免疫沉淀聯(lián)合LC-MS/MS篩選豬肝星狀細(xì)胞中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP94的互作蛋白

王梟鴻，邢明杰，顧憲紅，郝月

免疫沉淀聯(lián)合LC-MS/MS篩選豬肝星狀細(xì)胞中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP94的互作蛋白

王梟鴻，邢明杰，顧憲紅，郝月

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所/畜禽營(yíng)養(yǎng)與飼養(yǎng)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193

【背景】隨著規(guī)模化、集約化生產(chǎn)程度的不斷提高，養(yǎng)殖過(guò)程中飼養(yǎng)空間受限、冷熱環(huán)境不適等因素常使豬處于應(yīng)激狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress, ERS）可能是最早期的應(yīng)激反應(yīng)，與細(xì)胞凋亡、代謝等方面有密切聯(lián)系。肝臟是機(jī)體的主要代謝器官，豬養(yǎng)殖過(guò)程中由于人工操作（如斷奶）、飼料霉變、溫度變化和吸入有害氣體等因素都會(huì)造成豬肝臟的ERS，不僅會(huì)造成肝臟損傷，還會(huì)引發(fā)肝臟的脂肪代謝紊亂和廣泛的炎癥反應(yīng)，影響生產(chǎn)性能和繁殖性能。因此，深入探討緩解ERS的有效措施，有助于減少豬養(yǎng)殖過(guò)程中的隱性損失?！灸康摹坷妹庖叱恋砺?lián)合質(zhì)譜技術(shù)，從豬肝星狀細(xì)胞中篩選在ERS條件下與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（GRP94）相互作用的細(xì)胞蛋白，為進(jìn)一步探討GRP94對(duì)豬肝星狀細(xì)胞生物學(xué)功能的保護(hù)作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā渴紫葘RP94抗體固定在谷胱甘肽親和磁珠上，用親和磁珠與ERS條件下或正常條件下豬肝星狀細(xì)胞總蛋白進(jìn)行孵育，與GRP94誘餌蛋白結(jié)合的蛋白復(fù)合物洗脫收集后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳驗(yàn)證。將驗(yàn)證成功的樣品洗脫液進(jìn)行液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測(cè)，鑒定出正常條件和ERS條件下GRP94的互作蛋白。運(yùn)用生物信息學(xué)在線軟件對(duì)篩選的互作細(xì)胞蛋白進(jìn)行 GO 富集、KEGG 信號(hào)通路注釋和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，并對(duì)其中的互作蛋白之一波形蛋白（vimentin）進(jìn)行免疫共沉淀驗(yàn)證。【結(jié)果】篩選到正常條件下與GRP94存在互作關(guān)系的蛋白146個(gè)，ERS條件下與GRP94存在互作關(guān)系的蛋白76個(gè)，在兩種情況下都存在互作關(guān)系的蛋白44個(gè)。ERS條件下有互作關(guān)系的76個(gè)蛋白質(zhì)主要參與凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控、肽段交聯(lián)、泛素依賴型ERAD（endoplasmic reticulum associated degradation）過(guò)程和過(guò)氧化氫分解代謝等過(guò)程。其中參與凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控的GRP94互作蛋白有albumin、catalase、filament A、heat shock protein family A member 5、keratin 18和prohibin 2，說(shuō)明GRP94可能與這些蛋白共同發(fā)揮抗凋亡作用。除此之外組成中間絲纖維的vimentin蛋白參與多個(gè)GO富集的通路，可能與GRP94有重要的互作關(guān)系。進(jìn)一步的免疫共沉淀試驗(yàn)也證實(shí)，ERS條件下vimentin和GRP94之間確實(shí)存在互作關(guān)系。此外，某些ERS條件下特異性表達(dá)的GRP94互作蛋白（如peroxiredoxin、death inducer obliterator 1、catalase、glandular kallikrein、pyruvate kinase等）與抗凋亡有密切聯(lián)系?！窘Y(jié)論】ERS條件下，豬肝臟GRP94互作蛋白主要參與抗凋亡、對(duì)未折疊蛋白進(jìn)行折疊和維護(hù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)相關(guān)的信號(hào)通路。該結(jié)論為下一步開展GRP94參與肝臟ERS調(diào)控機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)。

