轉(zhuǎn)錄因子NbERF RAP2-1在黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染中的功能

于連偉，姜興林，楊靈玲，王賀，張玉陽，謝莉娜，夏子豪，李洪連,3,4，楊雪,2，施艷

轉(zhuǎn)錄因子NbERF RAP2-1在黃瓜綠斑駁花葉病毒侵染中的功能

于連偉1，姜興林1，楊靈玲1，王賀1，張玉陽1，謝莉娜1，夏子豪5，李洪連1,3,4，楊雪1,2，施艷1

1河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，鄭州 450002；2河南農(nóng)業(yè)大學作物學博士后流動站，鄭州 450002；3河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002；4小麥玉米作物學國家重點實驗室，鄭州 450002；5沈陽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，沈陽 110866

【背景】黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是我國重要的檢疫性植物病毒，對蔬菜和瓜類產(chǎn)業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。ERF轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控植物生物和非生物脅迫，參與植物對多種病害的防御作用。前期研究顯示CGMMV侵染后可以顯著下調(diào)寄主轉(zhuǎn)錄因子NbERF RAP2-1的表達?！灸康摹棵鞔_ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員在CGMMV侵染過程中的作用，為CGMMV病害防治提供理論依據(jù)?！痉椒ā窟\用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，對基于NbERF RAP2-1蛋白的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化分析；構(gòu)建的熒光表達載體，并觀察其亞細胞定位；利用qRT-PCR技術(shù)分析在CGMMV侵染不同時期的表達量；通過煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）介導的基因沉默（VIGS）和瞬時過表達分析其在CGMMV侵染過程中的作用?！窘Y(jié)果】系統(tǒng)進化樹分析表明，NbERF RAP2-1與多種煙草的ERF轉(zhuǎn)錄因子同源性極高，與擬南芥的ERF轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系較遠；亞細胞定位結(jié)果顯示NbERF RAP2-1定位于細胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子行駛功能；CGMMV侵染對本氏煙內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄水平影響結(jié)果顯示，在CGMMV侵染6、9、12 d時的表達量無明顯變化，在CGMMV侵染15和18 d時表達量顯著下調(diào)；TRV介導的VIGS可以將植物內(nèi)源基因有效沉默，在沉默的植株系統(tǒng)葉上接種CGMMV，8 d對照植株系統(tǒng)葉出現(xiàn)斑駁、卷曲癥狀而沉默植株無癥狀，同時CGMMV RNA水平和蛋白水平檢測結(jié)果也表明TRV:可以有效抑制CGMMV的積累；同樣，分別在本氏煙葉片瞬時過表達NbERF RAP2-124、48和72 h時檢測CGMMV RNA水平和蛋白水平表達量，結(jié)果顯示在病毒侵染早期，即復制階段就抑制CGMMV的表達?！窘Y(jié)論】NbERF RAP2-1可以有效抑制CGMMV侵染初期病毒復制，即病毒RNA復制階段；隨著CGMMV不斷侵染，在CGMMV細胞間運動和系統(tǒng)運動時期，CGMMV識別防御相關(guān)基因并抑制該基因的轉(zhuǎn)錄；當缺失后可能抑制了下游蛋白的轉(zhuǎn)錄或表達，從而抑制病毒侵染后期的積累。由此可見，NbERF RAP2-1在CGMMV侵染過程中發(fā)揮了重要作用。

