基于GC×GC-TOF/MS初探茶、酒風(fēng)味融合

劉洋,李國輝,曹曉念,趙旭冬,敖宗華,鐘其頂,沈才洪,5

1(國家市場監(jiān)管技術(shù)創(chuàng)新中心(輕工消費(fèi)品質(zhì)質(zhì)量安全),北京,100015)2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015)3(中輕技術(shù)創(chuàng)新中心有限公司,北京,100015)4(瀘州老窖股份有限公司,四川 瀘州,646000)5(國家固態(tài)釀造工程技術(shù)研究中心,四川 瀘州,646000)

茶和酒是我國兩大傳統(tǒng)經(jīng)典飲料,其各自風(fēng)味變化精妙,茶、酒融合更是增添了茶酒風(fēng)味特色。茶的含蓄內(nèi)斂和酒的熱情奔放同時(shí)呈現(xiàn),但茶、酒風(fēng)味融合過程中度的把握必須準(zhǔn)確,方得完美協(xié)調(diào)[1]。為盡可能地反映和表征酒類的揮發(fā)性組分和整體香氣特征,研究者通常結(jié)合多種處理方法以互相補(bǔ)充完善[2]。常見的前處理方法有直接進(jìn)樣、液液萃取法(liquid-liquid extraction, LLE)、液液微萃取法、固相萃取法、固相微萃取法、頂空固相微萃取法(headspace solid-phase micro-extraction, HS-SPME)、攪拌棒吸附萃取法和超臨界流體萃取法等。其中,最為常用的是LLE和HS-SPME,前處理方法不同則鑒定出的化合物也有一定偏差,研究表明,LLE法對醇類物質(zhì)敏感,能夠較為容易地提取到酒中大部分揮發(fā)性化合物,且對目標(biāo)化合物有富集作用,HS-SPME法不需要溶劑進(jìn)行萃取,操作簡單快捷,能萃取到更加豐富的酯類和酸類物質(zhì),甚至可以檢測到高沸點(diǎn)揮發(fā)性物質(zhì),能夠最大程度保留樣品的揮發(fā)性組分,靈敏度和重現(xiàn)性較高[3-4]。對于茶酒風(fēng)味組分的測定,一般采用LLE和HS-SPME結(jié)合GC-MS進(jìn)行分析。李朝云[5]和王曉娜等[6]利用GC-MS技術(shù)檢測到茶酒主要的特征香氣物質(zhì)120余種,但傳統(tǒng)的一維色譜分離技術(shù)峰容量有限,很難滿足茶酒復(fù)雜的風(fēng)味組分分析要求。

全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry,GC×GC-TOF/MS)作為一種新興的色譜分離技術(shù),使用一個(gè)調(diào)制器將分離機(jī)理不同又相互獨(dú)立的2根不同固定相的色譜柱串聯(lián),實(shí)現(xiàn)了將不同沸點(diǎn)和不同極性組分的正交分離,增強(qiáng)了色譜系統(tǒng)分析能力,具有峰容量大、分辨率高、族分離等特點(diǎn),在復(fù)雜樣品全組分分析方面具有顯著優(yōu)勢[7]。目前,GC×GC-TOF/MS已應(yīng)用于測定醬油、食用油和醬香型、清香型及各類白酒的揮發(fā)性組分分析[8-9],但在茶酒及其香氣組分方面的GC×GC-TOF/MS研究報(bào)道較少,本研究采用LLE和HS-SPME結(jié)合GC×GC-TOF/MS技術(shù)分析茶酒及其基酒的揮發(fā)性組分,有助于明確茶酒揮發(fā)性組分體系,為茶、酒的風(fēng)味融合研究提供科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品:茶酒(酒精度40.8%)及其基酒(酒精度53%),瀘州老窖養(yǎng)生酒業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)并提供。

NaCl、二氯甲烷、Na2SO4,均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;超純水(電阻率≥18.2 MΩ·cm),美國Millipore公司Milli-Q純水儀制備;SPME Arrow系列ARR11-DVB/CWR120/20 (1.1 mm DVB/CWR/PDMS)三相箭形固相微萃取頭,廣州智達(dá)實(shí)驗(yàn)室科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC×GC-TOF/MS主要包括:Agilent 7890 GC氣相色譜儀,美國安捷倫科技有限公司;SSM 100固態(tài)調(diào)制器、EI-TOF/MS 0620電子轟擊源飛行時(shí)間質(zhì)譜儀,廣州禾信儀器股份有限公司;PAL RTC自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng),廣州智達(dá)實(shí)驗(yàn)室科技有限公司;SHB-循環(huán)式多用真空泵,鄭州長城科工貿(mào)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;氮吹儀,北京帥恩科技有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理方法