ERS；肝細(xì)胞；GRP94；互作蛋白；豬

0 引言

【研究意義】畜禽生產(chǎn)中，規(guī)?；?、集約化程度越來(lái)越高，飼養(yǎng)空間受限[1]、冷熱環(huán)境不適[2]、飼料結(jié)構(gòu)[3]、生產(chǎn)操作[4]等常常會(huì)導(dǎo)致畜禽產(chǎn)生應(yīng)激，影響其健康狀態(tài)和生產(chǎn)性能，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的隱性損失。廣泛存在的應(yīng)激反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激，影響細(xì)胞存活。當(dāng)機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)大量的未折疊蛋白和錯(cuò)誤折疊蛋白，引發(fā)細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress, ERS）。有研究指出，ERS可能是細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下最早期的反應(yīng)[5]。在ERS下未折疊蛋白反應(yīng)（unfold protein response, UPR）由3種經(jīng)典途徑激活，包括肌醇需要酶1、激活轉(zhuǎn)錄因子6、和蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白等保護(hù)分子表達(dá)，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷和未折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白的數(shù)量，以保護(hù)細(xì)胞，對(duì)抗應(yīng)激[6-7]。溫度變化[8]、斷奶應(yīng)激[9]、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏或過(guò)剩[10]、飼料污染[11]和細(xì)菌感染[12]等都被證實(shí)會(huì)引發(fā)家畜的ERS反應(yīng)。目前ERS在腸道上的研究相對(duì)較多，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ERS會(huì)引發(fā)動(dòng)物腸道的屏障和黏膜受損，造成腹瀉和細(xì)胞的凋亡，不僅影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，還與腸道炎癥關(guān)系密切[13]。而肝臟作為動(dòng)物體內(nèi)最大的代謝器官，含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，與糖脂代謝聯(lián)系密切，因此，近年來(lái)對(duì)于肝臟ERS的研究也逐漸增多。生產(chǎn)過(guò)程（如仔豬的斷奶應(yīng)激）會(huì)引發(fā)肝臟的ERS反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟重量顯著下降，肝臟中總膽固醇和總甘油三酯含量上升，進(jìn)而引起肝臟的脂肪變性。飼料中過(guò)多微量物質(zhì)的攝入也會(huì)導(dǎo)致豬肝臟的ERS，造成肝臟的炎癥反應(yīng)、成脂基因的上調(diào)，甚至促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。養(yǎng)殖環(huán)境中常見(jiàn)的硫化氫氣體也被證明能誘發(fā)豬肝臟的ERS，伴隨著肝臟的脂代謝紊亂。營(yíng)養(yǎng)上以高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝豬模型中也發(fā)現(xiàn)，肝臟上出現(xiàn)ERS和膠原堆積[15]。筆者團(tuán)隊(duì)前期利用衣霉素（Tunicamycin，TM）在仔豬上建立ERS模型，發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)ERS的同時(shí)還伴隨脂肪變性、黃疸和炎癥等病理現(xiàn)象，仔豬表現(xiàn)為采食量明顯下降、肝損傷嚴(yán)重和脂代謝紊亂[16]。因此，明確ERS對(duì)豬肝臟的負(fù)面影響，為生產(chǎn)上制定切實(shí)有效的ERS調(diào)控策略提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞上用在熱休克蛋白90（heat shock protein 90, HSP90）抑制劑抑制HSP90表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力受到抑制，細(xì)胞凋亡上升。并且在TM誘導(dǎo)的ERS下，細(xì)胞凋亡上升程度更為顯著[17]，說(shuō)明HSP90在ERS下對(duì)細(xì)胞的存活十分重要。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94（glucose regulated protein 94, GRP94）又稱HSP90B1（heat shock protein 90 B1），是HSP90家族的分子伴侶。作為已知的ERS標(biāo)志蛋白之一，GRP94參與蛋白的折疊和加工，在應(yīng)激狀態(tài)下維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定[18]，保護(hù)細(xì)胞[19-20]。GRP94可通過(guò)與多種蛋白互作，發(fā)揮其蛋白質(zhì)量控制和應(yīng)激響應(yīng)的功能。如敲除小鼠肌肉中GRP94，發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)輕微ERS的同時(shí)，肌肉中胰島樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）的基因表達(dá)水平降低，骨骼肌重量明顯下降[21]，表明肌肉是主要依靠GRP94來(lái)產(chǎn)生IGF-1?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】蛋白質(zhì)通常作為復(fù)合體的一部分發(fā)揮功能，復(fù)合體又是由幾個(gè)或幾種蛋白組成在一起，因此了解哪些蛋白質(zhì)相互作用對(duì)于探究蛋白質(zhì)生物功能是重要的一步[22]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)成為蛋白質(zhì)相互作用研究的首選，廣泛應(yīng)用于互作蛋白的篩選[23-25]。它使人們能夠在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出低豐度蛋白質(zhì)，并從單個(gè)樣品中高通量鑒定數(shù)百種蛋白質(zhì)。筆者所在團(tuán)隊(duì)在前期利用衣霉素建立豬肝星狀細(xì)胞ERS模型[26]的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)ERS下敲低豬肝星狀細(xì)胞中GRP94的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和UPR通路蛋白磷酸化的改變。進(jìn)一步的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)表明，ERS下GRP94和IGF-1、PDIA3（protein disulfide-isomerase a3）等蛋白間存在互作[27]。但目前尚不清楚GRP94與其互作蛋白如何作用來(lái)實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能，有必要開展相關(guān)試驗(yàn)進(jìn)一步探索GRP94在ERS發(fā)揮生物學(xué)功能的分子機(jī)理?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】基于GRP94可能在ERS條件下發(fā)揮對(duì)豬肝臟的保護(hù)作用，利用LC-MS質(zhì)譜聯(lián)合免疫沉淀技術(shù)，從豬肝星狀細(xì)胞蛋白中篩選與GRP94相互作用的蛋白并進(jìn)行功能分析，以期為深入研究GRP94參與肝臟ERS調(diào)控機(jī)制的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)進(jìn)行時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2020年7—12月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所畜禽營(yíng)養(yǎng)與飼養(yǎng)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 材料與試劑