黃瓜綠斑駁花葉病毒；；致病機制

0 引言

【研究意義】在植物病毒與宿主長期互作過程中，兩者均形成各自的攻防體系。越來越多的研究表明，病毒利用植物中的組分來幫助自身侵染，而植物內(nèi)也進化出多種防御體系來抵抗病毒的入侵，兩者都在不斷進化從而有利于自身的生存。黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是我國重要的檢疫性病毒，主要危害黃瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等葫蘆科作物[1-2]。研究哪些寄主因子參與調(diào)控CGMMV的侵染，可為有效防控病毒病害提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】CGMMV侵染本氏煙（）后，葉片表面出現(xiàn)皺縮、斑駁和花葉等癥狀；黃瓜受害后，新生葉片表面出現(xiàn)黃色小斑點，后逐漸變成濃綠色突起，葉脈間褪色呈綠帶狀，果實黃化或變白并同時產(chǎn)生墨綠色水皰狀壞死斑[3]；侵染西瓜會出現(xiàn)不規(guī)則的褪色或淡黃色花葉、葉片凹凸不平、葉緣上卷、果實表面有濃綠原斑或不明顯的深綠色瘤皰、病果有彈性、肉質(zhì)纖維化、果梗有壞死條紋，嚴重時整株變黃直至死亡[4]。CGMMV自2005年首次傳入我國東北部，并在遼寧西瓜田流行傳播[5]。近年來在我國江蘇、廣東、北京、山東和湖南等?。ㄖ陛犑校┚褭z測到CGMMV[6-9]。CGMMV屬于煙草花葉病毒屬的正義單鏈RNA病毒[2]。其病毒粒體為桿狀，長300 nm，直徑18 nm，在形態(tài)上與煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）無明顯區(qū)別。CGMMV的基因組全長約為6.4 kb，可編碼4種蛋白，分別為129和186 kDa的復制相關(guān)蛋白、29 kDa的運動蛋白以及17 kDa的外殼蛋白[10]。CGMMV病毒粒子穩(wěn)定，常通過帶毒種子、花粉、受污染工具的機械損傷以及受污染的砧木嫁接等方式傳播給寄主植物，另外菟絲子等寄生植物也可造成CGMMV的傳播[11]。目前受限于研究的深度與廣度，防治藥劑開發(fā)較難，生產(chǎn)上仍然缺乏有效控制CGMMV的方法。前期研究發(fā)現(xiàn)乙烯響應因子NbERF RAP2-1（ethylene response factor related AP2-1）可以參與植物對CGMMV的調(diào)節(jié)作用[12]。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中特有的，分為AP2、RAV和ERF轉(zhuǎn)錄因子亞家族[13]。AP2家族蛋白包含兩個重復的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域；RAV家族蛋白包含一個B3結(jié)構(gòu)域；而ERF轉(zhuǎn)錄因子家族包含一個AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合活性[14]。ERF轉(zhuǎn)錄因子在許多生物和生理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，如植物形態(tài)發(fā)生、對各種脅迫的響應機制、激素信號轉(zhuǎn)導和代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)等[15]。值得注意的是，一些ERF轉(zhuǎn)錄因子可以參與多種病原物的侵染過程。有研究報道ERF轉(zhuǎn)錄因子有效抑制多種灰霉病侵染寄主，例如葡萄中VaERF16增強對灰霉病抗性[16]，擬南芥中ERF72增強植物對灰霉病菌的抗性[17]；番茄中ERF2增強植物對番茄白斑病的抗性[18]；水稻中OsBIERF3可以正調(diào)控水稻對真菌和細菌性病害的抗性[19]等。另外，有些ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員也可以幫助病原物侵染，例如水稻中OsERF922負調(diào)控水稻對稻瘟病的抗性[20]。ERF轉(zhuǎn)錄因子也可以參與調(diào)節(jié)病毒病害的侵染過程。在抗/感病性番茄品種中SiERF-B3轉(zhuǎn)錄因子通過與GCC盒結(jié)合能力的強弱來調(diào)節(jié)植物對番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curly virus，TYLCV）防御反應[21]。在煙草中異源表達大豆GmERF可以增強植物對青枯雷爾氏菌（）、鏈格孢菌（）和TMV侵染的抵抗力[22]?！颈狙芯壳腥朦c】通過RNA-Seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，CGMMV侵染后會特異性下調(diào)本氏煙內(nèi)源基因，該基因?qū)儆贓RF轉(zhuǎn)錄因子家族。NbERF RAP2-1蛋白在植物與病毒互作中的作用還未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對NbERF RAP2-1氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析、亞細胞定位、CGMMV侵染對內(nèi)源轉(zhuǎn)錄水平的影響以及沉默和過表達對CGMMV侵染作用的研究，明確NbERF RAP2-1轉(zhuǎn)錄因子在CGMMV侵染中的功能，為黃瓜綠斑駁花葉病毒病防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2022年5月至2023年4月在河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院完成。