1.3.1.1 HS-SPME法

取酒樣2.0 mL置于20 mL頂空瓶,加超純水稀釋酒精度至10%(體積分?jǐn)?shù))后加入3.5 g NaCl至飽和,用PTFE/硅橡膠墊片鋁蓋密封,通過DVB/CWR/PDMS三相箭形固相微萃取頭進(jìn)行SPME萃取。樣品預(yù)孵化時(shí)間10 min,預(yù)孵化振搖速度450 r/min,預(yù)孵化加熱溫度50 ℃;萃取頭于240 ℃下老化10 min,穿過密封墊于頂空瓶上部頂空處,50 ℃下吸附萃取30 min,萃取振搖速度450 r/min;萃取結(jié)束后插入氣相進(jìn)樣口脫附180 s。

1.3.1.2 LLE法

取酒樣10.0 mL,用超純水稀釋至酒精度為10%(體積分?jǐn)?shù)),加入15 g NaCl至飽和后加入到分液漏斗,用二氯甲烷萃取(20 mL×3次),合并有機(jī)相,加適量Na2SO4除水,并于-20 ℃冰箱過夜,提取液經(jīng)旋蒸和氮吹使其濃縮至0.5 mL,經(jīng)0.22 μm孔徑濾膜過濾待測,進(jìn)樣體積為1 μL。

1.3.2 儀器分析方法

色譜條件:一維色譜柱ZB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm)和二維色譜柱DB-17HT(0.6 m×0.25 mm×0.15 μm)通過固態(tài)熱調(diào)制器串聯(lián)。升溫程序:初始溫度40 ℃,保持5 min,以3 ℃/min的速率升至250 ℃,保持5 min。調(diào)制器調(diào)制周期5 s,熱調(diào)制時(shí)間1 s,入口溫度70 ℃,冷肼溫度9 ℃,出口溫度160 ℃。以He為載氣,載氣流速1 mL/min,進(jìn)樣口溫度260 ℃,分流比20∶1,分流流量20 mL/min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊離子源電壓70 eV,離子源溫度230 ℃,接口溫度240 ℃,以101 spestra/s速率進(jìn)行采集,掃描范圍m/z35～500。

1.3.3 化合物鑒定方法

GC×GC-TOF/MS采集的數(shù)據(jù)經(jīng)過Canvas全二維色譜數(shù)據(jù)處理工作站進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,自動(dòng)識(shí)別信噪比大于50的化合物,色譜圖自動(dòng)積分解卷積和質(zhì)譜庫NIST 17比對。為保證鑒定結(jié)果可靠,篩選3個(gè)平行樣中出現(xiàn)2次的化合物,經(jīng)人工解析對比質(zhì)譜碎片,選擇匹配度最高且正反相似度均大于700的化合物作為初步鑒定結(jié)果,導(dǎo)出峰表。利用數(shù)據(jù)處理軟件,剔除柱流失以及含硅烷類物質(zhì),合并重復(fù)化合物后作為最終鑒定結(jié)果。以相對峰面積法進(jìn)行定量分析,某組分相對含量為該物質(zhì)峰面積占所有揮發(fā)性組分總峰面積的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶酒及其基酒中揮發(fā)性組分的分離特性

茶酒及其基酒的揮發(fā)性組分較為復(fù)雜,傳統(tǒng)的一維氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)難以分離痕量化合物并準(zhǔn)確鑒定該樣品的色譜峰。在二維氣相色譜中,一維長色譜柱和二維短色譜柱分別是非極性色譜柱和極性或中等極性色譜柱,能夠使化合物先按照沸點(diǎn)進(jìn)行分離,在調(diào)制器聚焦后全部進(jìn)入二維色譜柱,根據(jù)極性的不同再次分離,二維信息實(shí)現(xiàn)正交分離后進(jìn)入高分辨的質(zhì)譜進(jìn)行高通量分析,從而獲得復(fù)雜化合物組成的二維和三維圖譜。GC×GC-TOF/MS分析茶酒和基酒揮發(fā)性組分的二維和三維色譜圖如圖1所示,各揮發(fā)性組分分離度良好。

a-茶酒2D色譜圖;b-基酒2D色譜圖;c-茶酒3D色譜圖;d-基酒3D色譜圖

2.2 茶酒及其基酒中揮發(fā)性組分鑒定

基于GC×GC-TOF/MS技術(shù),采用HS-SPME法在茶酒和基酒中分別分離檢測到1 483和1 265個(gè)色譜峰,采用LLE法在茶酒和基酒分別檢出1 978和1 360個(gè)色譜峰。通過定性分析,在茶酒和基酒中鑒定出的揮發(fā)性組分統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1,組分交叉結(jié)果見圖2。