IP蛋白抽提試劑（天德瑞 WB0024），BCA蛋白定量試劑盒（天德瑞 WB0028），2 mg·mL-1BSA標(biāo)準(zhǔn)品（天德瑞 WB0030），2×還原樣品緩沖液（天德瑞 WB0031），10×Tris-Glycine-SDS電泳緩沖液（天德瑞 WB0035），10×TBST pH8.0（天德瑞 WB0043），濕轉(zhuǎn)緩沖液（天德瑞 WB0039），NC膜，0.45 μm孔徑（Millipore HATF00010），麗春紅染色液（天德瑞 WB0042），BSA（Amresco 0332），PMSF（Amresco 0754），Acrylamide（Amresco 0341），Bis-Acrylamide（Amresco 0172），APS（Amresco 0486），Tween-20（Amresco 0777），TEMED（Amresco 0761），Ponceau S（Amresco 0860），Bromphenol Blue（Amresco 0449），DTT（Amresco 0281），NP-40（Amresco M158），Trizma base（Sigma T1503），Glycine（Sigma G8898），SDS（Sigma L4390），Sodium deoxycholate（Sigma D6750），蛋白酶抑制劑（Roche 11697498001），脫脂奶粉（伊利 Q/NYLB 0039S），ECL（Millipore WBKLS0500），甲醇（國(guó)藥10014118），璜基水楊酸（國(guó)藥10021516），TCA（國(guó)藥80132618），氯化鈉（國(guó)藥10019392），山羊抗大鼠IgG（H+L），HRP（天德瑞S007）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Fresco低溫冷凍離心機(jī)（Thermo FRESCO21），MultiSkan3酶標(biāo)儀（Thermo MULTISKAN MK3），Mini P-4電泳槽（Cavoy MP8001），濕轉(zhuǎn)電泳槽（Cavoy MP3035），電泳儀（Bio-Rad 1645052），水平脫色搖床（其林貝爾 TS-2），酸度計(jì)（Sartorius PB-10）。

1.4 永生化豬肝星狀細(xì)胞

細(xì)胞來(lái)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所畜禽營(yíng)養(yǎng)與飼養(yǎng)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自備的永生化豬肝星狀細(xì)胞系（專利號(hào)：CN201910084613.0）。

1.5 細(xì)胞蛋白抽提

用含10%胎牛血清、1%雙抗和1%生長(zhǎng)因子的ICELL星狀細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于含5%CO2完全飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)永生化豬肝星狀細(xì)胞。預(yù)冷IP-RIPA蛋白抽提試劑，加入蛋白酶抑制劑。在蛋白抽提開始前加入0.1 mol·L-1PMSF母液，PMSF終濃度1 mmol·L-1。按細(xì)胞量加入一定比例的裂解液，用槍頭吹打充分懸起細(xì)胞，完成后在冰上孵育20 min，4℃離心，13 000 r/min，20 min。離心后取上清液，分裝保存，待測(cè)。收集加入5 μg·mL-1的TM處理24 h后的細(xì)胞抽提蛋白作為ERS組（參數(shù)參照中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所畜禽營(yíng)養(yǎng)與飼養(yǎng)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期研究[26]），收集未加入TM的細(xì)胞抽提蛋白作為對(duì)照組。

1.6 BCA法蛋白定量

準(zhǔn)備BCA工作液 A液﹕B液=50﹕1，稀釋好各個(gè)提取BSA標(biāo)準(zhǔn)品。樣品用PBS進(jìn)行10倍稀釋后定量。

樣品﹕BCA工作液=1﹕8，混勻后37℃孵育30 min，酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)濾光片讀取OD值。

