葡萄VvGAI1與VvJAZ9蛋白互作及低溫下的表達模式分析

劉德帥，馮美，孫雨桐，王燁，遲敬楠，姚文孔

葡萄VvGAI1與VvJAZ9蛋白互作及低溫下的表達模式分析

劉德帥，馮美，孫雨桐，王燁，遲敬楠，姚文孔

寧夏大學(xué)葡萄酒與園藝學(xué)院/寧夏現(xiàn)代設(shè)施園藝工程技術(shù)研究中心/寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室，銀川 750021

【目的】DELLA蛋白屬于植物特有的GRAS蛋白家族，是赤霉素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要調(diào)控因子，在植物生長發(fā)育和抵御逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用?？寺W洲葡萄，并對其進行亞細胞定位、蛋白互作和表達分析，為進一步研究DELLA蛋白在葡萄抗寒反應(yīng)中的調(diào)控功能奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā恳葬劸破咸哑贩N‘霞多麗’葉片為試材，采用同源克隆的方法獲得序列。利用生物信息學(xué)方法分析該基因的序列特征，使用DNAMAN及MEGA7.0對VvGAI1蛋白序列及擬南芥序列進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。通過亞細胞定位確定VvGAI1蛋白在細胞中的表達位置；利用酵母試驗驗證VvGAI1蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性；利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗驗證VvGAI1蛋白與VvJAZ9蛋白的互作關(guān)系；利用VvGAI1原核表達蛋白制備anti-VvGAI1兔源多克隆抗體；利用Western Blot技術(shù)檢測VvGAI1蛋白在低溫下的表達情況；通過相對電導(dǎo)率分析外源噴施茉莉酸和赤霉素對葡萄抗寒性的影響。【結(jié)果】從‘霞多麗’葉片中克隆得到，其ORF為1 773 bp，編碼590個氨基酸，位于第1條染色體，含有1個外顯子，無內(nèi)含子。VvGAI1蛋白相對分子質(zhì)量為64.87 kDa，理論等電點pI為5.31，屬于酸性不穩(wěn)定親水蛋白。VvGAI1具有高度保守的DELLA和GRAS結(jié)構(gòu)域，屬于植物GRAS家族的DELLA蛋白。蛋白聚類分析顯示VvGAI1與擬南芥AtGAI和煙草NtGAI1親緣關(guān)系較近。亞細胞定位與轉(zhuǎn)錄自激活結(jié)果顯示VvGAI1是一個定位于細胞核中且具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子。酵母雙雜交和雙分子熒光互補試驗也證實VvGAI1與VvJAZ9具有互作關(guān)系。將克隆至原核表達載體構(gòu)建pET28b-VvGAI1重組表達載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中經(jīng)16 ℃、1.0 mmol?L-1異丙基--d-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達獲得VvGAI1-His融合蛋白，再經(jīng)抗原免疫，血清純化后制備得到anti-VvGAI1兔源多克隆抗體。制備的anti-VvGAI1抗體可以特異性檢測‘霞多麗’葡萄中的VvGAI1蛋白。Western Blot結(jié)果表明，低溫處理下葡萄原生質(zhì)體中VvGAI1蛋白呈先上升后下降的表達趨勢，VvGAI1蛋白響應(yīng)低溫誘導(dǎo)表達。與對照相比，50 μmol·L-1茉莉酸甲酯（MeJA）處理可以提高葡萄的抗寒性，50 μmol·L-1赤霉素（GA3）處理使葡萄對寒冷變得敏感?！窘Y(jié)論】葡萄VvGAI1是一個與VvJAZ9相互作用的轉(zhuǎn)錄因子，VvGAI1對低溫脅迫有響應(yīng)，外源茉莉酸能夠正調(diào)控冷脅迫反應(yīng)，而赤霉素負調(diào)控冷脅迫反應(yīng)。

葡萄；DELLA蛋白；；蛋白互作；低溫；表達模式

0 引言

【研究意義】葡萄（spp.）為葡萄科葡萄屬多年生落葉藤本植物，是世界上廣泛栽培的經(jīng)濟果樹之一。目前，我國用于栽培生產(chǎn)的葡萄品種多數(shù)為歐亞種葡萄（L.），其具有產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)，但抗逆性差的特點。葡萄作為一種低溫敏感作物，在栽培生產(chǎn)過程中常遭受不同程度的低溫或冷凍傷害，從而限制了其在我國冷涼地區(qū)的發(fā)展，也嚴(yán)重影響了葡萄產(chǎn)量，經(jīng)濟效益和產(chǎn)業(yè)發(fā)展[1-2]。在我國北方葡萄栽培地區(qū)，由于冬季寒冷干燥、春季霜凍和倒春寒頻發(fā)，只能采用葡萄樹體埋土防寒的措施來減少寒冷或低溫對葡萄造成的傷害。埋土防寒不但增加生產(chǎn)成本，且對樹體產(chǎn)生損傷，影響產(chǎn)量，還不利于環(huán)境保護[3-4]。因此，培育能在我國北方地區(qū)免埋土栽培的抗寒新品種十分迫切，挖掘葡萄中與抗寒相關(guān)的基因并研究其功能和作用機理，對解決葡萄冷害和凍害問題有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值?！厩叭搜芯窟M展】赤霉素（gibberellins，GA）作為一種廣泛存在于植物中的內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和信號分子，在種子萌發(fā)、胚軸伸長、莖的伸長、根的生長、花芽分化以及形態(tài)建成等植物發(fā)育過程中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[5-6]。DELLA蛋白是GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的核心作用元件，參與GA信號傳導(dǎo)并發(fā)揮負調(diào)控作用，抑制植物的生長發(fā)育[7]。當(dāng)植物體內(nèi)GA含量較低時，GA不會與其可溶性受體GID1（gibberllin insensitive dwarf 1）結(jié)合，從而使具有阻遏作用的DELLA蛋白與下游靶基因結(jié)合并抑制其轉(zhuǎn)錄，進而影響植物生長[8]；當(dāng)植物體內(nèi)GA含量較高時，GA與受體GID1結(jié)合形成具有疏水性表面的二元復(fù)合體GA-GID1，再與DELLA蛋白形成三元復(fù)合體GA-GID1-DELLA，促使DELLA蛋白與SCFSLY1/GID2（Skp1-Cul1-F-boxSLY1/GID2）的結(jié)合導(dǎo)致DELLA蛋白泛素化后被26S蛋白酶降解，解除抑制并引起下游基因的響應(yīng)，從而使GA發(fā)揮正常效應(yīng)[9]。DELLA蛋白作為GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種負調(diào)節(jié)因子，主要存在于植物細胞核中，屬于植物特有的GRAS蛋白家族，由DELLA和GRAS兩個結(jié)構(gòu)域組成，也是GRAS家族中研究較為廣泛的亞族之一[10-11]。DELLA蛋白的N端含有DELLA和TVHYNP兩個高度保守的酸性結(jié)構(gòu)域，兩者共同參與DELLA蛋白與GID1受體的結(jié)合，是GA信號感知結(jié)構(gòu)域[8]；中部含有一個NLS（nuclear localization sequence）核定位信號結(jié)構(gòu)域[12]；而在C端含有GRAS家族特有的GRAS結(jié)構(gòu)域，其主要包含SAW、SH2和VHIID三個保守的阻遏結(jié)構(gòu)域，是DELLA蛋白的功能結(jié)構(gòu)域[8]。不同物種中DELLA蛋白成員數(shù)量及作用方式均有差異，模式植物擬南芥（）最早被鑒定出含有5個DELLA蛋白家族成員（GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3），其中GAI和RGA對植物莖的生長、花的發(fā)育以及葉片舒展有明顯影響；RGL1與RGL2在種子萌發(fā)和休眠過程中有調(diào)控作用；RGL3具有抑制種子萌發(fā)的作用；此外，RGA、RGL1和RGL2共同參與了花和果實的發(fā)育[13-16]。葡萄中也存在DELLA蛋白，目前鑒定出的DELLA蛋白成員有VvGAI1、VvRGA和VvSLR1[17-19]。VvGAI1對葡萄花器官的發(fā)育、節(jié)間伸長和結(jié)果量有調(diào)控作用[17-18]；VvRGA可能參與果實發(fā)育過程[18]；VvSLR1可能通過應(yīng)答GA信號調(diào)控葡萄胚乳的發(fā)育[19]。是赤霉素信號通路中的關(guān)鍵節(jié)點基因，在抑制植物生長發(fā)育的同時也可增強植物對逆境脅迫的抗性[20]。鹽脅迫處理后的突變體小麥（）通過提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性，減少丙二醛（malondialdehyde，MDA）的積累，增加內(nèi)源DELLA蛋白的含量來增強植株的耐鹽性[21]。低溫響應(yīng)基因（C-repeat binding factors）通過促進（gibberellin 2-oxidase）和的表達來降低內(nèi)源GA的含量，增強DELLA蛋白積累，從而提高植物的抗寒能力[22]。此外，DELLA蛋白缺少DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，不能與DNA直接結(jié)合，只能與不同信號途徑中的調(diào)控蛋白如PIFs（phytochrome interacting factors）、BZR1（brassinazole resistant 1）、JIN1（jasmonate insensitive 1）和JAZ（jasmonate ZIM- domain）相互作用發(fā)揮其分子功能，進而調(diào)控植物的生長發(fā)育與逆境抗性[23]?！颈狙芯壳腥朦c】筆者課題組前期在歐洲葡萄VvJAZ9互作蛋白篩選中獲得一個可能存在互作關(guān)系的DELLA蛋白GAI1，并通過實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析發(fā)現(xiàn)受低溫誘導(dǎo)表達較為明顯，且呈現(xiàn)出先上升后下降的表達趨勢，在3 h時表達量達到最高[24]。目前，在葡萄中對GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制因子DELLA蛋白研究較少，主要集中在模式植物。然而，對于歐洲葡萄中赤霉素不敏感型基因的抗逆性研究更是少之甚少。葡萄作為一種低溫敏感植物，GAI1蛋白在歐洲葡萄中的生物功能及抗寒分子機制尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用同源克隆的方法獲得，并運用生物信息學(xué)、亞細胞定位、轉(zhuǎn)錄自激活、酵母雙雜交、雙分子熒光互補（bimolecular fluorescent complimentary，BiFC）、抗體制備和蛋白印跡（Western blot）等手段分析及其蛋白特性，初步明確在葡萄抗寒過程中的生物功能。同時使用外源激素噴施葡萄幼苗并進行低溫處理，以了解外源激素對葡萄抗寒性的影響，為深入分析DELLA蛋白在葡萄抗寒反應(yīng)中的調(diào)控功能奠定理論基礎(chǔ)，也為參與葡萄抗寒調(diào)控機理的研究和抗寒葡萄品種的選育提供參考。