表1 茶酒及基酒中各類揮發(fā)性組分鑒定結(jié)果

圖2 LLE法和HS-SPME法提取的茶酒及基酒揮發(fā)性組分異同

通過不同前處理方法分析的茶酒和基酒揮發(fā)性組分統(tǒng)計(jì)對比可知,LLE和HS-SPME對于化合物的提取和富集能力存在明顯差異,也反映了茶酒中揮發(fā)性組分的多樣性。通過HS-SPME法和LLE法分別鑒定出茶酒中揮發(fā)性化合物212種和262種,基酒中揮發(fā)性化合物分別為165種和110種。結(jié)果表明,在茶酒中,LLE比SPME法富集到的醇類、酸類更多;相比于LLE法,HS-SPME法對酯類更敏感,在茶酒和基酒中能夠富集到的酯類化合物更加豐富。

本研究共鑒定出茶酒中揮發(fā)性組分366種,多于已報(bào)道的茶酒中揮發(fā)性組分種類[6,10],其基酒揮發(fā)性組分220種。其中,茶酒及其基酒中共同檢出的化合物有171種,表明茶酒含有基酒主要的揮發(fā)性組分特征;基酒中獨(dú)有的組分有49種,茶酒中獨(dú)有的組分有193種,充分體現(xiàn)了茶、酒的風(fēng)味特征在茶酒中的有機(jī)融合。

2.3 茶酒中各類揮發(fā)性組分分析

2.3.1 茶酒中酯類組分

2種酒樣中酯類最豐富且含量最高,茶酒中檢出酯類組分含量結(jié)果見電子增強(qiáng)出版附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033704)。茶酒和基酒共有的酯類為78種,相對含量較高的有乙酸乙酯、異丁酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、棕櫚酸乙酯。其中,茶酒中己酸乙酯和乙酸乙酯相對含量分別為14.691%(LLE)和3.008%(HS-SPME),會(huì)影響茶酒的果香及甜香[11-12];癸酸乙酯和肉豆蔻酸乙酯呈現(xiàn)苦澀味,乙酸異戊酯和辛酸異戊酯具有花果香,月桂酸乙酯具有香脂香和蜜香,棕櫚酸乙酯具有蘋果香和菠蘿香[5,13],這些酯類含量較低但其獨(dú)特的香味在茶酒風(fēng)味中發(fā)揮不可替代的作用。

茶酒中單獨(dú)檢出的酯類化合物包括丙位辛內(nèi)酯、γ-壬內(nèi)酯、γ-戊內(nèi)酯、γ-丁內(nèi)酯、δ-己醇內(nèi)酯、α-當(dāng)歸內(nèi)酯等內(nèi)酯類化合物,以及2-羥基正丁酸乙酯、2-辛烯酸乙酯、富馬酸二乙酯、(±)-α-甲氧基-苯乙酸甲酯、棕櫚酸甲酯、水楊酸甲酯等。棕櫚酸甲酯、α-當(dāng)歸內(nèi)酯和水楊酸甲酯等微量健康成分同時(shí)也是茶葉的特征揮發(fā)性組分[6,14],可使茶酒酒體滋味豐富,賦予茶酒不同于常見各類香型酒的風(fēng)味特征。