1.7 IP樣品制備

從1.3步驟中提取的兩組蛋白液中分別取兩份500 μL蛋白液，用BCA法測(cè)定溶液濃度。用PBS稀釋至1 μg·μL-1左右，每一組蛋白液一份加GRP94抗體5 μL，一份設(shè)置為陰性對(duì)照空白IgG，4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻12 h，再各加入60 μL ProteinA/G懸液，4 ℃搖床孵育3 h。在4 ℃以2 500 r/min離心5 min，棄去上清液，收集磁珠沉淀；用預(yù)冷IP裂解液洗滌G-Agarose-抗體-蛋白復(fù)合物，3次，4 ℃離心，1 500×，3 min，收集沉淀。加入60 μL 2×還原loading，變性10 min，離心，收集上清液。

1.8 目的蛋白免疫印跡試驗(yàn)

取WB樣本10 μg/孔，IP樣品和對(duì)照樣本8 μL/孔進(jìn)行10% SDS-PAGE分析，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)印到0.45 μm孔徑NC膜上。將膜完全浸沒(méi)3% BSA- TBST中室溫封閉30 min；4 ℃過(guò)夜孵育GRP94抗體（1﹕50 000稀釋），TBST洗膜5次；再用HRP-羊抗鼠二抗（1﹕10 000稀釋）在 37 ℃孵育40 min，TBST洗膜6次，最后滴加顯影劑曝光并分析結(jié)果。

1.9 質(zhì)譜與生物信息學(xué)分析

分別切取對(duì)照組和ERS組IP樣品短膠中與GRP94特異性結(jié)合的蛋白條帶，送北京博奧麥斯科技有限公司進(jìn)行分析。酶解蛋白條帶后，利用液相-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/ MS）進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)MaxQuant（version 2.0.1.0）檢索。檢索參數(shù)為：豬蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，胰蛋白酶酶切，最多2個(gè)漏切位點(diǎn)，母離子的質(zhì)量誤差為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量的2×10-5倍，碎片離子質(zhì)量誤差0.02 Da，固定修飾為Carbamidomethyl（C），可變修飾為Oxidation（M），Acetyl（N-terminal）。多肽和蛋白假發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜1.0%，每個(gè)蛋白至少鑒定到1個(gè)特異性多肽。使用數(shù)據(jù)庫(kù)為：uniprot_SUS_49792_20220114.fasta。

1.10 波形蛋白（vimentin）和GRP94的互作驗(yàn)證

取ERS條件下WB樣本10 μg/孔，IP樣品和對(duì)照樣本8 μL/孔，進(jìn)行10% SDS-PAGE分析，用濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)印到0.45 μm孔徑NC膜上。將膜完全浸沒(méi)3% BSA-TBST中室溫封閉30 min；4 ℃過(guò)夜孵育vimentin抗體（1﹕2 000稀釋），TBST洗膜5次；再用HRP-羊抗鼠二抗（1﹕5 000稀釋）在 37 ℃孵育40 min，TBST洗膜6次；滴加顯影劑曝光，分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 豬肝星狀細(xì)胞中GRP94互作蛋白的富集與質(zhì)譜鑒定

試驗(yàn)采用免疫沉淀法獲得同GRP94具有相互作用的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，正常情況下和ERS條件下，input組和IP樣本組在大約94 kDa處都存在明顯的條帶，說(shuō)明免疫沉淀GRP94成功（圖1）。切取對(duì)照組和ERS組IP樣品短膠中與GRP94特異性結(jié)合的條帶，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。去除空白對(duì)照組中出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)合蛋白后，得到互作蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常條件下與GRP94有互作的蛋白146個(gè)，ERS條件下與GRP94有互作的蛋白76個(gè)，兩種情況下都存在互作的蛋白44個(gè)（圖2）。而與GRP94在ERS條件下特異性結(jié)合的互作蛋白有32個(gè)，其中包括PRDX1（peroxiredoxin-1）、PRDX2（peroxiredoxin-2）、DIDO1（Death inducer obliterator 1）和CAT（catalase）等重要的功能蛋白。

WB驗(yàn)證在正常和ERS條件下免疫沉淀GRP94的互作蛋白是否成功。Input：細(xì)胞裂解液；input+TM：經(jīng)TM處理的細(xì)胞裂解液；IP：抽提細(xì)胞蛋白后，經(jīng)定量和GRP94抗體孵化后制備的免疫沉淀樣本；IP+TM：抽提TM處理下的細(xì)胞蛋白后，經(jīng)定量和GRP94抗體孵化后制備的免疫沉淀樣本；空白IgG：免疫沉淀樣本加入對(duì)照小鼠抗體；空白IgG+TM：經(jīng)TM處理后制備的免疫沉淀樣本加入對(duì)照小鼠抗體