1 材料與方法

試驗于2021—2022年在寧夏大學(xué)葡萄酒與園藝學(xué)院寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室進行。

1.1 試驗材料

試驗材料為2年生歐洲釀酒葡萄‘霞多麗’（cv.Chardonnay）盆栽扦插苗，于植物培養(yǎng)間（25℃，16 h光照/8 h 黑暗）進行培養(yǎng)。選取生長健壯、長勢一致、無病蟲害的盆栽葡萄苗，平均分為3組，一組外源噴施50 μmol·L-1茉莉酸甲酯（methyljasmonate，MeJA）處理[25-26]。一組外源噴施50 μmol·L-1GA3處理[27]，一組外源噴施無菌水為對照（CK），處理12 h后放置于低溫培養(yǎng)箱內(nèi)（立德泰勀，上海）分別進行-3 ℃冷脅迫處理，光照條件一致，每個處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。在0、3和6 h分別采集3組供試盆栽葡萄苗葉片樣品，部分用于相對電導(dǎo)率的測定，部分用錫箔紙包好后立即放入液氮中冷凍，然后置于-80 ℃冰箱保存，用于RNA的提取。

試驗中所用的RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、大腸桿菌（）DH5和BL21（DE3）購于北京天根生化科技有限公司；無縫克隆試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真酶、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶均購于大連寶生物工程有限公司；pMD19-T載體、pBI221載體（攜帶GFP標(biāo)簽蛋白）、pET28b（攜帶His標(biāo)簽蛋白）、pGBKT7和pGADT7載體均由本實驗室原有保存；引物合成和測序均由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成；其余試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.2 基因克隆

按照植物總RNA提取試劑盒（天根生化，北京）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）的說明書進行葡萄葉片總RNA的提取以及合成第一鏈cDNA，用于基因的克隆。以NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的基因序列（GenBank No.: XM_002284612.4）為參考序列，使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計同源克隆引物（表1）。參考俞沁含等[28]的PCR反應(yīng)體系與程序進行PCR擴增獲得目的片段。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測、膠回收后連接至pMD19-T克隆載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌（）DH5感受態(tài)細胞，經(jīng)藍白斑篩選后選取陽性單克隆至北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序確認，以獲得含有目的基因的重組載體。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用NCBI在線分析工具CDD（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域；采用在線軟件ExPASy ProtParam（https://web. expasy.org/protparam/）分析VvGAI1蛋白的基本理化性質(zhì)；運用在線網(wǎng)站Grape Genome Browser（https:// www. genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）分析的染色體定位、內(nèi)含子及外顯子區(qū)域；采用DNAMAN軟件對VvGAI1蛋白序列進行多重比對；利用Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）下載DELLA（PF12041）和GRAS（PF03514）結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型文件，然后使用HMMER 3.0（http:// hmmer.org/）軟件篩選出葡萄全基因組蛋白序列中含有這兩個結(jié)構(gòu)域的DELLA蛋白，同樣按照此方法篩選出其他物種中的DELLA蛋白。使用MEGA7.0軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建蛋白系統(tǒng)進化樹（bootstrap設(shè)為1 000）。

1.4 VvGAI1亞細胞定位觀察

根據(jù)的開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列設(shè)計植物表達載體的特異性引物（表1）。以pMD19-T-VvJAZ9質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增獲得目的片段。經(jīng)無縫克隆構(gòu)建至經(jīng)I和I雙酶切的植物表達載體pBI221-GFP后，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細胞，經(jīng)菌液PCR與酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送公司測序分析，經(jīng)公司測序驗證后得到pBI221-VvGAI1- GFP融合表達載體。參考Sasamoto等[29]的方法制備擬南芥原生質(zhì)體，采用PEG（polyethylene glycol）介導(dǎo)法分別將pBI221-VvGAI1-GFP和pBI221-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至擬南芥原生質(zhì)體中，轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體在22 ℃弱光照條件下培養(yǎng)20 h，然后使用激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8 X，德國）觀察VvGAI1蛋白的亞細胞定位情況并拍照記錄。

1.5 轉(zhuǎn)錄自激活活性分析

利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計的全長特異引物以及缺失DELLA和GRAS結(jié)構(gòu)域的特異引物（表1），以歐洲葡萄‘霞多麗’葉片的cDNA為模板，按照PrimeSTAR?Max DNA Polymerase說明書（TaKaRa，大連）擴增全長及兩個關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域缺失片段，通過R Ⅰ和H Ⅰ雙酶切及同源重組反應(yīng)克隆至pGBKT7誘餌表達載體上，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細胞，經(jīng)測序確認后獲得重組載體pGBKT7-VvGAI1、pGBKT7-VvGAI1?DELLA和pGBKT7-VvGAI1?GRAS。以pGADT7-T+pGBKT7-p53質(zhì)粒為陽性對照，pGADT7-T + pGBKT7-Lam質(zhì)粒為陰性對照，pGBKT7質(zhì)粒為空載體對照，重組質(zhì)粒pGBKT7-VvGAI1、pGBKT7-VvGAI1?DELLA、pGBKT7- VvGAI1?GRAS為自激活檢測組，采用PEG/LiAc法將重組質(zhì)粒和空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入酵母Y2H Gold感受態(tài)細胞中，陰性和陽性對照共轉(zhuǎn)化至Y2H Gold感受態(tài)細胞中，然后均勻涂布于單缺培養(yǎng)基（SD/-Trp）進行培養(yǎng)。經(jīng)菌落PCR篩選陽性克隆后挑取單克隆接種至0.9% NaCl溶液中，混勻后調(diào)整菌液濃度OD600=0.3。各取1 μL點樣于SD/-Trp和SD/-Trp/AbA/X--Gal培養(yǎng)基上，30 ℃倒置培養(yǎng)3—4 d后，觀察菌落的生長和顏色變化，以確定VvGAI1蛋白是否具有轉(zhuǎn)錄自激活活性。

