商品疫苗對(duì)我國(guó)h9.4.2.5分支H9N2亞型禽流感分離株的免疫保護(hù)

麻琦，和新文，王燕，劉艷晶，潘舒心,3，侯玉杰，施建忠,3，鄧國(guó)華,3，包紅梅,3，劉景利，郭興福，毛勝剛，胡井雷，路通，楊帆，田國(guó)彬,3，曾顯營(yíng),3，陳化蘭,3

商品疫苗對(duì)我國(guó)h9.4.2.5分支H9N2亞型禽流感分離株的免疫保護(hù)

麻琦1，和新文1，王燕1，劉艷晶1，潘舒心1,3，侯玉杰1，施建忠1,3，鄧國(guó)華1,3，包紅梅1,3，劉景利2，郭興福2，毛勝剛2，胡井雷2，路通2，楊帆2，田國(guó)彬1,3，曾顯營(yíng)1,3，陳化蘭1,3

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所/動(dòng)物疫病防控全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家禽類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源庫(kù)，哈爾濱 150069；2哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司，哈爾濱 150069；3農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽流感等家禽重大疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150069

【目的】我國(guó)批準(zhǔn)使用的H9亞型禽流感（avian influenza，AI）商品化滅活疫苗種類繁多，其免疫效果和選用受到養(yǎng)殖者的廣泛關(guān)注。通過(guò)評(píng)估不同商品疫苗對(duì)我國(guó)近期H9N2亞型AIV的免疫保護(hù)效果，以期為H9亞型AIV的免疫防控提供科學(xué)參考?！痉椒ā恳罁?jù)國(guó)家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)疫苗批簽發(fā)數(shù)據(jù)，從在售的40種H9亞型AI商品疫苗中選擇批簽發(fā)數(shù)量較多的4種疫苗（A—D疫苗），進(jìn)行免疫攻毒試驗(yàn)。4株h9.4.2.5分支的H9N2亞型分離株CK/XJ/S1204/ 2015、DK/JX/S4512/2017、CK/YN/S1666/2020和CK/NX/S4590/2020為攻毒毒株，分別測(cè)定4株病毒的雞胚半數(shù)感染量（EID50）、雞半數(shù)感染量（CID50）和細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50），以確定動(dòng)物試驗(yàn)的攻毒劑量和細(xì)胞試驗(yàn)的感染劑量。每種疫苗以產(chǎn)品推薦劑量免疫3周齡SPF雞各40只，同時(shí)設(shè)同日齡SPF雞40只接種PBS作為對(duì)照組；免疫3周時(shí)，采集所有試驗(yàn)雞血清，測(cè)定血凝抑制抗體（HI）和中和抗體（NT）滴度；同時(shí)將每種商品疫苗接種40只SPF雞進(jìn)行隨機(jī)分組，每組10只，連同10只對(duì)照組雞，以10 CID50的劑量鼻腔感染H9N2亞型分離株，分別進(jìn)行商品疫苗對(duì)4株病毒的攻毒保護(hù)試驗(yàn)。采集攻毒后3、5 d喉頭及泄殖腔棉拭子樣品，接種10日齡雞胚檢測(cè)排毒情況，統(tǒng)計(jì)疫苗保護(hù)率，比較疫苗對(duì)H9N2亞型分離株的免疫保護(hù)效果?！窘Y(jié)果】4株H9N2亞型分離株的CID50依次為103.5、102.5、102.5和103.5EID50/0.1 mL。商品疫苗接種后3周，各免疫組SPF雞血清中針對(duì)商品化H9亞型HI試驗(yàn)抗原（CK/SH/10/2001）的HI抗體均在9.4 log2—11 log2之間，但針對(duì)攻毒株的HI抗體平均效價(jià)在4.6 log2—10.8 log2之間，不同疫苗免疫組間存在較大差異，最大差異為64倍，各免疫組NT抗體平均效價(jià)在6.7 log2—12.2 log2之間，最大差異為32倍，對(duì)照組雞的HI抗體和NT抗體均為陰性。以滴鼻方式感染不同H9病毒后，4種疫苗的免疫保護(hù)效果存在較大差別，在攻擊CK/XJ/S1204/2015毒株的試驗(yàn)中，3種疫苗（B—D疫苗）能為免疫雞提供80%以上保護(hù)；在攻擊DK/JX/S4512/ 2017毒株試驗(yàn)中，僅1種疫苗（B疫苗）能為免疫雞提供80%以上保護(hù)；在攻擊CK/YN/S1666/2020毒株的試驗(yàn)中，2種疫苗（A和B疫苗）能為免疫雞提供80%以上免疫保護(hù)；而攻擊CK/NX/S4590/2020毒株，4種疫苗免疫雞的保護(hù)率均低于80%，而同期各對(duì)照組雞均排毒，排毒率均高于80%?！窘Y(jié)論】不同商品疫苗預(yù)防近期H9亞型分離株感染的免疫保護(hù)效果存在較大差異，疫苗抗原與分離株之間的抗原性差異是免疫保護(hù)率降低的主要原因；使用H9N2亞型流行毒株測(cè)定免疫后的HI抗體和NT抗體可作為評(píng)價(jià)商品疫苗免疫保護(hù)效果的重要依據(jù)。本研究為商品H9疫苗的科學(xué)選用提供重要參考。