IP對(duì)應(yīng)藍(lán)圈，說(shuō)明在正常條件下有146個(gè)蛋白質(zhì)與GRP94存在互作關(guān)系；TM_IP對(duì)應(yīng)紅圈，說(shuō)明在ERS下有76個(gè)蛋白質(zhì)與GRP94存在互作關(guān)系；兩圈重疊的區(qū)域呈深紅色，說(shuō)明有44個(gè)蛋白質(zhì)在兩種條件下都與GRP94存在互作關(guān)系

2.2 ERS條件下GRP94互作蛋白組聚類分析

對(duì)ERS條件下與GRP94有互作關(guān)系的76個(gè)蛋白進(jìn)行GO分析，取差異顯著情況下分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)過(guò)程富集程度TOP10的通路作圖（圖3）。生物學(xué)過(guò)程分析顯示，GRP94互作蛋白主要參與凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控、肽段交聯(lián)和泛素依賴型ERAD（endoplasmic reticulum associated degradation）過(guò)程等。細(xì)胞組分分析顯示，互作蛋白主要富集在細(xì)胞質(zhì)、胞外的外泌體和中間絲纖維等組分中。分子功能分析顯示，互作蛋白主要參與結(jié)構(gòu)分子激活、未折疊蛋白結(jié)合和支架蛋白結(jié)合等功能。KEGG分析發(fā)現(xiàn)，GRP94互作蛋白主要參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白加工、沙門氏菌感染、抗體加工和呈遞、雌激素信號(hào)通路和脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化等通路（圖4）。說(shuō)明GRP94在ERS下通過(guò)加工內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白、免疫系統(tǒng)激活、脂質(zhì)調(diào)控和激素合成等途徑調(diào)控細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控指預(yù)防或阻止細(xì)胞凋亡頻率的生物學(xué)過(guò)程，富集在此通路的蛋白除GRP94外，還有ALB（albumin）、CAT、FLNA（filamin A）、HSPA5（heat shock protein family A member 5）、KRT18（keratin 18）和PHB2（prohibitin 2）6個(gè)蛋白質(zhì)，表明GRP94通過(guò)與這些蛋白的相互作用來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用。

進(jìn)一步對(duì)互作蛋白構(gòu)建蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖5），發(fā)現(xiàn)其中具有重要調(diào)控功能的蛋白分子包括PDIA3、ATP5A1（ATP synthase subunit 2）、ITGB1（intergrin β-1）、vimentin等，且vimentin在GO富集分析中參與了生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能的多條通路。尤其在細(xì)胞組分分析中，細(xì)胞質(zhì)、中間絲纖維和胞液都定位到了vimentin，說(shuō)明GRP94可能在多個(gè)位置都與vimentin發(fā)生相互作用，共同發(fā)揮生物學(xué)功能。

2.3 vimentin和GRP94的互作驗(yàn)證

將ERS條件下的IP樣品用免疫共沉淀進(jìn)行GRP94和vimentin的互作關(guān)系驗(yàn)證。共沉淀結(jié)果（圖6）顯示，IP樣品在大約54 kDa處出現(xiàn)目的條帶，說(shuō)明GRP94在ERS條件下與vimentin存在互作關(guān)系。

3 討論

在細(xì)胞上，應(yīng)激最早期的反應(yīng)就是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)出現(xiàn)大量未折疊和錯(cuò)誤折疊的蛋白，即出現(xiàn)ERS，導(dǎo)致胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的破壞，畜禽表現(xiàn)為生產(chǎn)性能、繁殖性能的下降和代謝紊亂。豬缺乏汗腺，皮下脂肪厚重，因而更易受到環(huán)境應(yīng)激的影響，飼料霉變、溫度變化和病菌感染等都會(huì)引發(fā)豬肝臟產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生ERS時(shí)，其會(huì)誘發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的GRP78、GRP94與PERK（protein kinase RNA-like ER kinase）、IRE1（inositol-requiring enzyme-1）和ATF6（activating transcription factor 6）解離，3種跨膜蛋白分別激活其下游通路來(lái)恢復(fù)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及機(jī)體功能。此外，除經(jīng)典的UPR通路外，ERS條件下獨(dú)立于UPR通路的其他分子，如糖原合成激酶（glycogen synthetase kinase 3β）也有緩解ERS的作用[28]。肝臟作為機(jī)體主要代謝器官，存在大量?jī)?nèi)質(zhì)網(wǎng)，適合作為ERS研究的試驗(yàn)材料。在分子功能研究中，常以豬肝臟的原代細(xì)胞作為細(xì)胞來(lái)源，但原代細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)條件要求苛刻，存在存活時(shí)間短、產(chǎn)量有限和傳代困難等問(wèn)題，因此亟需建立永生化的豬肝細(xì)胞系。筆者所在實(shí)驗(yàn)室克服了豬作為大動(dòng)物無(wú)法進(jìn)行灌流和養(yǎng)殖環(huán)境較差，難以分離出無(wú)菌肝臟組織的問(wèn)題，利用SV40LT過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染正常的豬肝星狀細(xì)胞，獲得了與原代豬肝星狀細(xì)胞形態(tài)和特性無(wú)明顯差別的永生化豬肝星狀細(xì)胞系（專利號(hào)：CN201910084613.0）。GRP94是HSP90家族的分子伴侶，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，是ERS的重要反應(yīng)因子。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)ERS時(shí)，誘發(fā)UPR反應(yīng)，啟動(dòng)ERS反應(yīng)元件，從而使GRP94在應(yīng)激條件下表達(dá)量顯著增強(qiáng)。作為UPR通路的上游分子，與細(xì)胞凋亡、脂代謝紊亂等ERS相關(guān)的表型存在明顯的相關(guān)。筆者前期研究也證明，ERS條件下GRP94對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用，但其具體與哪些蛋白共同發(fā)揮作用尚不清楚。本研究利用免疫沉淀方法獲得GRP94的互作蛋白，隨后采用質(zhì)譜分析鑒定出正常情況和ERS條件下與GRP94結(jié)合的蛋白。