1.6 酵母雙雜交驗證GAI1與JAZ9蛋白互作

根據(jù)1的ORF序列設(shè)計特異性引物（表1），將其構(gòu)建至pGADT7載體上形成pGADT7-VvGAI1重組載體。然后將重組載體pGADT7-VvGAI1與筆者課題組前期構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-VvJAZ9共轉(zhuǎn)化酵母Y2H Gold感受態(tài)細胞，同時將pGBKT7-VvJAZ9+ pGADT7、pGBKT7+pGADT7-VvGAI1分別轉(zhuǎn)化至Y2H Gold感受態(tài)細胞中，點涂于SD/-Trp/AbA/ X--Gal培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3—4 d，觀察酵母菌落的生長與顏色變化情況，以確定GAI1蛋白與JAZ9蛋白是否存在相互作用。

1.7 雙分子熒光互補試驗（BiFC）驗證GAI1與JAZ9蛋白互作

利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計和的ORF中不含終止密碼子的同源重組引物（表1），通過同源重組法將和與BiFC驗證載體pB221-cEYFP（cYFP）、pB221-nEYFP（nYFP）連接，分別構(gòu)成VvJAZ9-cYFP和VvGAI1- nYFP重組載體。然后將構(gòu)建好的VvJAZ9-cYFP和VvGAI1-nYFP及對照載體分別大提質(zhì)粒，將所獲得的質(zhì)粒通過乙醇沉淀法濃縮至1 500—2 000 ng·μL-1。采用酶解法分離擬南芥葉肉組織原生質(zhì)體[29]，通過PEG介導(dǎo)法分別將質(zhì)粒兩兩組合共轉(zhuǎn)至擬南芥原生質(zhì)體中，共轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體于22 ℃弱光培養(yǎng)18 h進行瞬時表達，使用激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8 X，德國）觀察熒光并拍照記錄。

1.8 外源噴施茉莉酸甲酯（MeJA）與赤霉素（GA3）對葡萄抗寒性的影響

參考WANG等[4]的方法通過相對電導(dǎo)率（relative electrical conductivity，REC）評估植物抗寒性。按照相對電導(dǎo)率（%）=（初始電導(dǎo)率值/最終電導(dǎo)率值）×100公式計算相對電導(dǎo)率。使用Excel 2019整理試驗數(shù)據(jù)，并采用IBM SPSS 25.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用單因素ANOVA分析和Duncan’s test進行顯著性分析（＜0.05），然后使用Origin Pro 2021作圖。

1.9 重組蛋白的表達與純化

根據(jù)的ORF序列全長并使用Primer Premier軟件設(shè)計出相應(yīng)的引物（表1）。以pMD19- T-VvGAI1質(zhì)粒為模板，通過PCR擴增獲得目的片段。采用無縫克隆法將其克隆至經(jīng)I/I雙酶切原核表達載體pET28b-His上形成重組載體pET28b- VvJAZ9，轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細胞，進行菌液PCR與酶切鑒定。對鑒定正確的重組質(zhì)粒進行測序，經(jīng)測序公司測序后獲得正確重組載體pET28b-VvGAI1。將測序正確的pET28b-VvGAI重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細胞，加入1.0 mmol?L-1異丙基--d-硫代半乳糖苷（isopropyl--d-thiogalactoside，IPTG），16 ℃誘導(dǎo)表達16 h后收集200 mL菌體，經(jīng)過超聲破碎后，4 ℃、10 000×離心20 min，收集菌體蛋白的上清液與沉淀。然后通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，隨后進行考馬斯亮藍染色、脫色和拍照。參照TMNi-NTA Resin試劑盒（全式金生物，北京）說明書對獲得的重組蛋白進行純化，純化產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測純度。

表1 引物列表

下劃線部分為限制性內(nèi)切酶位點 The underlined sequences are the site of restriction endonuclease

1.10 抗體的制備與親和性檢測

參考吳楠等[30]的方法進行多克隆抗體的制備與親和性檢測。將符合免疫要求濃度的重組蛋白乳化后，按照1 mg?kg-1的劑量，對2只新西蘭大白兔進行多點皮下注射，間隔7 d 注射一次。每只兔子免疫4—5次后取少量血樣，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清抗體效價，經(jīng)檢測合格后，于第1次免疫52 d后一次性采血獲得抗血清。將誘導(dǎo)表達的蛋白進行SDS-PAGE電泳分析并凝膠濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以純化的兔血清為一抗（1﹕1 000），再以熒光標(biāo)記的山羊抗兔抗體為二抗進行Western Blot鑒定多克隆抗體的特異性。

1.11 VvGAI1蛋白在低溫條件下表達分析

為確定制備出的anti-VvGAI1抗體能否檢測到葡萄中的VvGAI1蛋白，參考BERTINI等[31]的方法制備葡萄愈傷組織原生質(zhì)體，以歐洲葡萄‘霞多麗’的愈傷組織為材料，采用2%纖維素酶（cellulase onozuka R-10）、1%離析酶（macerozyme R-10）和0.05%果膠酶（pectolyase Y-23）的酶組合，在0.5 mol·L-1甘露醇溶液中，28 ℃黑暗條件下，酶解14 h后分離葡萄愈傷組織原生質(zhì)體，經(jīng)血球計數(shù)板測定原生質(zhì)體產(chǎn)量為1.97×106個/g，經(jīng)0.5 mg·mL-1二乙酸熒光素溶液（fluorescein diacetate，F(xiàn)DA）染色并在紫外光下檢測原生質(zhì)體的活力為80%。將制備的葡萄愈傷原生質(zhì)體在細胞培養(yǎng)板上按照1 mL/組進行分組試驗，然后置于低溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行4 ℃低溫處理，分別在0、0.5、1和2 h時收集原生質(zhì)體并提取蛋白。參考YAO等[32]的方法進行Western blot分析，使用anti-VvGAI1抗體對葡萄中的VvGAI1蛋白進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 VvGAI1克隆

以提取的釀酒葡萄‘霞多麗’葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，通過同源克隆的方式從‘霞多麗’葡萄cDNA中克隆得到的ORF序列（圖1）。將目的片段擴增產(chǎn)物膠回收并與pMD19-T載體連接，挑選陽性克隆進行測序。測序結(jié)果表明的ORF 長1 773 bp，編碼590個氨基酸（圖2-A）；定位于第1條染色體，含有1個外顯子，不含內(nèi)含子；VvGAI1蛋白由590個氨基酸組成，其中亮氨酸占比最高，分子量約為64.87 kDa，等電點pI為5.31，不穩(wěn)定性指數(shù)為45.78，GRAVY（grand average of hydropathicity）值為-0.276，屬于酸性不穩(wěn)定親水蛋白。VvGAI1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白在35—102和214—574氨基酸處分別含有DELLA和GRAS兩個保守結(jié)構(gòu)域，屬于植物特有的GRAS家族的DELLA蛋白（圖2-B）。

M: DL5000 bp DNA Marker; 1: VvGAI1 gene

A：VvGAI1核苷酸及氨基酸序列；B：VvGAI1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，陰影部分的氨基酸為DELLA和GRAS兩個保守結(jié)構(gòu)域，*代表終止密碼子

2.2 VvGAI1蛋白序列比對及系統(tǒng)進化分析

利用DNAMAN將VvGAI1與擬南芥中5個DELLA蛋白（GAI、RGA、RGL1、RGL2和RGL3）的氨基酸序列進行多重比對分析，發(fā)現(xiàn)葡萄VvGAI1蛋白與擬南芥5個DELLA蛋白的氨基酸序列中都含有GRAS家族典型的DELLA和GRAS結(jié)構(gòu)域。VvGAI1與擬南芥5個DELLA蛋白氨基酸序列間的相似度達57.82%，其中與AtGAI（GenBank登錄號：NP_172945）、AtRGA（NP_178266）的相似度較高，分別為63.41%和62.46%（圖3）。