1.1 材料

野生型本氏煙以及組蛋白H2B-RFP轉(zhuǎn)基因本氏煙在光周期為16 h光照/8 h黑暗，溫度為25 ℃的條件下生長。大腸桿菌DH5感受態(tài)購于擎科生物；GV3101感受態(tài)為本實驗室所保存菌液制作。CGMMV農(nóng)桿菌GV3101菌株保存于本實驗室-80 ℃超低溫冰箱。病毒誘導的基因沉默（virus induced genetic silencing，VIGS）系列載體TRV-RNA1和TRV-RNA2，亞細胞定位載體pEG103均由本實驗室保存。

1.2 NbERF RAP2-1同源進化樹的構(gòu)建

在NCBI網(wǎng)站查找不同植物中ERF的氨基酸序列與NbERF RAP2-1的氨基酸序列進行Blast比對，對同源性高的氨基酸序列采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）進行系統(tǒng)進化分析。利用MEGA 7.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 亞細胞定位

以為模板，使用引物GFP-F/GFP-R（表1），利用RT-PCR方法擴增，利用Gateway方法將連接到pEG103載體上，從而構(gòu)建-GFP熒光表達載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，挑選單菌落驗證正確后搖菌。將含有-GFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌用瞬時轉(zhuǎn)染緩沖液（10 mmol·L-1MgCl2，10 mmol·L-1MES，200 μmol·L-1乙酰丁香酮，pH 5.6）懸浮后OD600值定為0.5，靜置2 h后分別浸潤到7—8葉齡的H2B-RFP轉(zhuǎn)基因本氏煙葉片（5—6葉位）下表皮，接種48 h后使用共聚焦顯微鏡（Nikon eclipse Ti2）觀察本氏煙葉表皮細胞中GFP熒光，其激發(fā)波長為514 nm；RFP熒光，其激發(fā)波長為593 nm。

1.4 VIGS系統(tǒng)沉默

的系統(tǒng)沉默利用煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRV）介導的VIGS技術(shù)完成。以為模板，利用SGN VIGS Tool（http://vigs.solgenomics.net）在基因上預測一段300 bp的片段進行TRV介導的VIGS，并設計引物VIGS-F/VIGS-R（表1），通過PCR擴增出目的片段。利用Gateway方法將構(gòu)建到TRV-RNA2載體上。將構(gòu)建成功的TRV-RNA2-表達載體進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，利用菌液PCR驗證，單克隆搖菌。將TRV-RNA2-與TRV-RNA1農(nóng)桿菌用瞬時轉(zhuǎn)染緩沖液懸浮后OD600值分別定為1.0，靜置2 h后等量混勻，使用1 mL無菌注射器浸潤本氏煙，以TRV-RNA2和TRV-RNA1等量混勻作為空白對照，以TRV-RNA2-PDS和TRV-RNA1等量混勻作為指示作用。每處理20個重復。定期觀察煙草生長狀況。

1.5 病毒接種

將保存于-80 ℃含有CGMMV克隆載體的菌液活化后，在LB液體培養(yǎng)基（50 mg·L-1Rif、50 mg·L-1Kan）28 ℃，200 r/min培養(yǎng)過夜，然后將菌液6 000 r/min離心2 min，棄上清并將沉淀溶解于瞬時轉(zhuǎn)染液中，OD600定為1.0，靜置2 h，注射到長勢較好的本氏煙植株中，7—10 d系統(tǒng)葉發(fā)病。采集剛發(fā)病的系統(tǒng)葉葉片研磨并摩擦接種到本氏煙植株上。

表1 載體構(gòu)建相關(guān)引物核苷酸序列

1.6 qRT-PCR分析

采用Trizol法提取本氏煙植株葉片的總RNA，總RNA通過HiScript&III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Real-Time System熒光定量PCR儀檢測相關(guān)基因的表達量（表2）。參照SYBR Green I說明書進行，反應條件：98 ℃預變性30 s；循環(huán)體系（95 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）40個循環(huán)，95 ℃ 10 s，65 ℃10 s，95 ℃ 5 s；反應總體系10 μL：2×SYBR Master mix 5 μL，正向和反向引物各0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3.6 μL，每個樣品設3個技術(shù)重復。