H9N2亞型；AIV；商品疫苗；免疫效果；禽流感

0 引言

【研究意義】H9N2亞型禽流感（avian influenza，AI）是由H9N2亞型禽流感病毒（avian influenza virus, AIV）引起的低致病性禽流感（low pathogenic avian influenza，LPAI）[1-2]。1966年，美國(guó)威斯康星州在全球范圍內(nèi)首次報(bào)道火雞群發(fā)生H9N2亞型AI感染事件[3]，隨后該疫病向全球傳播。我國(guó)于1994年在廣東省的雞群中首次分離到H9N2亞型AIV[4]，目前，H9N2亞型AI已經(jīng)成為我國(guó)家禽中最為流行的AI亞型[5]。H9N2亞型AIV單獨(dú)感染家禽后臨床癥狀不明顯[6]，但其極易與其他病原造成混合感染[7-11]，導(dǎo)致感染家禽表現(xiàn)出較為明顯的臨床癥狀，嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致死亡，持續(xù)困擾養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[12-13]。同時(shí)，H9病毒不僅可以感染人，也作為AIV內(nèi)部基因供體，促進(jìn)了H5N6、H5N8、H7N9以及H10N8等新型AIV的出現(xiàn)。我國(guó)自1998年開(kāi)始實(shí)施疫苗接種策略[2,14-15]，在控制H9亞型AI中發(fā)揮了重要作用。國(guó)家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)顯示，自2010年至2021年我國(guó)已累計(jì)有43種H9亞型禽流感相關(guān)疫苗批準(zhǔn)獲得新獸藥證書(shū)，形成了眾多疫苗產(chǎn)品同時(shí)生產(chǎn)和應(yīng)用的局面。近年來(lái)，盡管疫苗在我國(guó)廣泛使用，但H9N2亞型AIV是所有亞型AIV中分離率最高的亞型[2,16]，引起人們對(duì)當(dāng)前我國(guó)家禽中應(yīng)用的商品化H9亞型AI疫苗免疫保護(hù)效果的擔(dān)憂，同時(shí)我國(guó)種類繁多的商品化H9疫苗也給養(yǎng)殖者選用帶來(lái)困難。因此評(píng)估現(xiàn)有商品疫苗對(duì)指導(dǎo)H9N2亞型AI的免疫防控具有重要臨床意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1998—2006年間流行毒株的抗原變化差異不明顯，疫苗的保護(hù)率為100%，但2006年以后，H9N2亞型AIV抗原性發(fā)生了較大變化，疫苗的保護(hù)率也在逐漸下降，家禽感染H9亞型AIV的數(shù)量逐漸增多[17]。LI等進(jìn)行的家禽活禽市場(chǎng)暴露試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，接種過(guò)H9亞型疫苗的雞依然能夠感染活禽市場(chǎng)中的H9N2病毒[18]。我國(guó)使用的H9N2亞型AI商品疫苗對(duì)近期H9流行毒株的免疫保護(hù)效果還沒(méi)有相關(guān)系統(tǒng)的報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本研究基于國(guó)家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)中疫苗的種類和批簽發(fā)數(shù)量，篩選出批簽發(fā)數(shù)量較多的H9亞型AI疫苗，使用2015—2020年分離的4株H9N2亞型病毒作為攻毒毒株，進(jìn)行疫苗免疫保護(hù)效果評(píng)估?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】評(píng)估市場(chǎng)上主要H9亞型AI商品化疫苗對(duì)近期H9流行毒株的免疫保護(hù)效果，為我國(guó)H9N2亞型AIV的疫苗臨床應(yīng)用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

本研究于2019—2022年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所完成。

1.2 病毒株

A/chicken/XinJiang/S1204/2015（H9N2）（簡(jiǎn)稱CK/XJ/S1204/2015）、A/duck/JiangXi/S4512/2017（H9N2）（簡(jiǎn)稱DK/JX/S4512/2017）、A/chicken/ YunNan/S1666/2020（H9N2）（簡(jiǎn)稱CK/YN/S1666/ 2020）以及A/chicken/NingXia/S4590/2020（H9N2）（簡(jiǎn)稱CK/NX/S4590/2020）等4株病毒用于主要商品化疫苗對(duì)H9N2亞型現(xiàn)地分離株的免疫保護(hù)效果研究，以上病毒株均屬于h9.4.2.5分支，由國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保存。