2.3.2 茶酒中醇類和酸類組分

本研究在茶酒和基酒中分別鑒定出39種和23種醇類組分,其中共有醇類14種。除乙醇外,2-丁醇、1-丙醇、正丁醇、戊醇等相對含量均在0.100%(HS-SPME,LLE)以上,是茶酒和基酒的醇類骨架成分,其中正丁醇、異丁醇和異戊醇均呈現(xiàn)一定的苦味和澀味[15]。茶酒中醇類和酸類組分分析結(jié)果見增強(qiáng)出版附表2,分析結(jié)果顯示,茶酒中含有豐富的多元醇類,如DL-2,3-丁二醇、三甘醇、四甘醇、五甘醇等,在基酒中并未檢出。酒中的多元醇類一般來源于酵母菌通過埃利希代謝途徑等微生物發(fā)酵過程,將糖和氨基酸等轉(zhuǎn)化得到。多元醇的黏稠狀態(tài)賦予了白酒酒體醇厚口味綿長的特點(diǎn),并且是白酒甜味的主要來源[16]。雷鈞等[17]通過高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)分析濃香型白酒中多元醇,結(jié)果表明濃香型白酒的窖池底部黃水、蒸餾尾水及成品酒各段過程樣均有戊五醇和己六醇的存在,證明濃香型白酒中的多元醇來自于釀酒自然發(fā)酵過程。此外,茶酒中含有6-十一醇、2-十二烷醇、3-十五烷醇等長鏈醇在基酒中也均未檢出,說明在茶酒中長鏈醇類化合物的種類和含量有所增加,可能會(huì)影響茶酒的苦澀味。

茶酒中檢出的酸類組分有30種,占所有揮發(fā)性組分的5.281%(HS-SPME),基酒中檢出酸類組分22種。2種酒樣中均有檢出的酸及酸酐類化合物共20種,含量較高的有丁酸、異戊酸、戊酸、異丁酸、棕櫚酸、己酸、庚酸、辛酸。有機(jī)酸是白酒主要的呈酸物質(zhì),適量酸類會(huì)使酒體醇厚豐滿[18]。在茶酒中,酸類含量最高的是己酸(2.333%,HS-SPME),其次是辛酸(0.773%,HS-SPME)、丁酸(0.701%,HS-SPME),符合該茶酒以濃香型白酒作為基酒的風(fēng)味特點(diǎn)[19]。

2.3.3 茶酒中醛酮類組分

本研究發(fā)現(xiàn)茶酒中含有多種醛酮類組分,見增強(qiáng)出版附表3,茶酒和基酒中共檢出的醛酮類有23種,其中在茶酒中含量較高的醛類組分有乙縮醛二乙醇(1.141%,HS-SPME)、乙醛(0.281%,HS-SPME)、異戊醛(0.134%,LLE)和乙氧基乙醛二乙縮醛(0.121%,LLE)等。含量較高的酮類組分有仲辛酮(0.071%,HS-SPME)、丙酮(2.544%,LLE)、2-戊酮(0.032%,HS-SPME)、2-壬酮(0.035%,HS-SPME)等。其中,2-戊酮和2-壬酮具有甜香和水果香,后者香氣閾值483 μg/L[20],可能是影響茶酒風(fēng)味的重要化合物之一。

縮醛類化合物是由于醇和醛在過量的情況下反應(yīng)生成,茶酒和基酒共同檢出乙縮醛二乙醇、二乙醇縮甲醛、丁醛二乙縮醛、庚醛二乙縮醛、壬醛二乙縮醛和苯甲醛二乙縮醛等;在茶酒中還檢出3-戊烯-2-酮、4-壬酮、4-十一酮、3,5,5-三甲基環(huán)己-2-烯酮等獨(dú)有的酮類組分,在茶酒研究中鮮有報(bào)道。

2.3.4 茶酒中呋喃類組分

呋喃類化合物是一類含氧五元雜環(huán)化合物,分子結(jié)構(gòu)上含有一個(gè)環(huán)二烯醚的結(jié)構(gòu),大多具有抗癌和抗氧化活性。本研究利用GC×GC-TOF/MS技術(shù)在茶酒中鑒定出16種呋喃類化合物,含量較高的有2-糠酸乙酯、糠醛、糠基乙醚、己酸糠酯等相對含量如表2所示。其中,糠醛相對含量最高(0.120%,HS-SPME),有類似苯甲醛的特殊氣味,呈現(xiàn)焦苦味;2-糠醛縮二乙醇相對含量較高(0.243%,LLE),對茶酒的酒體和風(fēng)味具有重要影響;5-甲基-2-乙?；秽?0.007%,LLE)具有甜香、堅(jiān)果、霉香和焦糖樣香氣,有干草、香豆素的香韻[21]。2-乙?；秽?0.006%,LLE)呈焦糖和甜香,在咖啡中屬于香氣骨架成分[12];5-羥甲基糠醛含量較低(0.007%,LLE),但已有研究證明其具有抑制腫瘤、改善血液流變學(xué)、降低血液膽固醇等作用[22]。