表2 qRT-PCR相關(guān)引物核苷酸序列

1.7 Western blot分析

采集葉片樣品，迅速置于液氮中快速制凍，將樣品研磨破碎，加入蛋白裂解液充分裂解30 min，13 000 r/min高速低溫離心10 min，取上清液加入5×Loading buffer后PCR儀99 ℃變性10 min，將處理組和空白對照蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳；使用轉(zhuǎn)膜儀在25 v電壓25 min條件下將特異性蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)到NC膜上；使用5%的脫脂奶粉封閉緩沖液對NC膜進行封閉，然后轉(zhuǎn)入5%的脫脂奶粉配制的一抗（1﹕5 000）4 ℃過夜孵育，二抗使用羊抗兔或羊抗鼠抗體（1﹕10 000）；使用底色化學發(fā)光劑eECL（諾唯贊生物試劑公司）進行顯色并利用ImageJ對圖片進行分析。供試一抗CGMMV CP抗體為本實驗室制備，GFP抗體購自abmart公司。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

CGMMV侵染不同時期轉(zhuǎn)錄水平的統(tǒng)計分析使用單因素方差分析，然后用最小顯著性差異（LSD）檢驗。VIGS和瞬時過表達后基因表達水平的統(tǒng)計分析使用T測驗分析。數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示。采用GraphPad Prism 8.0.2軟件制作柱形圖。

2 結(jié)果

2.1 NbERF RAP2-1同源進化樹分析

通過MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，對NbERF RAP2-1（Nbv5tr6241794.1）蛋白的氨基酸序列進行同源進化分析。由圖1可知，NbERF RAP2-1與多種煙草中的ERF RAP蛋白分離物聚到一小支，同源性極高；與擬南芥中的ERF RAP轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系較遠。

2.2 NbERF RAP2-1亞細胞定位

利用共聚焦顯微鏡觀察NbERF RAP2-1-GFP亞細胞定位情況，NbERF RAP2-1-GFP與細胞核marker蛋白H2B-RFP共定位于細胞核中，而對照蛋白GFP定位于細胞質(zhì)和細胞核中，推測NbERF RAP2-1作為轉(zhuǎn)錄因子其主要在細胞核中調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄參與病毒侵染（圖2）。

2.3 CGMMV侵染對NbERF RAP2-1轉(zhuǎn)錄水平的影響

利用qRT-PCR方法，在CGMMV侵染的情況下檢測的表達情況。由于CGMMV侵染后6 d出現(xiàn)癥狀，在CGMMV侵染后6、9、12、15、18 d使用直徑1 cm的取樣器分別在CGMMV侵染系統(tǒng)葉與WT植株對應葉位采集樣品，檢測CGMMV侵染前期、中期和后期，植物內(nèi)源的表達情況。qRT-PCR結(jié)果顯示，在CGMMV接種6、9、12 d時的表達量與WT植株相比無明顯變化，15、18 d時表達量顯著下調(diào)。結(jié)果表明，CGMMV侵染后期抑制的轉(zhuǎn)錄表達（圖3）。

圖1 基于氨基酸序列的NbERF RAP2-1進化樹分析

圖2 NbERF RAP2-1和GFP的亞細胞定位

2.4 NbERF RAP2-1沉默后抑制了CGMMV的侵染

上述結(jié)果表明CGMMV侵染后期顯著抑制了的轉(zhuǎn)錄水平，為進一步明確NbERF RAP2-1是否在CGMMV侵染過程中起一定作用，利用TRV介導的VIGS系統(tǒng)將植物內(nèi)源沉默。將含有沉默片段的TRV-RNA2-載體的農(nóng)桿菌與TRV-RNA1共注射到本氏煙葉片中進行基因沉默，標記為TRV:；對照植物用空載的TRV-RNA2和TRV-RNA1進行共注射，標記為TRV: 00。qRT-PCR結(jié)果顯示在沉默后10 d TRV:植株沒有表型變化（圖4-A）。檢測的沉默效率發(fā)現(xiàn)TRV:中的轉(zhuǎn)錄水平是對照植株的65%（圖4-B），說明植物內(nèi)源被有效沉默。