為進一步分析VvGAI1與其他物種DELLA蛋白間的系統(tǒng)進化關(guān)系，以擬南芥AtGAI蛋白的DELLA和GRAS保守結(jié)構(gòu)域為基礎(chǔ)，利用HMMER 3.0軟件分別從葡萄、蘋果、桃、梨、橙子、甜瓜、野草莓、番茄、大豆和煙草基因組中鑒定出DELLA蛋白基因家族成員，并使用MEGA 7.0軟件對鑒定出的DELLA蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。聚類結(jié)果顯示（圖4），所有48個DELLA成員根據(jù)其蛋白序列特征可劃分為5個亞族，即Group Ⅰ—Ⅴ。葡萄中的3個DELLA蛋白分布于Group Ⅰ、Group Ⅱ和Group Ⅳ，在亞組Ⅰ中的VvRGA（XP_002266267）與CsGAI（XP_ 006482132）和AtRGL3（NP_197251）親緣關(guān)系較近；在亞組Ⅱ中的VvGAI1（XP_002284648）與AtGAI和NtGAI1（XP_016441385）具有較近的親緣關(guān)系；在亞組Ⅳ中的VvSLR1（XP_002284952）與橙子CsSLR1（XP_006475770）親緣關(guān)系最近，與甜瓜CmSLR1（XP_008463334）的進化距離較近。

圖中點表示序列比對空位，藍色線區(qū)域表示DELLA保守結(jié)構(gòu)域，橙色線區(qū)域表示GRAS保守結(jié)構(gòu)域

2.3 VvGAI1亞細胞定位分析

為探究VvGAI1蛋白的亞細胞定位情況，將空載質(zhì)粒pBI221-GFP和重組質(zhì)粒pBI221- VvGAI1-GFP通過PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化至擬南芥原生質(zhì)體進行瞬時表達。22 ℃弱光培養(yǎng)20 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光分布情況。結(jié)果顯示（圖5），pBI221-GFP和pBI221-VvGAI1-GFP在原生質(zhì)體表達蛋白后均能檢測到綠色熒光，其中作為空載體對照pBI221-GFP的綠色熒光在原生質(zhì)體的細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核中均有分布；而pBI221-VvGAI1-GFP融合蛋白只在細胞核中顯示綠色熒光，說明VvGAI1在細胞核中表達并發(fā)揮功能。

圖4 葡萄DELLA蛋白系統(tǒng)進化分析

圖 5 VvGAI1亞細胞定位

2.4 外源JA與GA對葡萄抗寒性影響的分析

為進一步分析JA與GA對葡萄抗寒性影響，選取生長一致的扦插自根苗葡萄植株為試材，分別外源噴施MeJA與GA3，12 h后進行-3 ℃冷脅迫處理，結(jié)果表明（圖6），噴施MeJA的葡萄植株葉片在0 h處理的相對電導(dǎo)率稍有下降但無顯著差異，而冷脅迫處理3 h和6 h后噴施MeJA的葉片電導(dǎo)率相較于噴施無菌水（CK）顯著下降，說明外源JA可以降低葡萄葉片在冷脅迫下的相對電導(dǎo)率，能夠提高葡萄的抗寒性。噴施GA3的葡萄植株葉片在0 h冷處理的相對電導(dǎo)率較對照無顯著差異，同樣在冷脅迫處理3 h后噴施GA3的葉片電導(dǎo)率相較于對照無顯著差異，而冷脅迫處理6 h后噴施GA3的葉片電導(dǎo)率相較于對照顯著上升，說明外源GA處理增加了葡萄葉片在冷脅迫下的相對電導(dǎo)率，使葡萄對冷脅迫敏感。這些結(jié)果表明JA有利于正調(diào)控冷脅迫反應(yīng)，而GA則是負調(diào)控冷脅迫反應(yīng)。

*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）

2.5 VvGAI1蛋白的自激活分析

將構(gòu)建成功的pGBKT7-VvGAI1、pGBKT7- VvGAI1?DELLA、pGBKT7-VvGAI1?GRAS重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至酵母Y2H Gold感受態(tài)細胞中（圖7），驗證VvGAI1是否具有自激活活性。3種重組載體、陽性對照（pGADT7-T+pGBKT7-p53）、陰性對照（pGADT7-T+pGBKT7-Lam）和空載對照（pGBKT7）的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母后在SD/-Trp培養(yǎng)基上均能正常生長，但在SD/-Trp/AbA/X--Gal培養(yǎng)基上只有陰性對照和空載體對照的菌株不能正常生長，而含有pGBKT7-VvGAI1、pGBKT7-VvGAI1?DELLA、pGBKT7-VvGAI1?GRAS重組質(zhì)粒和陽性對照的酵母菌株均能正常生長且顯現(xiàn)藍色，說明3種重組質(zhì)粒均已轉(zhuǎn)入酵母細胞，VvGAI1蛋白的DELLA和GRAS結(jié)構(gòu)域在酵母中均有自激活活性，且GRAS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄激活活性弱于DELLA結(jié)構(gòu)域，VvGAI1能夠激活下游報告基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯（圖7-B）。

A：VvGAI1蛋白結(jié)構(gòu)示意圖；B：VvGAI1蛋白的轉(zhuǎn)錄激活活性驗證。BD：pGBKT7空載體作為空載對照；Po：pGADT7-T+pGBKT7-p53作為陽性對照；Ne：pGADT7-T+pGBKT7-Lam作為陰性對照

2.6 酵母雙雜交點對點驗證VvGAI1與VvJAZ9的互作關(guān)系

為進一步驗證VvGAI1與VvJAZ9互作關(guān)系，將的ORF克隆至pGADT7載體，構(gòu)建重組載體pGADT7-VvGAI1。然后將pGBKT7-VvJAZ9+pGADT7- VvGAI1，pGBKT7-VvJAZ9+pGADT7，pGBKT7+pGADT7-VvGAI1共轉(zhuǎn)化至酵母Y2H Gold感受態(tài)細胞中，點涂于SD/-Trp/AbA/X--Gal培養(yǎng)基上進行點對點驗證。在SD/-Trp/AbA/X--Gal培養(yǎng)基上只有pGBKT7- VvJAZ9+pGADT7-VvGAI1和陽性對照（pGADT7-T+ pGBKT7-p53）顯現(xiàn)藍色酵母菌落，而pGBKT7- VvJAZ9+pGADT7，pGBKT7+pGADT7-VvGAI1和陰性對照（pGADT7-T+pGBKT7-Lam）的菌株均不能正常生長，說明VvGAI1與VvJAZ9存在相互作用（圖8）。

Po：pGADT7-T+pGBKT7-p53作為陽性對照；Ne：pGADT7-T+pGBKT7-Lam作為陰性對照

2.7 BiFC證明VvGAI1與VvJAZ9蛋白互作

利用BiFC試驗進一步驗證VvGAI1與VvJAZ9在植物體內(nèi)的互作關(guān)系，分別將和中不含終止密碼子的ORF序列通過同源重組法連接至pB221-cYFP、pB221-nYFP載體中，構(gòu)成VvJAZ9-cYFP和VvGAI1-nYFP重組載體。然后將cYFPJAZ9+nYFPGAI1、cYFPJAZ9+nYFP和cYFP+nYFPGAI1共轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)化的cYFPJAZ9+nYFPGAI1在擬南芥原生質(zhì)體中可以觀察到黃色熒光信號，而cYFPJAZ9+ nYFP和cYFP+nYFPGAI1均未觀察到黃色熒光信號，表明VvGAI1和VvJAZ9蛋白在植物體內(nèi)存在互作關(guān)系（圖9）。

2.8 anti-VvGAI1抗體制備

以獲得的片段為模板，通過同源重組的方法將的ORF連接至帶有His標(biāo)簽蛋白的原核表達載體pET28b上，形成融合表達載體pET28b-VvGAI1-His（圖10）。

將構(gòu)建成功的pET28b-VvGAI1-His重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核蛋白表達菌株BL21后，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)以獲得最佳表達條件。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株在16 ℃下經(jīng)1.0 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)16 h后，能夠達到純化目的蛋白的需求（圖11-A）。然后經(jīng)Ni-NTA親和層析獲得純化的VvGAI1-His融合蛋白，再經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，通過考馬斯亮藍染色鑒定出提取的蛋白大小為67.06 kDa（圖11-B），確定無誤后經(jīng)免疫挑選健康的6周大小的新西蘭大白兔兩只（約2 kg），制備多克隆抗體。結(jié)果顯示anti-VvGAI1多克隆抗體制備良好可用于后續(xù)試驗（圖 11-C）。