1.3 疫苗

在國(guó)家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢H9亞型AI疫苗相關(guān)信息，以2019年H9亞型AI相關(guān)疫苗產(chǎn)品的批簽發(fā)數(shù)為依據(jù)，篩選出批簽發(fā)數(shù)量較多的4種H9N2亞型AI疫苗作為本研究的評(píng)估疫苗。相關(guān)疫苗均為市場(chǎng)銷售疫苗，編號(hào)為A—D。

1.4 抗原

以H9N2亞型AIV A/chicken/Shanghai/10/2001 （CK/SH/10/2001）株為種毒制備的商品化H9亞型AI血凝抑制試驗(yàn)（HI）抗原由哈爾濱維科生物技術(shù)有限公司提供。4株H9攻毒毒株抗原（CK/XJ/S1204/2015、DK/JX/S4512/2017、CK/YN/S1666/2020和CK/NX/ S4590/2020）均為接種雞胚收獲尿囊液經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活后備用。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、雞胚

3周齡SPF雞和9—11日齡雞胚均由依托中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的國(guó)家禽類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源庫(kù)提供。所有試驗(yàn)雞均飼養(yǎng)在負(fù)壓隔離器內(nèi)，所有H9亞型AIV的相關(guān)試驗(yàn)均在生物安全2級(jí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

1.6 攻毒毒株EID50、CID50和TCID50測(cè)定

雞胚半數(shù)感染量（EID50）測(cè)定 根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版附錄）規(guī)定的方法，將CK/ XJ/S1204/2015、DK/JX/S4512/2017、CK/YN/S1666/2020和CK/NX/S4590/2020，4株H9N2亞型代表毒株病毒原液分別用無(wú)菌PBS進(jìn)行10倍倍比稀釋（10-6— 10-10），每個(gè)稀釋度接種5枚雞胚，0.1 mL/枚，37℃培養(yǎng)箱孵育，每日照胚，死亡雞胚隨時(shí)取出，置于4℃。孵育至72 h后，檢測(cè)所有雞胚尿囊液血凝價(jià)（HA），HA≥4 log2判為感染。按照Reed-Muench法計(jì)算病毒EID50。

雞半數(shù)感染量（CID50）測(cè)定 將CK/XJ/S1204/ 2015、DK/JX/S4512/2017、CK/YN/S1666/2020和CK/ NX/S4590/2020，4株H9N2亞型代表毒株病毒液分別用無(wú)菌PBS以102EID50—105EID50稀釋，每個(gè)稀釋度分別經(jīng)鼻腔感染5只3周齡SPF雞，0.1 mL/只，感染后5 d采集喉頭和泄殖腔拭子，接種雞胚病毒滴定，判定感染雞排毒陽(yáng)性數(shù)（每只雞喉頭或泄殖腔拭子樣品病毒分離陽(yáng)性，均判定為該只雞排毒），計(jì)算病毒的CID50。

細(xì)胞半數(shù)感染量（TCID50）測(cè)定 取病毒液用無(wú)血清DMEM連續(xù)進(jìn)行10倍倍比稀釋（10-1—10-10）。取24 h左右長(zhǎng)滿單層MDCK細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去原培養(yǎng)基，各稀釋度分別接種8孔，每孔加入100 μL稀釋好的病毒液，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照孔。37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，72 h后用1%雞紅細(xì)胞懸液滴定結(jié)果，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

1.7 4種商品化疫苗對(duì)我國(guó)H9N2亞型流行毒株的免疫保護(hù)

1.7.1 分組免疫 A—D每種疫苗分別以說(shuō)明書(shū)推薦劑量（分別為0.3 mL/只、0.5 mL/只）各接種3周齡SPF雞40只，接種途徑為肌肉注射，另外40只接種同劑量的PBS，作為對(duì)照組。40只接種相同疫苗的SPF雞隨機(jī)分組，10只/組，4種疫苗共40只免疫雞，連同10只對(duì)照組雞，用于對(duì)1株病毒的測(cè)試，包括相應(yīng)HI抗體和中和抗體測(cè)定及病毒攻擊試驗(yàn)。

1.7.2 HI抗體檢測(cè) 在免疫3周時(shí)，翅下靜脈采集所有試驗(yàn)雞血清，分別用商品H9抗原和攻毒毒株抗原進(jìn)行HI抗體測(cè)定。參照高致病性禽流感診斷技術(shù)（GB-T18936-2020）附錄中微量血凝抑制試驗(yàn)（HI）方法進(jìn)行。