在沉默10 d的植株上摩擦接種CGMMV。接種8 d后對照植株TRV: 00系統(tǒng)葉片出現(xiàn)卷曲癥狀，而TRV:未觀察到卷曲癥狀（圖4-A）。使用直徑1 cm的取樣器，在TRV:發(fā)病的系統(tǒng)葉以及TRV: 00對應的葉位采集樣品，分別提取RNA和蛋白，利用qRT-PCR和Western blot分別檢測CGMMV RNA水平及蛋白水平的積累情況，結(jié)果顯示與對照相比，沉默植株上的CGMMV積累量無論是RNA水平（圖4-C）還是蛋白水平（圖4-D）均顯著降低。說明沉默后有效抑制了CGMMV的侵染。

柱上標有不同字母表示差異顯著（P＜0.05）Different letters on the bars represent significantly different at 0.05 level

A：TRV: NbERF RAP2-1和TRV: 00在CGMMV侵染后的生物學表型Biological phenotypes of TRV: NbERF RAP2-1 and TRV: 00 after infection with CGMMV；B：VIGS NbERF RAP2-1的沉默效率Silencing efficiency of VIGS NbERF RAP2-1；C：TRV: NbERF RAP2-1對CGMMV CP轉(zhuǎn)錄水平的影響 Effect of TRV: NbERF RAP2-1 on the transcription level of CGMMV CP；D：TRV: NbERF RAP2-1對CGMMV CP蛋白水平的影響 Effect of TRV: NbERF RAP2-1 on the protein level of CGMMV CP

2.5 NbERF RAP2-1瞬時過表達抑制CGMMV侵染

上述結(jié)果表明被有效沉默后，CGMMV在本氏煙中的侵染顯著被抑制，那么當NbERF RAP2-1的表達顯著增強后是否影響CGMMV的侵染？首先在本氏煙7—8葉位摩擦接種CGMMV，1 h后在同一葉位的兩側(cè)過表達NbERF RAP2-1-GFP及對照GFP。在病毒接種24、48和72 h時使用熒光顯微鏡觀察NbERF RAP2-1-GFP及對照GFP，發(fā)現(xiàn)有綠色熒光表達，同時在CGMMV侵染24、48和72 h的摩接葉上使用直徑1 cm的打孔器分別取GFP對照和NbERF RAP2-1-GFP浸潤葉片，提蛋白利用Western blot檢測發(fā)現(xiàn)24 h時NbERF RAP2-1-GFP與GFP已經(jīng)表達（圖5-A），通過熒光顯微鏡可以觀察到NbERF RAP2-1在24、48和72 h時均有熒光表達；Western blot檢測24、48和72 h時CGMMV CP蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)NbERF RAP2-1過表達可導致CGMMV CP蛋白積累量顯著抑制（圖5-B）；通過ImageJ分析CGMMV CP蛋白相對表達水平，也證明了NbERF RAP2-1瞬時過表達顯著抑制了CGMMV的侵染（圖5-C）；使用qRT-PCR檢測CGMMV的mRNA相對表達量（圖5-D），顯示NbERF RAP2-1過表達后抑制CGMMV的復制。說明NbERF RAP2-1過表達后在病毒侵染早期，即復制階段就抑制了CGMMV的侵染。

A：NbERF RAP2-1-GFP 24 h時Western blot表達驗證Verification of NbERF RAP2-1-GFP expression at 24 h by Western blot；B：NbERF RAP2-1瞬時過表達對CGMMV CP蛋白水平的影響 Effects of transient overexpression of NbERF RAP2-1 on the protein level of CGMMV CP；C：24、48、72 h摩接葉CGMMV CP蛋白相對表達強度分析Analysis of the relative expression of CGMMV CP protein in inoculated leaves at 24, 48 and 72 h；D：NbERF RAP2-1瞬時過表達對CGMMV CP轉(zhuǎn)錄水平的影響Effect of transient overexpression of NbERF RAP2-1 on the transcription level of CGMMV CP