圖中每一個(gè)圓點(diǎn)表示一個(gè) KEGG 通路，圓點(diǎn)的大小代表富集到該通路的蛋白數(shù)目，圓點(diǎn)的顏色代表 P value，P value 越小表示蛋白在該通路中的富集顯著性越可靠?？v軸表示 pathway 名稱，橫軸表示 -lg(P value)

3.1 GRP94互作蛋白的生物信息學(xué)分析

對(duì)ERS條件下與GRP94相互作用的蛋白質(zhì)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和生物信息學(xué)分析，GO富集顯示這些蛋白質(zhì)主要參與凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控、肽段交聯(lián)、泛素依賴型ERAD和過(guò)氧化氫分解代謝等過(guò)程，說(shuō)明GRP94在ERS下主要通過(guò)ERAD過(guò)程和抗氧化作用來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用。參與凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控這一生物學(xué)過(guò)程的GRP94互作蛋白有ALB、CAT、FLNA、HSPA5、KRT18和PHB2 6個(gè)蛋白質(zhì)。ALB是一種具有清除自由基活性的抗氧化劑，可以緩解細(xì)胞的氧化應(yīng)激和由此引起的細(xì)胞凋亡[29]。不過(guò)也有研究發(fā)現(xiàn)，如果胞內(nèi)存在過(guò)多的ALB也會(huì)引發(fā)細(xì)胞的ERS，進(jìn)而導(dǎo)致凋亡[30]。這可能是長(zhǎng)時(shí)間ERS導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。CAT可催化過(guò)氧化氫分解成氧和水的酶，存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體內(nèi)，參與酶抗氧化防御機(jī)制。敲除CAT的小鼠在體內(nèi)表現(xiàn)為氧化還原失衡，細(xì)胞代謝由于ERS反應(yīng)被干擾，非酒精性脂肪肝疾病加重等特點(diǎn)[31-32]。細(xì)胞中FLNA通過(guò)與肌動(dòng)蛋白交聯(lián)和調(diào)整細(xì)胞骨架與細(xì)胞膜的接觸，來(lái)維持細(xì)胞骨架[33]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)發(fā)生鈣離子失調(diào)引起ERS時(shí)，F(xiàn)LNA通過(guò)與UPR的重要傳感蛋白PERK互作來(lái)加強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和原生質(zhì)膜的接觸，從而恢復(fù)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)[34]。HSPA5基因可以編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)網(wǎng)腔內(nèi)的結(jié)合免疫球蛋白，進(jìn)而協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊和ERAD過(guò)程，并啟動(dòng)UPR來(lái)緩解ERS。角蛋白是中間絲纖維的主要成分，對(duì)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)起重要作用。如當(dāng)血管平滑肌受到機(jī)械損傷后，伴隨著有絲分裂刺激，KRT18會(huì)大量表達(dá)[35]。KRT18可以作為細(xì)胞凋亡的早期標(biāo)志物[36]，這也說(shuō)明GRP94可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用。PHB2是高度保守的支架蛋白，最近發(fā)現(xiàn)它是線粒體自噬的一種重要內(nèi)膜受體[37]，即可以通過(guò)選擇性地去除受損或不需要的線粒體，參與線粒體的質(zhì)量控制和維持胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)通過(guò)阻斷PHB2來(lái)抑制線粒體自噬時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)和產(chǎn)能都會(huì)被顯著抑制[38]，推測(cè)GRP94可通過(guò)影響線粒體的自噬來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡。細(xì)胞組分分析發(fā)現(xiàn)，GRP94互作蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外的外泌體和中間絲纖維上。vimentin，krt 18等都是中間絲纖維的重要組成成分，且vimentin還參與了蛋白質(zhì)翻譯的正向調(diào)節(jié)這一生物學(xué)過(guò)程和多個(gè)分子功能的實(shí)現(xiàn)，可見(jiàn)GRP94與vimentin之間存在重要的互作關(guān)系。