1.7.3 中和抗體（NT）檢測(cè) 參照國(guó)家流感中心標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（修訂版）中的禽流感微量中和抗體檢測(cè)方法[19]，分別檢測(cè)4種疫苗免疫SPF雞血清針對(duì)H9N2攻毒毒株的中和抗體效價(jià)。將2倍連續(xù)稀釋的雞血清與100 TCID50測(cè)試病毒1﹕1混合，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中互作1 h，將100 μL互作液轉(zhuǎn)移至長(zhǎng)滿單層MDCK細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照孔。37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，72 h后用1%雞紅細(xì)胞懸液滴定結(jié)果。

1.7.4 病毒攻擊試驗(yàn) 疫苗接種后3周時(shí)，將4種疫苗免疫的雞40只，連同對(duì)照雞10只，以鼻腔感染方式進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為10 CID50。攻毒后3、5 d采集所有攻毒試驗(yàn)雞喉頭和泄殖腔棉拭子樣品，接種雞胚進(jìn)行病毒滴定，檢測(cè)排毒情況（病毒分離陽(yáng)性即表明該只雞排毒），計(jì)算疫苗免疫保護(hù)率（組內(nèi)未排毒雞數(shù)/組內(nèi)總雞數(shù)×100%）。所有試驗(yàn)雞觀察14 d，記錄試驗(yàn)雞發(fā)病和死亡情況。

1.8 H9N2亞型代表毒株抗原性分析

為進(jìn)一步了解4株H9N2亞型分離株間的抗原性關(guān)系，攻毒試驗(yàn)對(duì)照組雞感染14 d后，心臟采血收集血清，另用我國(guó)早期H9N2分離毒株A/chicken/ Shanghai/10/2001/（H9N2）（簡(jiǎn)稱CK/SH/10/2001）（h9.4.2.4分支），進(jìn)行4株H9N2亞型AIV代表株抗原性分析。參考高致病性禽流感診斷技術(shù)（GB- T18936-2020）附錄中微量血凝抑制試驗(yàn)（HI）方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 試驗(yàn)商品疫苗的篩選

國(guó)家獸藥基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)中H9疫苗產(chǎn)品批簽發(fā)數(shù)據(jù)顯示，2019年共有40種H9疫苗在批準(zhǔn)銷售，均為滅活疫苗，批簽發(fā)總計(jì)為2 549批次，其中來(lái)自不同廠家、批簽發(fā)數(shù)量較多的4種疫苗（編號(hào)為A—D）累計(jì)1 001批次，占年度批簽發(fā)總量的39.2%。為避免商業(yè)利益糾紛，未公開(kāi)相關(guān)被評(píng)估疫苗的名稱和生產(chǎn)企業(yè)。

2.2 病毒EID50、CID50、TCID50測(cè)定

4株病毒的EID50、CID50和TCID50測(cè)定結(jié)果如表1所示。4株病毒的EID50、CID50和TCID50差異較小。病毒的EID50在10-8.5/0.1 mL和10-8.94/0.1 mL之間；CID50在102.5EID50/0.1 mL和103.5EID50/0.1 mL之間；TCID50在10-6.5/0.1 mL和10-7.5/0.1 mL之間。

2.3 4種商品疫苗免疫SPF雞血清的HI抗體測(cè)定

HI抗體是評(píng)價(jià)禽流感疫苗免疫效果的最常用方法。SPF雞接種A—D疫苗3周時(shí)，采用微量HI試驗(yàn)檢測(cè)各免疫組雞血清針對(duì)商品化H9抗原和攻毒毒株的HI抗體。結(jié)果顯示，用于4株H9分離株攻毒的A—D疫苗免疫雞血清針對(duì)商品化H9抗原（CK/SH/10/2001）的HI平均抗體效價(jià)分別在9.4 log2—11 log2之間（圖1）；用CK/XJ/S1204/2015分離株同時(shí)測(cè)定對(duì)應(yīng)攻毒免疫雞血清的HI平均抗體滴度在9.2 log2—10.7 log2（圖1-a），表明A—D疫苗中的疫苗抗原與來(lái)源于早期毒株的H9商品化HI試驗(yàn)抗原和CK/XJ/S1204/2015分離株具有較近的抗原性；而用DK/JX/S4512/2017和CK/YN/S1666/2020分離株分別測(cè)定對(duì)應(yīng)攻毒免疫雞（A—D疫苗）血清的HI抗體時(shí)，A、C和D疫苗免疫雞血清HI抗體平均滴度均在4.8 log2—7.8 log2之間，只有B疫苗免疫雞血清針對(duì)2株分離株的HI抗體平均滴度分別為10.0 log2和10.8 log2（圖1-b和c）；用CK/NX/S4590/2020分離株同時(shí)測(cè)定對(duì)應(yīng)攻毒免疫雞血清的HI平均抗體滴度在4.7 log2—8.4 log2之間（圖1-d）；對(duì)照組雞血清對(duì)代表毒株抗原的HI抗體均低于2 log2，判定其為抗體陰性。結(jié)果表明，4種商品疫苗接種SPF雞后的血清與早期H9毒株（CK/SH/10/2001）均具有較好HI交互反應(yīng)，而與近期H9分離株的HI交互反應(yīng)存在不同程度的差異。