3 討論

3.1 NbERF RAP2-1作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控病毒侵染

黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）是我國重要的檢疫性病毒，近年來在北美[1]和澳大利亞[23]發(fā)現(xiàn)CGMMV能夠侵染西瓜，2005年以來，我國多個地區(qū)均檢測到CGMMV的發(fā)生，給瓜類和蔬菜產(chǎn)業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。前期通過CGMMV侵染本氏煙的RNA-Seq數(shù)據(jù)篩選到乙烯相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子NbERF RAP2-1。本研究檢測了CGMMV侵染不同時期內(nèi)源轉(zhuǎn)錄水平，檢測結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果一致，在CGMMV侵染后期可以有效抑制的轉(zhuǎn)錄（圖3）。這與之前的報道有所不同，在之前的報道中環(huán)境中的生物和非生物脅迫都可以誘導植物中ERF的轉(zhuǎn)錄[24-26]，例如大麗輪枝菌（）分泌的效應子PevD1和丁香假單胞菌（pv.DC3000）可誘導擬南芥中的ERF114轉(zhuǎn)錄上調(diào)[27]。但本研究中在CGMMV侵染后期會抑制的轉(zhuǎn)錄，推測NbERF RAP2-1具有一定的抗病作用，CGMMV在其侵染后期識別后抑制其轉(zhuǎn)錄表達。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)NbERF RAP2-1僅含有一個AP2結(jié)構(gòu)域，屬于ERF轉(zhuǎn)錄因子亞家族。利用其氨基酸序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹比對，表明NbERF RAP2-1與多種煙草的ERF RAP具有高度相似性（圖1），同時通過亞細胞定位顯示NbERF RAP2-1定位于細胞核（圖2），推測NbERF RAP2-1作為ERF家族轉(zhuǎn)錄因子成員行使功能。

3.2 NbERF RAP2-1在CGMMV侵染中的作用

在沉默的本氏煙植株中，CGMMV侵染的第8天其病毒積累量顯著降低（圖4）。而NbERF RAP2-1過表達后也會顯著抑制CGMMV的積累，并且在病毒侵染初期，24 h時就可檢測到CGMMV積累量降低（圖5）。推測在CGMMV侵染初期，即病毒RNA復制階段，NbERF RAP2-1可以有效抑制病毒復制；但隨著CGMMV不斷侵染，在CGMMV細胞間運動和長距離運動時期，CGMMV識別防御相關(guān)基因并抑制該基因的轉(zhuǎn)錄。而當植物中缺失后，不能在CGMMV侵染前期有效抑制CGMMV的復制，但是缺失可能抑制了下游蛋白的轉(zhuǎn)錄或表達，從而抑制了病毒系統(tǒng)運動，繼而抑制病毒的侵染。這與之前報道的本氏煙中的高遷移率核蛋白（high mobility group nucleoprotein，NbHMG1/2a）類似，核蛋白NbHMG1/2a無論過表達或者沉默對竹子花葉病毒（bamboo mosaic virus，BaMV）系統(tǒng)運動的影響一致[28]。

3.3 NbERF RAP2-1可能參與植物免疫過程調(diào)節(jié)CGMMV侵染

ERF蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子，其APs結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合活性，與下游基因的GCC盒特異性結(jié)合，從而調(diào)控下游基因的表達，參與植物對生物脅迫和非生物脅迫的響應。例如，ERF68可以通過與防御相關(guān)基因的GCC盒直接結(jié)合來調(diào)節(jié)番茄和煙葉對病原體的抗病性[29]；擬南芥的ERF96通過與啟動子中的GCC基序結(jié)合，增加了JA/ET防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而增強了對壞死性營養(yǎng)病原體的抵抗力[30]；DEMAX可以與PDF2.1啟動子中的GCC盒元件結(jié)合并增加了擬南芥和亞麻薺對灰葡萄孢（）的抗性[31]。另外，ERF也可以和其他蛋白互作參與植物對生物脅迫和非生物脅迫的響應。DONG等[32]研究表明，ERF可以通過與其他蛋白相互作用在植物免疫活動中發(fā)揮重要作用。蘋果的MdERF10和MdHLH92相互作用從而提高對白粉病的抗性[33]；擬南芥的AtERF72被發(fā)現(xiàn)與ACBP相互作用來調(diào)節(jié)防御[34]，并可以通過與TGA4相互作用來直接增強抗病性[35]；AtERF72被證明與ORA59相互作用以增強對胡蘿卜乳桿菌的抗病性[36]。但是關(guān)于NbERF RAP2-1在CGMMV侵染過程中如何調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄或者蛋白表達仍需進一步研究。推測NbERF RAP2-1參與植物免疫過程，主要調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄或下游互作蛋白的表達來參與植物抗病毒過程。