將蛋白ID與string數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白做比對(duì)，選擇互作 Confidence score 打分大于0.4的蛋白質(zhì)，獲得蛋白相互作用信息。使用 STRING 工具集成了功能交互網(wǎng)絡(luò)模型，圖中節(jié)點(diǎn)代表蛋白，兩節(jié)點(diǎn)之間的連線代表兩節(jié)點(diǎn)代表的蛋白之間存在互作關(guān)系，連線的粗細(xì)反映互作的強(qiáng)弱

3.2 免疫共沉淀驗(yàn)證vimentin和GRP94之間存在互作

vimentin 蛋白是 III 型中間絲纖維蛋白家族中表達(dá)最廣泛的蛋白之一，具有高度保守的α螺旋“桿狀”結(jié)構(gòu)域，由頭部、桿和尾結(jié)構(gòu)域組成，能穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)[39]。vimentin作為中間絲纖維的成分，主要負(fù)責(zé)細(xì)胞骨架的完整性。有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用硫酸鋅可以緩解由鄰苯二甲酸二丁酯引起的ERS和細(xì)胞凋亡，同時(shí)還可改善波形蛋白的降解，防止精母細(xì)胞從輸精管上皮脫落[40]。說(shuō)明vimentin不僅在維持細(xì)胞功能結(jié)構(gòu)方面有重要作用，而且受到ERS的調(diào)控。本試驗(yàn)的免疫共沉淀結(jié)果也證實(shí)vimentin與GRP94存在互作關(guān)系。

免疫共沉淀驗(yàn)證vimentin和GRP94的互作關(guān)系。Input：細(xì)胞裂解液；IP：抽提細(xì)胞蛋白后，經(jīng)定量和GRP94抗體孵化后制備的免疫沉淀樣本；空白IgG：免疫沉淀樣本加入對(duì)照小鼠抗體

3.3 ERS條件下與GRP94互作的功能蛋白

通過(guò)韋恩圖可知，僅在ERS條件下與GRP94存在互作關(guān)系的蛋白有32個(gè)，其中PRDX1、PRDX2、DIDO1、CAT、Glandular kallikrein和Pyruvate kinase等蛋白與機(jī)體緩解ERS的機(jī)制密切相關(guān)。PRDX1和2都是過(guò)氧化物酶，具有抗氧化功能，參與機(jī)體的氧化還原反應(yīng)過(guò)程。先前的研究中將敲除PRDX2的小鼠放在低氧環(huán)境，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子迅速大量增加，內(nèi)皮血管出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，并引發(fā)了肝臟的ERS。而在體內(nèi)融合重組PRDX2后，炎性血管病變和ERS反應(yīng)減輕，說(shuō)明該蛋白對(duì)低氧環(huán)境中的不良反應(yīng)具有重要的阻斷作用[41]。PRDX1具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的特性，TDAG51（T-cell death-associated gene 51）可被ERS誘導(dǎo)，其表達(dá)上升時(shí)會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在載脂蛋白E和TDAG51同時(shí)敲除的小鼠中發(fā)現(xiàn)，與單純敲除載脂蛋白E相比，氧化應(yīng)激和ERS條件下的細(xì)胞保護(hù)作用增強(qiáng)，PRDX1表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，動(dòng)脈粥樣硬化得到了緩解[42]。由于動(dòng)脈粥樣硬化本身就可被ERS引起的細(xì)胞凋亡所誘導(dǎo)，因此PRDX1很可能與GRP94一起在ERS條件下調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。glandular kallikrein在許多不利環(huán)境下（如乙醚麻醉、饑餓和口服鹽酸等）會(huì)出現(xiàn)釋放量的微弱增加，但在熱應(yīng)激誘導(dǎo)的唾液中釋放顯著增加，說(shuō)明該分子參與了機(jī)體對(duì)熱應(yīng)激的調(diào)節(jié)[43]。熱應(yīng)激可以引起ERS，因此該分子可能在ERS下發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。pyruvate kinase在合成丙酮酸過(guò)程中有催化作用，參與碳水化合物代謝，已被證明參與多種細(xì)胞凋亡過(guò)程。在敲除胰腺β細(xì)胞的pyruvate kinase后，由ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加[44]。DIDO1對(duì)細(xì)胞的早期凋亡有調(diào)節(jié)作用[45]，在敲除該基因后內(nèi)皮細(xì)胞的增殖受到顯著抑制[46]。這些蛋白也都與抵抗應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切，因此推測(cè)在機(jī)體處于ERS時(shí)，GRP94會(huì)特異性地與這些蛋白發(fā)生相互作用，以增強(qiáng)自身的防御能力，緩解ERS，防止細(xì)胞凋亡。