表1 4株H9N2亞型AIV的EID50、CID50和TCID50

圖1 不同疫苗接種組SPF雞3周的HI抗體平均效價(jià)

2.4 4種商品疫苗免疫SPF雞血清的中和抗體測(cè)定

中和抗體水平是評(píng)價(jià)疫苗免疫效果的重要依據(jù)。在SPF雞接種A—D疫苗3周時(shí)，以4株分離株作為檢驗(yàn)毒株，采取微量中和試驗(yàn)的方法檢測(cè)用于攻毒測(cè)試的各對(duì)應(yīng)免疫組雞血清的中和抗體。由于部分血清余量較少，每組10份血清中隨機(jī)選擇6份足量血清，進(jìn)行中和抗體效價(jià)檢測(cè)。結(jié)果顯示，在用CK/XJ/S1204/ 2015分離株測(cè)定相應(yīng)各免疫組的平均中和抗體中，A疫苗組為8.9 log2，B、C和D疫苗組均在10.1 log2— 11.1 log2之間（圖2-a）。在用DK/JX/S4512/2017分離株測(cè)定相應(yīng)各免疫組的平均中和抗體效價(jià)中，僅B疫苗組較高（10.1 log2），其余組均在6.8 log2—8.8 log2之間（圖2-b）。在用CK/YN/S1666/2020分離株測(cè)定相應(yīng)各免疫組的平均中和抗體中，A和B疫苗組達(dá)到10 log2，分別為10.9 log2、12.2 log2，而C和D疫苗組分別僅為7.6 log2和8.4 log2（圖2-c）。在用CK/NX/S4590/2020分離株測(cè)定相應(yīng)各免疫組的平均中和抗體中，4個(gè)疫苗組均低于9.0 log2，在7 log2—8.6 log2之間（圖2-d）。結(jié)果表明，4種商品疫苗誘導(dǎo)針對(duì)不同分離株的中和抗體存在較大差異，與疫苗株和攻毒毒株的抗原性差異趨勢(shì)基本一致。

圖2 不同疫苗組免疫SPF雞攻毒前針對(duì)攻毒毒株的NT抗體效價(jià)

2.5 4種商品疫苗對(duì)我國(guó)H9N2亞型分離株的攻毒試驗(yàn)結(jié)果

攻毒測(cè)試是評(píng)價(jià)疫苗免疫保護(hù)效果的標(biāo)準(zhǔn)方法。本研究使用4株分離株，模擬自然感染方式，以鼻腔感染途徑，以10 CID50的攻毒劑量，對(duì)各組試驗(yàn)雞進(jìn)行攻毒評(píng)估。攻毒結(jié)果顯示，攻毒后14 d的觀察期內(nèi)，所有對(duì)照組和免疫組雞均無(wú)死亡，沒(méi)有明顯的臨床癥狀表現(xiàn)；對(duì)照組雞3和5 d喉頭拭子樣品病毒分離陽(yáng)性數(shù)均在9/10以上，泄殖腔排毒因毒株而異；4種疫苗免疫雞3和5 d拭子樣品病毒分離陽(yáng)性數(shù)和病毒滴度大都低于對(duì)照組雞，但不同疫苗免疫組保護(hù)率存在差異。其中，攻擊CK/XJ/S1204/2015分離株后，4種疫苗免疫組的保護(hù)率依次為10%、80%、80%、90%；攻擊DK/JX/S4512/2017分離株后，A、C和D疫苗組免疫雞5 d拭子樣品分別10/10、8/10和10/10排毒陽(yáng)性，接近于對(duì)照組雞排毒率，B疫苗則在3和5 d拭子樣品中均未檢測(cè)到排毒，4種疫苗免疫組的保護(hù)率依次為0、100%、10%、0；攻擊CK/YN/ S1666/2020分離株后，4種疫苗免疫組的保護(hù)率依次為100%、100%、0和40%；攻擊CK/NX/S4590/2020分離株后，不同免疫組的保護(hù)率均不高于10%。詳情見(jiàn)表2。