表2 基于GC×GC-TOF/MS鑒定的茶酒呋喃類組分

2.3.5 茶酒中吡嗪類組分

吡嗪又稱對二氮雜苯,是一類含2個(gè)氮原子的六元雜環(huán)化合物,由釀酒原料和大曲中的氨基酸或氨基化合物與還原糖之間發(fā)生美拉德反應(yīng)生成,茅臺(tái)、劍南春、汾酒、老白干等白酒中均有豐富的吡嗪類化合物[23]。目前白酒中已發(fā)現(xiàn)25種吡嗪類化合物[3],其中醬香型白酒中吡嗪種類最豐富且含量可達(dá)3 000～6 000 μg/L,濃香型白酒中吡嗪類化合物含量約為500～1 500 μg/L,吡嗪類化合物是白酒中關(guān)注度較高的一類健康因子,具有較強(qiáng)的抗氧化能力及抗炎作用[24]。

茶酒中檢出6種吡嗪類組分,相對含量見表3。其中,2,5-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪是濃香型白酒中常見的化合物,3,5-二乙基-2-甲基吡嗪是醬香型白酒中較為豐富的吡嗪類[3]。四甲基吡嗪又稱川芎嗪,作為酒類關(guān)注度較高的含氮類化合物,最初是在中草藥中發(fā)現(xiàn),后來研究證明也存在于白酒中[24]。四甲基吡嗪呈現(xiàn)焙烤香氣,由美拉德反應(yīng)的中間體丁二酮與蛋白質(zhì)水解的氨基酸發(fā)生縮合反應(yīng)生成,其具有一定的生物活性,如保肝、護(hù)肝、改善高血糖和抗氧化等健康作用[25]。因此,茶酒中四甲基吡嗪等吡嗪類組分的存在不僅影響著茶酒的風(fēng)味和品質(zhì),也對茶酒的健康屬性具有重要意義。

表3 基于GC×GC-TOF/MS鑒定的茶酒吡嗪類組分

2.3.6 茶酒中萜烯類組分

萜烯是一類鏈狀或環(huán)狀烯烴類的天然有機(jī)化合物,可根據(jù)異戊二烯單位的數(shù)量不同分為半萜、單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜、四萜等;而大多數(shù)萜類都是含氧衍生物,則又可以分為萜醇、萜醛、萜酮、萜酸和萜酯等[26]。萜烯類化合物主要來源于釀酒原料和微生物代謝。在白酒固態(tài)發(fā)酵過程中,一些原料和底物會(huì)在微生物的作用下產(chǎn)生碳原子遷移和骨架重排生成萜烯類化合物。

本研究在茶酒中共發(fā)現(xiàn)7種萜烯類組分(表4),包括茶葉香氣的代表成分芳樟醇和橙花醇[5],其中,芳樟醇(0.01%,LLE)含量最高,屬于非環(huán)單萜醇;橙花醇(0.001%,LLE)屬于鏈狀單萜類,具有一定的花香。α-萜品醇屬于環(huán)狀單萜類,是清香綠茶的關(guān)鍵香氣成分之一,香葉基丙酮是一種無環(huán)萜類[27];本研究還檢出了α-姜黃烯和石竹醇,其本身是茶葉的重要活性成分[28],融合到茶酒中為茶酒帶來獨(dú)特風(fēng)味和健康屬性。

表4 基于GC×GC-TOF/MS鑒定的茶酒萜烯類組分

3 結(jié)論與討論

茶與酒的風(fēng)味如何在茶、酒風(fēng)味融合產(chǎn)品的生產(chǎn)中契合是十分重要的技術(shù)難點(diǎn),精準(zhǔn)控制茶的風(fēng)味元素與酒的風(fēng)味元素對于產(chǎn)品最終風(fēng)格形態(tài)具有決定性的作用。本研究采用GC×GC-TOF/MS技術(shù)結(jié)合HS-SPME和LLE法首次全面解析了茶酒的揮發(fā)性組分,實(shí)現(xiàn)了茶酒復(fù)雜組分的高通量篩查和分析。在茶酒和基酒中分別鑒定出揮發(fā)性組分366種和220種,對比了茶酒和基酒中共同檢出的組分與茶酒中獨(dú)有的揮發(fā)性特征組分。同時(shí),在茶酒中檢出了2-糠酸乙酯、糠醇、2-糠醛縮二乙醇等呋喃類,2-乙基-5-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪等吡嗪類,以及α-姜黃烯和石竹醇等多種微量健康因子。本研究為進(jìn)一步深入探究茶、酒風(fēng)味融合以及茶酒飲用舒適性提供了分析手段與物質(zhì)基礎(chǔ)。