炔-1-醇、1-壬醇和正己醇的含量均有所降低,臭氧處理5 min時(shí),具淡水魚(yú)腥味物質(zhì)的2-辛炔-1-醇[11]含量降至最低;臭氧處理10 min時(shí),醇類物質(zhì)總含量最低,具有青草味的正己醇、金屬味的2-乙基己醇和脂蠟味的1-壬醇被完全脫除。與醛類物質(zhì)一樣,隨著臭氧處理時(shí)間的增加,醇類物質(zhì)含量有所上升,脫腥效果降低。

2.3.3 其他揮發(fā)性物質(zhì)

洞庭青鯽魚(yú)肉中僅檢測(cè)出一種酮類物質(zhì)3-壬烯-2-酮,雖然其絕對(duì)含量較低,但有研究表明其對(duì)腥味有加強(qiáng)作用[18]。臭氧處理后,3-壬烯-2-酮顯著減少(P<0.05)。烷基自由基的脂質(zhì)自動(dòng)氧化或類胡蘿卜素分解可產(chǎn)生烷烴類物質(zhì)[19],但其閾值較大,對(duì)總體氣味貢獻(xiàn)較低。酯類物質(zhì)總含量較低,且閾值較大,對(duì)總體風(fēng)味影響不大。1,3,5-三甲苯等其他物質(zhì)含量均很低。

2.4 不同臭氧處理時(shí)間洞庭青鯽魚(yú)肉的關(guān)鍵揮發(fā)性成分分析

未經(jīng)臭氧處理的洞庭青鯽魚(yú)肉中共檢測(cè)到30種揮發(fā)性化合物,但不是每一種揮發(fā)性物質(zhì)都對(duì)整體風(fēng)味具有貢獻(xiàn),通常由揮發(fā)性物質(zhì)的種類、含量以及閾值共同決定其整體風(fēng)味,OAV可評(píng)估各組分對(duì)總體風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度,對(duì)總體風(fēng)味起主要作用的稱為關(guān)鍵化合物。已有研究表明,魚(yú)肉特征腥味物質(zhì)主要為醛類、烯醛類、含氮含硫類物質(zhì)等,包括己醛、壬醛、辛醛、庚醛、苯甲醛、二烯庚醛、二烯癸醛、土味素、三甲胺等,主要源于藻類代謝和水體環(huán)境[20-21]。

由表2可知,共有10種物質(zhì)的OAV>1,包括8種醛類物質(zhì)、2種醇類物質(zhì),其中,(E)-2-壬烯醛、正壬醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛醛等5種物質(zhì)OAV>100,為洞庭青鯽魚(yú)肉的關(guān)鍵化合物,這些醇醛類揮發(fā)性化合物共同決定了整體風(fēng)味特征?？梢?jiàn),洞庭青鯽魚(yú)肉整體風(fēng)味主要由油脂味、土腥味、青草味構(gòu)成。其次,正己醛的OAV較大,對(duì)風(fēng)味影響較大。苯甲醛和正己醇為修飾化合物(0.1

表2 臭氧處理過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的閾值及OAV

從表2看出,經(jīng)臭氧處理,構(gòu)成土腥味、油脂味、青草味主體風(fēng)味的(E)-2-壬烯醛、正壬醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛醛、正己醛等揮發(fā)性物質(zhì)均有不同程度的降低,(E,E)-2,4-庚二烯醛被脫除。由表2可知,隨著臭氧時(shí)間的增加,具有油脂味的(E,E)-2,4-癸二烯醛OAV不斷降低,處理15 min后被全部脫除。在臭氧處理過(guò)程中,具有土腥味、青草味、油脂味等不愉快氣味的(E)-2-壬烯醛、正壬醛、(E)-2-癸烯醛、1-辛醛均呈現(xiàn)出OAV先降低后增加的趨勢(shì),可能是由于臭氧促進(jìn)脂肪酸和醇類氧化,隨著處理時(shí)間延長(zhǎng),醛類物質(zhì)增加,與周鴻宇等[10]探究臭氧氣浮漂洗鰱魚(yú)糜脫腥時(shí)的研究規(guī)律類似。其中,(E)-2-癸烯醛在處理10和15 min時(shí)能完全去除,(E)-2-壬烯醛在處理10 min時(shí)被脫除,正壬醛和1-辛醛在處理5 min時(shí)OAV降至最低。此外,處理20 min時(shí)產(chǎn)生了新的異味物質(zhì)(E)-石竹烯。