2.6 疫苗免疫雞血清平均抗體效價(jià)與攻毒保護(hù)效果之間的關(guān)系

綜合HI抗體、中和抗體及攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同疫苗免疫后，誘導(dǎo)的針對(duì)H9亞型分離株的抗體因毒株而異，當(dāng)抗體滴度越高時(shí)則免疫雞獲得的保護(hù)率越高。A疫苗免疫雞血清針對(duì)CK/XJ/ S1204/ 2015和CK/YN/S1666/2020分離株的免疫雞的HI抗體平均效價(jià)分別為9.3 log2和8 log2，NT抗體平均效價(jià)分別為8.9 log2和10.9 log2，HI抗體前者大于后者，然而NT抗體后者大于前者，此時(shí)A疫苗為攻擊CK/YN/ S1666/2020毒株的免疫雞提供100%保護(hù)。B疫苗誘導(dǎo)的針對(duì)近期H9N2分離株的HI抗體和NT抗體平均效價(jià)分別在8.6 log2—10.8 log2、8.4 log2—12.2 log2之間，當(dāng)HI抗體平均效價(jià)＞9.8 log2，NT抗體平均效價(jià)＞10 log2時(shí)，能給免疫雞提供80%以上保護(hù)；C疫苗誘導(dǎo)的HI抗體和NT抗體平均效價(jià)分別在4.7 log2—9.5 log2、7 log2—10 log2之間，當(dāng)HI抗體平均效價(jià)＞9.5 log2，NT抗體平均效價(jià)＞10 log2時(shí)，能為免疫雞提供80%以上保護(hù)。D疫苗誘導(dǎo)的HI抗體和NT抗體平均效價(jià)分別在6.8 log2—10.8 log2、8.4 log2—10.9 log2之間，當(dāng)HI抗體平均效價(jià)>10 log2，NT抗體平均效價(jià)＞10 log2時(shí)，能為免疫雞提供80%以上保護(hù)?？傮w而言，使用本研究中的4株分離株攻毒后，4種商品疫苗誘導(dǎo)的HI抗體平均效價(jià)＞10 log2，NT抗體平均效價(jià)＞10 log2時(shí)，則能給SPF免疫雞提供較好的保護(hù)（表3）。

表2 不同疫苗免疫后的排毒檢測(cè)

2.7 H9N2亞型代表毒株抗原性分析

抗原性分析結(jié)果顯示，H9N2早期分離毒株CK/SH/10/01抗血清與4株H9N2亞型代表毒株，有較大HI抗體差異，與2017年和2020年的毒株最高有32倍和16倍差異。CK/XJ/S1204/2015抗血清與4株H9N2病毒HI抗體差異較小，在4倍以內(nèi)。而DK/JX/S4512/ 2017抗血清與CK/XJ/S1204/2015毒株的HI抗體差異最大有64倍。CK/YN/S1666/2020抗血清與CK/XJ/S1204/ 2015毒株的HI抗體差異為32倍。CK/NX/S4590/2020抗血清與CK/XJ/S1204/2015毒株的HI抗體為16倍（表4）。結(jié)果表明，早期毒株與近期H9N2分離株有較大抗原變異，疫苗株應(yīng)根據(jù)抗原性變化進(jìn)行更新。

表3 商品化H9亞型AI疫苗免疫攻毒保護(hù)效果與平均抗體滴度間的關(guān)系

表4 4株H9N2亞型AIV與不同血清的交叉血凝抑制反應(yīng)

3 討論

3.1 商品化疫苗對(duì)我國(guó)H9N2亞型分離株的免疫保護(hù)效果呈下降趨勢(shì)

H9N2亞型AIV不斷進(jìn)化，形成多個(gè)進(jìn)化分支，并頻繁發(fā)生抗原變異，引起疫苗的免疫保護(hù)效果下降[20-21]。H9N2病毒一般分為兩大譜系分別是北美譜系和歐亞譜系[22]，基于分離株HA與經(jīng)典毒株間的進(jìn)化關(guān)系，可劃分為h9.1—h9.4四個(gè)進(jìn)化分支，h9.4包括h9.4.1和h9.4.2兩個(gè)亞分支[23]，2007年之前的H9N2亞型AIV一般屬于分支h9.4.2.1—h9.4.2.4[24]，此后，以A/chicken/Guangxi/55/2005（H9N2）為代表的h9.4.2.5分支逐漸成為主流[23, 25]。Sun等研究表明H9禽流感商品疫苗對(duì)早期H9毒株（1999年）攻擊可以完全阻止排毒，提供良好免疫保護(hù)作用，但對(duì)2007年分離株攻擊不能完全阻止排毒[20]。本研究選用4種商品疫苗攻擊h9.4.2.5分支分離毒株后，A—D疫苗中有3種疫苗對(duì)2015年分離株攻擊可以提供80%以上的保護(hù)作用，但對(duì)2017年分離株和1株2020年分離株攻擊后分別只有B疫苗和A、B疫苗提供80%以上免疫保護(hù)，攻擊另一株2020年分離株后，疫苗的保護(hù)率則均低于80%，表明當(dāng)前商品疫苗對(duì)近期不同時(shí)間H9分離株的免疫保護(hù)效果呈明顯下降趨勢(shì)。由于本研究沒(méi)能收集到商品疫苗的配套檢測(cè)抗原，因此沒(méi)有通過(guò)比較針對(duì)疫苗株抗原和針對(duì)攻毒毒株抗體進(jìn)行抗原性比較，但發(fā)現(xiàn)所有疫苗免疫雞血清中針對(duì)H9標(biāo)準(zhǔn)抗原（2001年分離株）的HI抗體水平較高，而與2015—2020年分離株抗原的HI抗體水平則參差不齊，充分表明4種疫苗株呈現(xiàn)與早期H9毒株良好的抗原匹配性，而與近期分離株之間存在不同程度的抗原性差異，可能是造成市售商品疫苗對(duì)我國(guó)近期H9N2病毒的免疫保護(hù)下降的主要原因。