圖9 BiFC驗證VvGAI1 與VvJAZ9蛋白互作

M：DL 5000 bp DNA Marker；泳道1—3：pET28b-VvGAI1-His菌液PCR檢測

2.9 VvGAI1蛋白在低溫條件下表達分析

為了解葡萄中VvGAI1蛋白在低溫條件下表達情況，也為確定所制備的anti-VvGAI1抗體能否檢測到葡萄中的VvGAI1蛋白，采用酶解法制備出葡萄愈傷組織原生質(zhì)體，并進行4 ℃低溫處理，在0、0.5、1和2 h時收集原生質(zhì)體，提取蛋白后，分別用anti-VvGAI1抗體檢測葡萄原生質(zhì)體在4 ℃處理后VvGAI1蛋白的表達情況。結(jié)果顯示，制備的anti-VvGAI1抗體可用于檢測葡萄內(nèi)源VvGAI1蛋白的表達情況，4 ℃低溫處理后的原生質(zhì)體中VvGAI1蛋白呈現(xiàn)先上升后下降的表達趨勢，說明VvGAI1蛋白受低溫誘導(dǎo)表達，且與受低溫誘導(dǎo)表達趨勢相似（圖12）。

A：VvGAI1原核誘導(dǎo)表達；B：VvGAI1蛋白純化；C：anti-VvGAI1制備后的檢測。圖中CK表示非誘導(dǎo)細菌培養(yǎng)（陰性對照），M表示蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1—4分別表示E. coli BL21菌株在16 ℃條件下IPTG誘制獲得的天然蛋白提取物，37 ℃條件下IPTG誘導(dǎo)獲得的天然蛋白提取物，16 ℃條件下IPTG誘導(dǎo)獲得的變性蛋白提取物，37 ℃條件下IPTG誘導(dǎo)獲得的變性蛋白提取物

圖12 VvGAI1蛋白在低溫條件下的表達分析

3 討論

3.1 外源植物激素JA與GA影響葡萄抗寒性

GA和JA是廣泛存在于植物中的內(nèi)源生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和信號分子，在植物生長發(fā)育、次生代謝以及非生物和生物脅迫的防御反應(yīng)中均發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[33-34]。已有研究表明，冷脅迫會使植物體內(nèi)的茉莉酸類物質(zhì)含量增加，而外源施用JA可以增強抗氧化酶活性，增加抗氧化劑、防御化合物的合成，減少活性氧和丙二醛的積累，降低細胞膜的通透性以及誘導(dǎo)冷響應(yīng)基因的表達來提高番茄（）[35]、香蕉（）[36]、枇杷（）[37]、葡萄[38]等植物的抗寒性。本研究發(fā)現(xiàn)外源噴施JA后再經(jīng)冷脅迫處理3 h和6 h的葡萄植株葉片的相對電導(dǎo)率相較于噴施無菌水處理（對照）顯著下降，這與前人在葡萄上的研究結(jié)果一致[38]，表明外源JA處理可有效降低葡萄葉片在冷脅迫下的相對電導(dǎo)率，保持細胞膜的完整性，增強抗寒能力；同時也說明JA在誘導(dǎo)植物對冷脅迫的適應(yīng)過程中起著正調(diào)控作用。

GA也參與植物對低溫脅迫的反應(yīng)，GA3顯著促進4 ℃低溫處理后花生種子萌發(fā)和種子活力，抑制花生幼苗在低溫處理后相對膜透性和丙二醛的上升，提高可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸含量，增強花生幼苗的抗寒能力[39]。外源噴施100 mg·L-1GA3處理通過提高可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和游離脯氨酸的含量，延緩電解質(zhì)滲出率，抑制丙二醛上升，來提高‘庫爾勒香梨’樹（Yu）的抗寒性[40]。本研究發(fā)現(xiàn)外源噴施GA3的葡萄植株在冷脅迫處理3 h后的葉片電導(dǎo)率與對照無差異，而冷脅迫處理6 h后的葉片電導(dǎo)率顯著高于對照；GA3處理增加了冷脅迫下的葉片相對電導(dǎo)率，使葡萄對冷脅迫敏感，說明GA在誘導(dǎo)植物對冷脅迫的適應(yīng)過程中起著負調(diào)控作用。JAZ蛋白與DELLA蛋白分別是JA和GA信號途徑中的重要調(diào)控因子[20,33]，且分別受植物體內(nèi)JA和GA水平的影響。因此，研究冷脅迫下，JA和GA信號通路之間的相互調(diào)節(jié)，對植物的抗寒性機理研究具有很好的理論價值。

3.2 VvGAI1及其蛋白的特征

SCFSLY1/GID2泛素蛋白復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄抑制因子DELLA蛋白和赤霉素受體GID1是GA信號通路的3個核心組件，其中DELLA蛋白作為E3泛素連接SCFSLY1/GID2的靶蛋白是GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組分[12]。近年來，隨著DELLA蛋白在GA信號途徑中的研究不斷深入，許多植物中DELLA蛋白基因被成功克隆，且DELLA蛋白在植物種子萌發(fā)、花器官形成、幼苗生長、果實發(fā)育、植株衰老和逆境抗性等方面均有影響[8]。本研究采用同源克隆的方法從歐洲葡萄中成功克隆出，隸屬植物特有的GRAS家族DELLA蛋白成員。該基因位于第1條染色體，有1個外顯子，無內(nèi)含子，這與Acheampong等[18]從‘湯普森’無核葡萄中克隆的（）結(jié)果一致。的ORF序列長1 773 bp，編碼590個氨基酸，分子量約64.87 kDa，pI為5.31，是核定位蛋白，也具有DELLA和GRAS結(jié)構(gòu)域；與張文穎等[19]在‘白羅莎里奧’葡萄中得到的VvGAI1蛋白性質(zhì)一致；且與楊光等[41]報道的屬于不同葡萄品種中的同源序列。通過與擬南芥5個DELLA蛋白序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，葡萄VvGAI1蛋白和擬南芥的DELLA蛋白中都具有GRAS家族的典型結(jié)構(gòu)域和保守區(qū)，且與AtGAI和AtRGA的序列一致性較高，與釀酒葡萄‘莫尼耶皮諾’中VvGAI1（VvL1）蛋白結(jié)構(gòu)研究一致[17]。本研究利用HMMER軟件從葡萄基因組中鑒定出3個DELLA蛋白基因家族成員，與前人研究結(jié)果一致[18-19]。本研究中葡萄與其他物種中鑒定出的DELLA成員構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹被分為5個亞組，亞組Ⅱ中的VvGAI1與AtGAI和NtGAI1的親緣關(guān)系較近，說明在進化過程中具有高度的序列保守性，在蛋白功能上可能具有一定的相似性。

3.3 DELLA蛋白與JAZ蛋白的相互作用

由于缺少DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，DELLA蛋白常與不同信號途徑中的調(diào)控蛋白發(fā)生互作來發(fā)揮其分子功能[23]。WD-repeat/bHLH/MYB復(fù)合物作為DELLA和JAZ相互作用的直接靶點，介導(dǎo)GA和JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)節(jié)毛狀體發(fā)育中的協(xié)同作用[42]。DELLA蛋白與MYBL2和JAZ形成JAZ-DELLA-MYBL2螯合物，加快HLH/MYB亞基的釋放和活性MBW復(fù)合物的形成，從而促進花青素的積累，提高植物的抗逆性[43]。DELLA和JAZ蛋白相互作用，抑制MYB21和MYB24的轉(zhuǎn)錄激活，進而抑制擬南芥花絲伸長[44]。水稻（）DELLA蛋白SLR1、SLR1-LIKE可與OsJAZ8和OsJAZ9相互作用，以介導(dǎo)GA和JA對水稻高株等性狀的拮抗調(diào)控[45]。本研究通過酵母雙雜交試驗發(fā)現(xiàn)DELLA蛋白VvGAI與VvJAZ9存在互作關(guān)系，進一步利用雙分子熒光互補試驗也證實VvGAI1和VvJAZ9蛋白在植物體內(nèi)相互作用，與張晶星等[46]發(fā)現(xiàn)油松（）中5個JAZ蛋白與DELLA-like蛋白存在相互作用的結(jié)果類似。