2.5 基于關(guān)鍵揮發(fā)性成分的OPLS-DA

對(duì)不同臭氧處理的洞庭青鯽肉中檢測(cè)到11種關(guān)鍵揮發(fā)性化合物進(jìn)行OPLS-DA。OPLS-DA得分圖(圖4)顯示,魚(yú)肉大致聚類成未經(jīng)臭氧處理組、處理5～15 min組、處理20 min組三大類,說(shuō)明這三大類樣品的整體揮發(fā)性物質(zhì)特征發(fā)生了明顯變化。

圖4 洞庭青鯽臭氧處理過(guò)程中的OPLS-DA得分圖

其中,未經(jīng)臭氧處理組在載荷圖(圖5)上與(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-2-癸烯醛、1-辛醛等物質(zhì)相距較近,相關(guān)性較高;處理20 min組主要與正庚醛、(E)-石竹烯、1-壬醇等物質(zhì)相關(guān)性較高;而5～15 min處理組中,揮發(fā)性成分較為相近。將模型中VIP值>1的揮發(fā)性物質(zhì)篩選為特征風(fēng)味成分,共得到6種風(fēng)味特征標(biāo)志物,分別是正庚醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-石竹烯。

圖5 洞庭青鯽臭氧處理過(guò)程中的OPLS-DA載荷圖

2.6 不同臭氧處理時(shí)間洞庭青鯽特征揮發(fā)性成分聚類分析

為更直觀地區(qū)分臭氧處理過(guò)程中洞庭青鯽特征揮發(fā)性物質(zhì)的變化,根據(jù)特征揮發(fā)物質(zhì)含量繪制了聚類熱圖(圖6)。不同臭氧處理時(shí)間下,樣品中11種特征揮發(fā)性物質(zhì)存在差異。未經(jīng)臭氧處理樣品中,(E,E)-2,4-庚二烯醛、E-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-2-癸烯醛、1-辛醛等含量相對(duì)較多;5～15 min處理樣品中,各特征物質(zhì)種類和含量逐漸降低,部分物質(zhì)如正己醛、正庚醛含量略有增加;臭氧處理 20 min時(shí),(E)-石竹烯、正庚醛、1-壬醇含量相對(duì)較多。說(shuō)明臭氧與揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)生氧化作用,造成了不同處理時(shí)間各揮發(fā)性物質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)合感官評(píng)價(jià),臭氧處理5～10 min可對(duì)洞庭青鯽起到較好的脫腥效果。

圖6 臭氧處理過(guò)程中洞庭青鯽特征揮發(fā)性物質(zhì)聚類熱圖

3 結(jié)論

采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)分析了臭氧處理過(guò)程中洞庭青鯽魚(yú)肉揮發(fā)性物質(zhì)的變化。臭氧脫腥過(guò)程中,共檢測(cè)鑒定出35種揮發(fā)性物質(zhì),包括醇類6種、醛類13種、酮類1種、烷烴類7種、酯類5種和其他類3種。其中,(E)-2-壬烯醛、正壬醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、1-辛醛等5種物質(zhì)OAV>100,為關(guān)鍵風(fēng)味化合物,這些醇醛類揮發(fā)性化合物共同決定了洞庭青鯽油脂味、土腥味、青草味的整體風(fēng)味特征。

經(jīng)臭氧脫腥處理的洞庭青鯽魚(yú)肉,揮發(fā)性物質(zhì)種類及含量均有不同程度的降低。其中,典型腥味物質(zhì)(E,E)-2,4-庚二烯醛、脂蠟味的1-壬醇及氣味活性低的十七碳醛被完全脫除。醇醛類物質(zhì)總含量和OAV在臭氧處理5～15 min時(shí)降至較低,其感官評(píng)分亦較高,脫腥效果較好,隨著臭氧處理時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng),脫腥效果不再增加,并且產(chǎn)生(E)-石竹烯等新的異味物質(zhì)。腥味物質(zhì)正己醛和正壬醛,苦杏仁味的苯甲醛和4-乙基苯甲醛,青草味的1-辛醛、(2Z)-2-辛烯-1-醇和2-辛炔-1-醇不飽和醇類物質(zhì),經(jīng)臭氧處理后雖不能完全脫除,但含量下降,但繼續(xù)延長(zhǎng)臭氧處理時(shí)間,反而會(huì)促進(jìn)脂肪氧化產(chǎn)生醛類物質(zhì)。經(jīng)OPLS-DA篩選到6種風(fēng)味特征標(biāo)志物(VIP >1),分別是正庚醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-壬烯醛、(E)-石竹烯。OPLS-DA結(jié)合聚類分析表明,臭氧處理能有效減輕洞庭青鯽魚(yú)肉腥味,臭氧脫腥處理5～10 min時(shí)洞庭青鯽肉的主體風(fēng)味特征接近,且可根據(jù)特征標(biāo)志物含量對(duì)不同脫腥程度的樣品進(jìn)行有效區(qū)分。