3.2 針對(duì)H9亞型分離株的HI抗體和中和抗體測(cè)定結(jié)果可作為H9亞型AI滅活疫苗的評(píng)價(jià)和選用依據(jù)

疫苗接種是預(yù)防傳染病的重要舉措，評(píng)估疫苗免疫保護(hù)效果最佳的方式是進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)。根據(jù)獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編規(guī)定，H9亞型AI滅活疫苗效力檢驗(yàn)的攻毒途徑有兩種，一是鼻腔感染，二是靜脈注射[26-27]。本文模擬自然感染方式以鼻腔感染途徑攻毒，客觀評(píng)價(jià)疫苗的免疫保護(hù)效果。本研究4株攻毒毒株的EID50均在10-8.5/0.1 mL和10-8.94/0.1 mL之間，差異較小，最大差異為2.7倍，但其對(duì)應(yīng)CID50差異較大，最大差異為27倍。攻毒劑量的選擇會(huì)一定程度上影響攻毒保護(hù)試驗(yàn)的最終結(jié)果。EID50可以作為攻毒劑量的參考依據(jù)，106EID50/0.1 mL為常用的攻毒劑量，但研究表明，在H9N2亞型免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)中，CID50數(shù)據(jù)更為可靠，且以10 CID50為H9亞型AI疫苗評(píng)估的最佳攻毒劑量[28]。但采用攻毒試驗(yàn)評(píng)估疫苗免疫效果的方法耗時(shí)長(zhǎng)，結(jié)果反饋慢，在實(shí)際應(yīng)用中有一定局限性。因此，建立血清學(xué)評(píng)價(jià)方法對(duì)于快速評(píng)估疫苗免疫效果具有重要意義。HI抗體檢測(cè)常用于疫苗接種后效果的監(jiān)測(cè)。我國(guó)H5、H7亞型AI疫苗的HI抗體質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為免疫后3周不低于6 log2，免疫抗體監(jiān)測(cè)的合格抗體滴度為4 log2，針對(duì)H9亞型AI疫苗具有相似的HI抗體合格標(biāo)準(zhǔn)。但本研究中，4種疫苗免疫后H9亞型HI抗體超過(guò)6 log2，但攻毒后不能獲得80%以上的免疫保護(hù)數(shù)據(jù)，這可能與采用鼻腔感染而不是靜脈注射的攻毒方式有關(guān)。另外，HI試驗(yàn)不能完全準(zhǔn)確檢測(cè)出血清中對(duì)病毒具有中和作用的抗體，需要采用中和試驗(yàn)的方法檢測(cè)中和抗體[29]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)合HI抗體和中和抗體水平可預(yù)測(cè)疫苗的免疫保護(hù)率。尤其是檢測(cè)針對(duì)現(xiàn)地分離株的HI抗體和中和抗體可以作為疫苗選用的重要參考依據(jù)。就現(xiàn)有疫苗的臨床應(yīng)用而言，由于各商品疫苗毒種的抗原性不同，對(duì)于不能進(jìn)行檢測(cè)的研制者，可以選用不同廠家和毒種來(lái)源的疫苗交替免疫，可有望提高免疫保護(hù)的廣譜性。同時(shí)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、做好生物安全措施，有利于提高H9亞型禽流感免疫防控成效。

4 結(jié)論

4種商品化疫苗對(duì)我國(guó)近期的H9N2亞型流行毒株的免疫保護(hù)效果有較大差異，整體免疫保護(hù)效果下降。疫苗的免疫保護(hù)效果與免疫后測(cè)定的HI抗體平均效價(jià)總體呈正相關(guān)趨勢(shì)，但不同時(shí)期、不同地域分離的H9N2亞型AIV抗原性存在不同差異，以現(xiàn)地分離毒株為檢測(cè)抗原，檢測(cè)的HI抗體和中和抗體效價(jià)能夠更科學(xué)反映疫苗的保護(hù)效果。本研究為我國(guó)商品化H9疫苗的科學(xué)選用提供重要參考。

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The Protective Efficacy of Commercial Vaccines Against H9N2 Avian Influenza Virus of Branch h9.4.2.5 Isolated in China