3.4 多克隆抗體制備

目前，運用原核表達的重組蛋白免疫鼠、兔等動物制備多克隆抗體已成為一種行之有效且常用的方法[47]。此外，通過原核表達獲得大量的抗原蛋白，既可用于蛋白質(zhì)性質(zhì)與功能研究，也可用于蛋白質(zhì)的相互作用等生化功能研究[48]。在葡萄抗寒研究方面所制備出的多克隆抗體有anti-VvHOS1[28]、anti-VaCIPK18[30]和anti-VaERD15[49]，而、和在植物響應(yīng)低溫脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。本研究純化抗血清后得到了效價高且特異性好的anti- VvGAI1多克隆抗體。該抗體能夠特異識別‘霞多麗’葡萄中的VvGAI1蛋白。

3.5 GAI基因響應(yīng)逆境脅迫

DELLA蛋白作為GA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的關(guān)鍵負調(diào)節(jié)因子，主要通過參與調(diào)節(jié)植物生長來響應(yīng)逆境脅迫[20]。將甜菜（）在擬南芥異源表達可通過增強滲調(diào)節(jié)和抗氧化酶系統(tǒng)進而提高植株的耐鹽性[50]。有研究表明，干旱條件下紫花苜蓿（）的表達量逐漸上升并一直處于較高水平，可能通過與脫落酸相互協(xié)同參與干旱脅迫的響應(yīng)[51]。筆者前期通過4 ℃低溫處理2年生‘霞多麗’葡萄盆栽扦插苗，發(fā)現(xiàn)低溫處理后的葡萄葉片中呈先上升后下降的表達趨勢，在3 h時表達量達到最高，并推測該基因可能參與葡萄冷脅迫響應(yīng)[24]。本研究通過制備的anti-VvGAI1抗體檢測出4 ℃低溫處理的葡萄愈傷原生質(zhì)體中VvGAI1蛋白呈先上升后下降的表達趨勢，表明VvGAI1蛋白響應(yīng)低溫誘導(dǎo)表達，且與在轉(zhuǎn)錄水平上受低溫誘導(dǎo)表達趨勢相似。這也說明與其蛋白的表達水平在時間段上存在差異，植物不同組織和細胞對溫度的敏感性存在一定差異。植物原生質(zhì)體是指植物細胞去除細胞壁后形成的只由質(zhì)膜包裹的“裸露細胞”，是沒有細胞壁的特殊狀態(tài)，更容易感知外界刺激[52]。同樣在低溫處理下，葡萄原生質(zhì)體對冷刺激的感知速度以及響應(yīng)效率要高于葡萄植株。

4 結(jié)論

從歐洲葡萄‘霞多麗’中克隆獲得，ORF長1 773 bp，編碼590個氨基酸，無內(nèi)含子，含有1個外顯子以及DELLA和GRAS兩個高度保守結(jié)構(gòu)域，屬于植物GRAS家族的DELLA蛋白。蛋白聚類分析發(fā)現(xiàn)VvGAI1與擬南芥AtGAI和煙草NtGAI1親緣關(guān)系較近。VvGAI1是一個定位于細胞核中且具有轉(zhuǎn)錄激活活性的轉(zhuǎn)錄因子。酵母雙雜交與雙分子熒光互補試驗結(jié)果都表明VvGAI1與VvJAZ9蛋白具有互作關(guān)系。制備的anti-VvGAI1抗體能夠特異性檢測出‘霞多麗’葡萄中的VvGAI1蛋白，Western blot結(jié)果表明VvGAI1響應(yīng)低溫誘導(dǎo)表達。外源JA處理可以提高葡萄的抗寒性，而GA處理使葡萄對寒冷變得敏感。

[1] 劉暢, 楊興旺, 王小龍, 王志強, 劉鳳之, 王海波. 植物防凍劑對葡萄抗寒能力的影響研究進展. 中國果樹, 2022(3): 6-9.

LIU C, YANG X W, WANG X L, WANG Z Q, LIU F Z, WANG H B. Research progress on the effect of plant antifreeze on grape under low-temperature stress. China Fruits, 2022(3): 6-9. (in Chinese)

[2] 張利鵬, 劉懷鋒, 辛海平. 葡萄抗寒機制研究進展. 果樹學(xué)報, 2023, 40(2): 350-362.

ZHANG L P, LIU H F, XIN H P. Research progress in cold tolerance mechanism of grape. Journal of Fruit Science, 2023, 40(2): 350-362. (in Chinese)

[3] 段曉鳳, 張曉煜, 張磊, 劉建文, 南學(xué)軍, 李楠, 李紅英. 釀酒葡萄越冬防凍技術(shù)研究發(fā)展概況. 農(nóng)業(yè)工程, 2022, 12(6): 133-138.

DUAN X F, ZHANG X Y, ZHANG L, LIU J W, NAN X J, LI N, LI H Y. General situation of research and development on antifreeze technology for wine grape overwintering. Agricultural Engineering, 2022, 12(6): 133-138. (in Chinese)

[4] WANG Z L, WU D, HUI M, WANG Y, HAN X, YAO F, CAO X, LI Y H, LI H, WANG H. Screening of cold hardiness-related indexes and establishment of a comprehensive evaluation method for grapevines (). Frontiers in Plant Science, 2022, 13: 1014330.

[5] RICHARDS D E, KING K E, AIT-ALI T, HARBERD N P. How gibberellin regulates plant growth and development: a molecular genetic analysis of gibberellin signaling. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 2001, 52: 67-88.

[6] GAO X H, ZHANG Y Y, HE Z H, FU X D. Gibberellins. Hormone Metabolism and Signaling in Plants. Amsterdam: Elsevier, 2017: 107-160.

[7] LI W J, ZHANG J X, SUN H Y, WANG S M, CHEN K Q, LIU Y X, LI H, MA Y, ZHANG Z H. FveRGA1, encoding a DELLA protein, negatively regulates runner production in. Planta, 2018, 247(4): 941-951.

[8] XUE H D, GAO X, HE P, XIAO G H. Origin, evolution, and molecular function of DELLA proteins in plants. The Crop Journal, 2022, 10(2): 287-299.

[9] ZHAO B, LI H T, LI J J, WANG B, DAI C, WANG J, LIU K D.DS-3, encoding a DELLA protein, negatively regulates stem elongation through gibberellin signaling pathway. Theoretical and Applied Genetics, 2017, 130(4): 727-741.

[10] SUN T P. Gibberellin-GID1-DELLA: a pivotal regulatory module for plant growth and development. Plant Physiology, 2010, 154(2): 567-570.

[11] DAI C, XUE H W. Rice early flowering1, a CKI, phosphorylates DELLA protein SLR1 to negatively regulate gibberellin signalling. The EMBO Journal, 2010, 29(11): 1916-1927.

[12] VAN DE VELDE K, RUELENS P, GEUTEN K, ROHDE A, VAN DER STRAETEN D. Exploiting DELLA signaling in cereals. Trends in Plant Science, 2017, 22(10): 880-893.

[13] HUSSAIN A, PENG J R. DELLA proteins and GA signalling in. Journal of Plant Growth Regulation, 2003, 22(2): 134-140.

[14] TYLER L, THOMAS S G, HU J H, DILL A, ALONSO J M, ECKER J R, SUN T P. Della proteins and gibberellin-regulated seed germination and floral development in. Plant Physiology, 2004, 135(2): 1008-1019.

[15] HOU X L, HU W W, SHEN L S, LEE L Y C, TAO Z, HAN J H, YU H. Global identification of DELLA target genes duringflower development. Plant Physiology, 2008, 147(3): 1126-1142.

[16] 趙春麗, 王曉, 陳家蘭, 陳何, 王樂, 賴鐘雄, 劉生財. 植物DELLA蛋白家族研究進展. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 2020, 26(5): 1299-1308.

ZHAO C L, WANG X, CHEN J L, CHEN H, WANG L, LAI Z X, LIU S C. Progress in research on plant DELLA family proteins. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2020, 26(5): 1299-1308. (in Chinese)

[17] BOSS P K, THOMAS M R. Association of dwarfism and floral induction with a grape ‘green revolution’ mutation. Nature, 2002, 416(6883): 847-850.

[18] ACHEAMPONG A K, HU J H, ROTMAN A, ZHENG C L, HALALY T, TAKEBAYASHI Y, JIKUMARU Y, KAMIYA Y, LICHTER A, SUN T P, OR E. Functional characterization and developmental expression profiling of gibberellin signalling components in. Journal of Experimental Botany, 2015, 66(5): 1463-1476.