4 結(jié)論

利用豬肝星狀細(xì)胞，通過(guò)免疫沉淀聯(lián)合LC-MS/ MS技術(shù)，共篩選到正常條件下與GRP94存在互作關(guān)系的蛋白146個(gè)，ERS條件下與GRP94存在互作關(guān)系的蛋白76個(gè)，兩種情況下都存在互作關(guān)系的蛋白44個(gè)。ERS下與GRP94存在互作的蛋白主要參與抗凋亡、對(duì)未折疊蛋白進(jìn)行折疊和維護(hù)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等相關(guān)信號(hào)通路。該結(jié)論為下一步開展GRP94參與肝臟ERS調(diào)控機(jī)制的研究打下基礎(chǔ)。

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Screening of Anti-Apoptotic Protein GRP94 Interaction Proteins in Porcine Hepatic Stellate Cells by Immunoprecipitation Combined with LC-MS/MS

WANG XiaoHong, XING MingJie, GU XianHong, HAO Yue

Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Animal Nutrition and Feeding, Beijing 100193

【Background】 Extensive stress reactions often occur in pigs due to poor breeding environment, thick subcutaneous fat and lack of sweat glands in pigs. Endoplasmic reticulum (ER) stress (ERS) may be the earliest stress response, which is closely related to apoptosis and metabolism. Liver is the main metabolic organ of the body. In the process of pig breeding, the artificial operations, such as weaning, feed mildew, and inhalation of harmful gases and temperature changes, will cause ERS in pig liver, which will not only cause liver damage, but also cause liver fat metabolism disorder and extensive inflammatory reaction, affecting animal production performance and reproductive performance. The regulation of ERS in production is helpful to reduce the recessive loss in the pig breeding process. 【Objective】Immunoprecipitation combined with mass spectrometry was used to screen the cellular proteins interacting with glucose-regulated protein 94 (GRP94) in porcine hepatic stellate cells (HSC) under ERS condition, which could lay a foundation for further study on the protective mechanism of GRP94 on biological function of HSC. 【Method】Protein complexes bound to GRP94 bait protein were eluted, collected, and verified by SDS-PAGE gel electrophoresis. The successfully verified sample eluent was detected by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), and the interaction proteins of GRP94 under normal condition and ERS condition were identified. The detected proteins were analyzed by GO, KEGG and interaction network. Vimentin, one of the interacting proteins, was verified by co-immunoprecipitation. 【Result】In porcine hepatic stellate cells, 146 proteins were interacting with GRP94 under normal condition, 76 proteins under ERS condition, and 44 proteins under both conditions. The results showed that 76 proteins interacting with GRP94 under ERS were mainly involved in the negative regulation of apoptosis process, peptide cross-linking, ubiquitin-dependent ERAD (endoplasmic reticulum associated degradation) pathway and hydrogen peroxide catabolic process, among them, the specific proteins interacting with GRP94 in the negative regulation of apoptosis process were albumin, catalase, filament A, heat shock protein family A member 5, keratin 18, and prohibin 2, indicating that GRP94 might play an anti-apoptotic role with these proteins. Besides, the vimentin protein that made up the intermediate filament was involved in multiple GO enrichment terms, which might have an important interaction with GRP94, which was further confirmed by co-immunoprecipitation test, further demonstrating that there was indeed an interactive relationship between this two. Further analysis showed that some GRP94 interacting proteins (Such as peroxiredoxin, death inducer obliterator 1, catalase, glandular kallikrein, pyruvate kinase and so on) specifically expressed under ERS were closely related to anti-apoptosis. 【Conclusion】Under ERS, GRP94 interacting proteins were mainly involved in anti-apoptosis, folding of unfolded proteins and maintenance of intracellular homeostasis-related signal pathways. This conclusion laid a foundation for further study on the mechanism of GRP94 involved in liver ERS regulation.

endoplasmic reticulum stress; liver cells; GRP94; protein interactions; pig

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.15.015

2022-05-10；

2022-07-14

國(guó)家自然科學(xué)基金（31872404）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS07）

王梟鴻，E-mail：caaswangxiaohong@163.com。通信作者郝月，E-mail：haoyueemail@163.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）