MA Qi1, HE XinWen1, WANG Yan1, LIU YanJing1, PAN ShuXin1, HOU YuJie1, SHI JianZhong1,3, DENG GuoHua1,3,BAO HongMei1,3, LIU JingLi2, GUO XingFu2, MAO ShengGang2, HU JingLei2, LU Tong2, YANG Fan2, TIAN GuoBin1,3, ZENG XianYing1,3, CHEN HuaLan1,3

1National Poultry Laboratory Animal Resource Center/State Key Lab for Animal Disease Control and Prevention/Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150069;2Harbin Weike Biotechnology Company Limited, Harbin 150069;3Key Laboratory for Prevention and Control of Avian Influenza and Other Major Poultry Diseases, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Harbin 150069

【Objective】There are many commercial inactivated vaccines against the H9 subtype avian influenza approved for use in China, and their protection efficacy and selection have been widely concerned by farmers. In this study, the protection efficacy of main commercial vaccines against H9N2 viruses recently isolated in the field were evaluated, so as to provide the research reference for guiding the prevention and control of H9 subtype AI by immunization in China.【Method】According to the vaccine batch release of the National Veterinary Drug Basic Information Database in China, 4 commercial vaccines (labeled as A-D) with large batches were selected from 40 kinds of sold H9 commercial vaccines. The four H9N2 subtype AIV, including CK/XJ/S1204/2015, DK/JX/S4512/2017, CK/YN/S1666/2020 and CK/NX/S4590/2020, belonging to h9.4.2.5 branch and isolated at different times and places, were used to evaluate the protection efficacy of selected commercial H9 subtype AI vaccines. The 50% chicken embryo infection (EID50), 50% chicken infection (CID50), and 50% cell infection (TCID50) of the four viruses were tested to determine the challenge dose of the animal experiment and the infection dose of the cell test. 40 3-week-old SPF chickens were injected intramuscularly with 4 kinds of inactivated vaccine, and the groups of 10 similar SPF chickens were inoculated with PBS as control group. 3 weeks post vaccination (p.v.), the serum of all experimental chickens were collected before challenge, the hemagglutination inhibition (HI) and neutralization (NT) antibody titers were detected by HI test and neutralization test; the 40 immunized chickens of each vaccine were randomly divided into four groups, and 10 chickens of each vaccine and 10 control chickens were infected intranasally with the 10 CID50of each H9N2 virus. Oropharyngeal and cloacal swabs were collected on days 3 and 5 post challenge (p.c.) for virus shedding detection and calculation of the protective rate of each vaccine.【Result】The CID50of the four strains were 103.5EID50/0.1 mL, 102.5EID50/0.1 mL, 102.5EID50/0.1 mL and 103.5EID50/0.1 mL, respectively. At three weeks p.v., the mean HI antibodies titers against the commercial H9 subtype HI test antigen (CK/SH/10/2001) in 4 groups of vaccinated chickens ranged from 9.4 log2to 11 log2, while the mean HI antibodies titers against challenge virus in 4 groups of vaccinated chickens ranged from 4.6 log2to 10.8 log2, and the significant differences of HI antibodies titers were observed among different vaccine groups, for the maximum difference of mean HI antibodies titers were 64-fold among them. The mean NT antibodies titers against challenge virus in 4 groups of vaccinated chickens ranged from 6.7 log2to 12.2 log2, while the maximum difference of mean HI antibodies titers were 32-fold among them, and the HI antibody and NT antibody of the control group were negative. After intranasal infection with different H9 viruses, the immune effects of the four vaccines were quite different. In CK/XJ/S1204/2015 challenged groups, 3 vaccines (B-D) could provide more than 80% protection. In DK/JX/S4512/2017 challenged groups, 1 vaccine (B) could provide more than 80% protection. In CK/YN/S1666/2020 challenged groups, 2 vaccines (A and B) could provide more than 80% protection. In CK/NX/S4590/2020 challenged groups, the protection efficacy of the four vaccines (A-D) were all less than 80%. In the same period, the virus shedding rate of chickens under the control group was more than 8/10. 【Conclusion】There was a great difference in the immune protection efficacy of the four kinds of commercial vaccines after challenge with recently isolated H9 strains, and the difference of antigenicity between vaccine antigens and isolates was the main reason for the decrease of immune protection efficacy of the commercial vaccines. The titers of HI antibody and NT antibody against H9N2 prevalent strains could be as important data for evaluation of the commercial H9N2 AI vaccines. This study provided the scientific references for selection and usage of the commercial vaccines against H9N2 AI.

H9N2 subtype; AIV; commercial vaccine; protective efficacy; avian influenza

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.15.017

2022-07-04；

2022-09-15

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1800200）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-41）

麻琦，Tel：0451-51051678；E-mail：13592583529@163.com。通信作者陳化蘭，Tel：0451-51997168；E-mail：chenhualan@caas.cn。通信作者曾顯營(yíng)，Tel：0451-51051678；E-mail：zengxianying@caas.cn

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