[19] 張文穎, 王晨, 朱旭東, 馬超, 王文然, 冷翔鵬, 鄭婷, 房經(jīng)貴. 葡萄全基因組DELLA蛋白基因家族鑒定及其應(yīng)答外源赤霉素調(diào)控葡萄果實發(fā)育的特征. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 51(16): 3130-3146. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.16.009.

ZHANG W Y, WANG C, ZHU X D, MA C, WANG W R, LENG X P, ZHENG T, FANG J G. Genome-wide identification and expression of DELLA protein gene family during the development of grape berry induced by exogenous GA. Scientia Agricultura Sinica, 2018, 51(16): 3130-3146. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752. 2018.16.009. (in Chinese)

[20] WANG Z J, LIU L, CHENG C H, REN Z Y, XU S M, LI X. GAI functions in the plant response to dehydration stress in. International Journal of Molecular Sciences, 2020, 21(3): 819.

[21] 王潤青, 樊曉聰, 宋梅芳, 肖陽, 郭林, 孟凡華, 楊青華, 吳大付, 楊建平. 小麥DELLA獲得性突變體矮變1號增強了幼苗的抗鹽能力. 作物學(xué)報, 2016, 42(11): 1721-1726.

WANG R Q, FAN X C, SONG M F, XIAO Y, GUO L, MENG F H, YANG Q H, WU D F, YANG J P. A wheat DELLA gain-of-function mutant aibian 1 promotes seedling salt tolerance. Acta Agronomica Sinica, 2016, 42(11): 1721-1726. (in Chinese)

[22] ACHARD P, GONG F, CHEMINANT S, ALIOUA M, HEDDEN P, GENSCHIK P. The cold-inducible CBF1factor-dependent signaling pathway modulates the accumulation of the growth-repressing DELLA proteins via its effect on gibberellin metabolism. The Plant Cell, 2008, 20(8): 2117-2129.

[23] LI Y, WANG H P, LI X L, LIANG G, YU D Q. Two DELLA- interacting proteins bHLH48 and bHLH60 regulate flowering under long-day conditions in. Journal of Experimental Botany, 2017, 68(11): 2757-2767.

[24] 劉德帥, 馮美, 樊姍姍, 孫雨桐, 遲敬楠, 姚文孔. 歐洲葡萄基因互作蛋白的篩選與驗證. 果樹學(xué)報, 2023, 40(7): 1294-1311.

LIU D S, FENG M, FAN S S, SUN Y T, CHI J N, YAO W K. Screening and verification ofgene interacting proteins in. Journal of Fruit Science, 2023, 40(7): 1294-1311. (in Chinese)

[25] WANG L X, NICK P. Cold sensing in grapevine-Which signals are upstream of the microtubular “thermometer”. Plant, Cell & Environment, 2017, 40(11): 2844-2857.

[26] WANG X H, GUO R R, TU M X, WANG D J, GUO C L, WAN R, LI Z, WANG X P. Ectopic expression of the wild grape WRKY transcription factor VqWRKY52 inenhances resistance to the biotrophic pathogen powdery mildew but not to the necrotrophic pathogen. Frontiers in Plant Science, 2017, 8: 97.

[27] WANG X C, ZHAO M Z, WU W M, KORIR N K, QIAN Y M, WANG Z W. Comparative transcriptome analysis of berry-sizing effects of gibberellin (GA3) on seedlessL.Genes & Genomics, 2017, 39(5): 493-507.

[28] 俞沁含, 焦淑珍, 吳楠, 張寧波, 徐偉榮. 葡萄E3泛素酶HOS1基因克隆、表達及抗血清制備. 園藝學(xué)報, 2021, 48(6): 1173-1182.

YU Q H, JIAO S Z, WU N, ZHANG N B, XU W R. Molecular cloning, expression and polyclonal antibody preparation of E3 ubiquitin ligase genefrom. Acta Horticulturae Sinica, 2021, 48(6): 1173-1182. (in Chinese)

[29] SASAMOTO H, AZUMI Y, SHIMIZU M, HACHINOHE Y K, SUZUKI S.bioassay of allelopathy ofby sandwich method and protoplast co-culture method with digital image analysis. Plant Biotechnology, 2017, 34(4): 199-202.

[30] 吳楠, 張寧波, 鄭巧玲, 陳衛(wèi)平, 徐偉榮. 山葡萄VaCIPK18原核表達與多克隆抗體制備. 核農(nóng)學(xué)報, 2020, 34(7): 1387-1396.

WU N, ZHANG N B, ZHENG Q L, CHEN W P, XU W R. Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of calcineurin B-like proteins (CBLs) interacting protein kinases protein kinase VaCIPK18 from. Journal of Nuclear Agricultural Sciences, 2020, 34(7): 1387-1396. (in Chinese)

[31] BERTINI E, TORNIELLI G B, PEZZOTTI M, ZENONI S. Regeneration of plants from embryogenic callus-derived protoplasts of garganega and sangiovese grapevine (L.) cultivars. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2019, 138(2): 239-246.

[32] YAO W K, WANG L, WANG J, MA F L, YANG Y Z, WANG C, TONG W H, ZHANG J X, XU Y, WANG X P, ZHANG C H, WANG Y J., a novel gene from Chinese grapevine,, targets VpICE1 to enhance cold tolerance. Journal of Experimental Botany, 2017, 68(11): 2933-2949.

[33] GHORBEL M, BRINI F, SHARMA A, LANDI M. Role of jasmonic acid in plants: The molecular point of view. Plant Cell Reports, 2021, 40(8): 1471-1494.

[34] BAO S J, HUA C M, SHEN L S, YU H. New insights into gibberellin signaling in regulating flowering in. Journal of Integrative Plant Biology, 2020, 62(1): 118-131.

[35] DING F, WANG C, XU N, WANG M L, ZHANG S X. Jasmonic acid-regulated putrescine biosynthesis attenuates cold-induced oxidative stress in tomato plants. Scientia Horticulturae, 2021, 288: 110373.

[36] ZHAO M L, WANG J N, SHAN W, FAN J G, KUANG J F, WU K Q, LI X P, CHEN W X, HE F Y, CHEN J Y, LU W J. Induction of jasmonate signalling regulators MaMYC2s and their physical interactions with MaICE1 in methyl jasmonate-induced chilling tolerance in banana fruit. Plant, Cell & Environment, 2013, 36(1): 30-51.

[37] JIN P, DUAN Y F, WANG L, WANG J, ZHENG Y H. Reducing chilling injury of loquat fruit by combined treatment with hot air and methyl jasmonate. Food and Bioprocess Technology, 2014, 7(8): 2259-2266.

[38] 解振宇, 楊江山. 茉莉酸甲酯對高寒地區(qū)設(shè)施延后栽培葡萄生理的影響. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2016, 32(16): 66-71.

XIE Z Y, YANG J S. Effect of methyl jasmonate on physiology of delayed culture grape in alpine greenhouse. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2016, 32(16): 66-71. (in Chinese)

[39] 常博文, 鐘鵬, 劉杰, 唐中華, 高亞冰, 于洪久, 郭煒. 低溫脅迫和赤霉素對花生種子萌發(fā)和幼苗生理響應(yīng)的影響. 作物學(xué)報, 2019, 45(1): 118-130.

CHANG B W, ZHONG P, LIU J, TANG Z H, GAO Y B, YU H J, GUO W. Effect of low-temperature stress and gibberellin on seed germination and seedling physiological responses in peanut. Acta Agronomica Sinica, 2019, 45(1): 118-130. (in Chinese)

[40] WANG Y J, KARIM A, XIAO K. Effects of exogenous GA3on cold resistance of Korla fragrant pear. Hans Journal of Agricultural Sciences, 2014, 4(6): 123-131.

[41] 楊光, 曹雪, 房經(jīng)貴, 宋長年, 王晨, 王西成. ‘藤稔’葡萄VvGAI基因的克隆、亞細胞定位及時空表達分析. 園藝學(xué)報, 2011, 38(10): 1883-1892.

YANG G, CAO X, FANG J G, SONG C N, WANG C, WANG X C. Cloning, subcellular localization and spatiotemporal expression of a VvGAI gene from grapevine ‘Fujiminori’. Acta Horticulturae Sinica, 2011, 38(10): 1883-1892. (in Chinese)

[42] QI T C, HUANG H, WU D W, YAN J B, QI Y J, SONG S S, XIE D X.DELLA and JAZ proteins bind the WD-repeat/ bHLH/ MYB complex to modulate gibberellin and jasmonate signaling synergy. The Plant Cell, 2014, 26(3): 1118-1133.

[43] XIE Y, TAN H J, MA Z X, HUANG J R. DELLA proteins promote anthocyanin biosynthesis via sequestering MYBL2 and JAZ suppressorsof the MYB/bHLH/WD40 complex in. Molecular Plant, 2016, 9(5): 711-721.

[44] HUANG H, GONG Y L, LIU B, WU D W, ZHANG M, XIE D X, SONG S S. The DELLA proteins interact with MYB21 and MYB24 to regulate filament elongation in. BMC Plant Biology, 2020, 20(1): 64.

[45] UM T Y, LEE H Y, LEE S, CHANG S H, CHUNG P J, OH K B, KIM J K, JANG G, DO CHOI Y. Jasmonate zim-domain protein 9 interacts with slender rice 1 to mediate the antagonistic interaction between jasmonic and gibberellic acid signals in rice. Frontiers in Plant Science, 2018, 9: 1866.

[46] 張晶星, 馬彥廣, 王輝麗, 劉紅梅, 李偉. 油松基因家族特征及其與DELLA蛋白互作的功能域鑒定. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2022, 44(12): 12-22.

ZHANG J X, MA Y G, WANG H L, LIU H M, LI W. Characteristics ofgene family ofand identification of functional domain of its interaction with DELLA protein. Journal of Beijing Forestry University, 2022, 44(12): 12-22. (in Chinese)

[47] 程彥偉, 李亮, 沈嶸, 齊耀程, 劉曉宇, 王寧, 張煒. 水稻LRR型類受體蛋白激酶胞外區(qū)的原核表達及多克隆抗體制備. 生物化學(xué)與生物物理進展, 2008, 35(9): 1077-1083.

CHENG Y W, LI L, SHEN R, QI Y C, LIU X Y, WANG N, ZHANG W. Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of the extracellular domain about rice LRR receptor-like protein kinase. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2008, 35(9): 1077-1083. (in Chinese)

[48] 王增, 代茹, 張江巍, 陳尚武, 張文, 馬會勤. 擬南芥WUSCHEL蛋白的原核表達、親和純化和多克隆抗體制備. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(9): 1409-1416.

WANG Z, DAI R, ZHANG J W, CHEN S W, ZHANG W, MA H Q. Induced expression ofWUSCHEL in, affinity protein purification and polyclonal antibody preparation. Chinese Journal of Biotechnology, 2009, 25(9): 1409-1416. (in Chinese)

[49] 張劍俠, 翟煥, 牛茹萱, 李瑞民. 中國野生山葡萄VaERD15基因的原核表達及多克隆抗體制備. 西北林學(xué)院學(xué)報, 2014, 29(6): 100-105.

ZHANG J X, ZHAI H, NIU R X, LI R M. Prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of the VaERD15 gene from Chinese wild. Journal of Northwest Forestry University, 2014, 29(6): 100-105. (in Chinese)

[50] 馬慧敏, 孫培琳, 馬春泉. 轉(zhuǎn)錄因子BvM14-GAI耐鹽功能研究. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2021, 37(34): 34-42.

MA H M, SUN P L, MA C Q. Salt tolerance function of transcription factor BvM14-GAI. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2021, 37(34): 34-42. (in Chinese)

[51] 張涵, 王學(xué)敏, 劉希強, 馬琳, 溫紅雨, 王贊. 紫花苜蓿MsGAI的克隆、表達及遺傳轉(zhuǎn)化. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2019, 52(2): 201-214. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.002.

ZHANG H, WANG X M, LIU X Q, MA L, WEN H Y, WANG Z. Cloning expression analysis and transformation of MsGAI gene fromL.. Scientia Agricultura Sinica, 2019, 52(2): 201-214. doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.002. (in Chinese)

[52] 吳月燕, 陳天池, 邱甜, 沈樂意, 謝曉鴻. '夏黑'葡萄組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體分離和瞬時表達體系的建立. 植物生理學(xué)報, 2021, 57(11): 2128-2144.

WU Y Y, CHEN T C, QIU T, SHEN L Y, XIE X H. Establishment of tissue culture, protoplast isolation and transient expression system in ‘Summer Black’ grape. Plant Physiology Journal, 2021, 57(11): 2128-2144. (in Chinese)

Analysis of the Interaction Between VvGAI1 and VvJAZ9 Proteins in Grape and Its Expression Pattern Under Low Temperature

LIU DeShuai, FENG Mei, SUN YuTong, WANG Ye, CHI JingNan, YAO WenKong

College of Enology and Horticulture, Ningxia University/Ningxia Modern Facility Horticulture Engineering Technology Research Center/Ningxia Key Laboratory of Modern Molecular Breeding of Dominant and Characteristic Crops, Yinchuan 750021

【Objective】DELLA protein belongs to plant-specific GRAS protein family, which is a significant regulatory factor in GA signal transduction pathway and plays important roles in plant growth, development and resistance to different stresses. In this study, the European grapevinegene was cloned and the analysis of subcellular localization, protein interaction and expression were performed, so as to lay the foundation for the further study of the function of DELLA protein in response to cold stress in grapevine.【Method】Thegene sequence was obtained by homologous cloning from the leaves ofcv. Chardonnay. Thesequence was analyzed by bioinformatics method, and the multiple sequence alignment and phylogenetic trees were performed by DNAMAN and MEGA7.0, respectively. The location of VvGAI1 protein in cells was determined by subcellular localization, and the transcriptional activation activity of the VvGAI1 protein was confirmed by a yeast assay. The interaction between VvGAI1 protein and VvJAZ9 protein was verified by yeast two-hybrid and BiFC assays. The VvGAI1 protein polyclonal antibodies from rabbit was prepared by VvGAI1 protein purified from prokaryotic expression. The VvGAI1 protein expression at low temperature was detected by Western blot method. The effect of exogenous MeJA and GA3on the cold resistance in grape was analyzed by relative electrical conductivity.【Result】Thegene was cloned from Chardonnay leaves, with carrying an ORF of 1773 bp, encoding 590 amino acids, locating on chromosome 1, and containing only one exon. The VvGAI1 protein had a molecular weight of 64.87 kDa and pI of 5.31, which was an acidic unstable hydrophilic protein. The VvGAI1 belonged to GRAS family and had the conserved DELLA and GRAS domains. Protein clustering analysis showed that VvGAI1 was closely related toGAI and tobacco GAI1. The results of subcellular location and transcriptional activation showed that VvGAI1 was a transcription factor localized in the nucleus and had transcriptional self-activation activity. The interaction between VvGAI1 and VvJAZ9 was confirmed by yeast two-hybrid andBiFC assays. Thegene sequence was cloned into the prokaryotic expression vector to form a pET28b-VvGAI1 recombinant vector, and theBL21 carrying pET28b-VvGAI1 recombinant vector was incubated in culture medium with 1.0 mmol?L-1isopropyl--d-thiogalactoside (IPTG) at 16 ℃ to obtain VvGAI1-His fusion protein. The anti-VvGAI1 polyclonal antibody (rabbit-derived) was prepared by antigen immunization and serum purification and used to specifically detect VvGAI1 protein in Chardonnay grapes. Western blot results showed that the VvGAI1 protein in grape protoplasts under low temperature treatment showed an increasing first and then decreasing trend, which indicated the expression of VvGAI1 protein was induced at a low temperature. For 50 μmol·L-1MeJA and 50 μmol·L-1GA3treatments, compared with the control group exogenous MeJA treatment could improve the cold resistance of grape, whereas GA3treatment made grapes more sensitive to cold.【Conclusion】Grape VvGAI1 protein was a transcription factor and interacts with VvJAZ9. The VvGAI1 responded to low temperature stress, and exogenous MeJA was able topositively regulate the cold stress, while GA3negatively regulated the cold response.

; DELLA protein;; protein interaction; low temperature; expression pattern

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.15.012

2023-01-12；

2023-03-31

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金（31960586）、寧夏回族自治區(qū)重點研發(fā)項目（2018BEB04004）、寧夏回族自治區(qū)青年科技人才托舉工程項目

劉德帥，E-mail：lds201220@163.com。通信作者姚文孔，E-mail：yaowenkong@163.com

（責(zé)任編輯 趙伶俐）