4 結(jié)論

NbERF RAP2-1作為ERF家族轉(zhuǎn)錄因子在細胞核中行使功能，其在CGMMV侵染后期表達量顯著下調(diào)；沉默和瞬時過表達均抑制CGMMV的積累。推測NbERF RAP2-1可以有效抑制CGMMV侵染初期病毒RNA的復制；隨著CGMMV不斷侵染，CGMMV識別防御相關(guān)基因并抑制該基因的轉(zhuǎn)錄；當缺失后可能抑制了下游蛋白的轉(zhuǎn)錄或表達，從而抑制了病毒侵染后期的積累。由此可見，NbERF RAP2-1在CGMMV侵染過程中發(fā)揮了重要作用。

[1] LING K S, LI R, ZHANG W. First report of cucumber green mottle mosaic virus infecting greenhouse cucumber in Canada. Plant Disease, 2014, 98(5): 701.

[2] DOMBROVSKY A, TRAN-NGUYEN L T T, JONES R A C. Cucumber green mottle mosaic virus: Rapidly increasing global distribution, etiology, epidemiology, and management. Annual Review of Phytopathology, 2017, 55: 231-256.

[3] 周紅珍, 張志勇, 彭輝. 黃瓜綠斑駁花葉病毒病的發(fā)生癥狀及防控措施. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2013(18): 138, 140.

ZHOU H Z, ZHANG Z Y, PENG H. Occurrence symptoms and control measures of cucumber green mottle mosaic virus disease. Modern Agricultural Science and Technology, 2013(18): 138, 140. (in Chinese)

[4] 林燚, 楊瑜斌, 王馳, 王文華, 毛玲榮. 溫臺地區(qū)西瓜發(fā)生黃瓜綠斑駁花葉病毒病調(diào)查初報. 浙江農(nóng)業(yè)科學, 2012(1): 83-85.

LIN Y, YANG Y B, WANG C, WANG W H, MAO L R. Investigation of cucumber green mottle mosaic virus disease on watermelon in Wentai region. Journal of Zhejiang Agricultural Sciences, 2012(1): 83-85. (in Chinese)

[5] 陳紅運, 趙文軍, 程毅, 李明福, 朱水芳. 遼中地區(qū)西瓜花葉病病原的分子鑒定. 植物病理學報, 2006, 36(4): 306-309.

CHEN H Y, ZHAO W J, CHENG Y, LI M F, ZHU S F. Molecular identification of the virus causing watermelon mosaic disease in Mid-Liaoning. Acta Phytopathologica Sinica, 2006, 36(4): 306-309. (in Chinese)

[6] 程兆榜, 任春梅, 繆倩, 王鋒, 張重陽, 周益軍, 范永堅. 江蘇黃瓜綠斑駁花葉病毒的發(fā)生和防治. 江蘇農(nóng)業(yè)科學, 2013, 41(2): 114-117.

CHENG Z B, REN C M, MIAO Q, WANG F, ZHANG C Y, ZHOU Y J, FAN Y J. Occurrence and control of cucumber green mottle mosaic virus in Jiangsu. Jiangsu Agricultural Sciences, 2013, 41(2): 114-117. (in Chinese)

[7] 李小妮, 任小平, 王琳, 王明強, 周國輝. 廣東省黃瓜綠斑駁花葉病毒分子檢測及防疫. 植物保護學報, 2009, 36(3): 283-284.

LI X N, REN X P, WANG L, WANG M Q, ZHOU G H. Molecular detection and epidemic prevention of cucumber green mottle mosaic virus in Guangdong, China. Acta Phytopathologica Sinica, 2009, 36(3): 283-284. (in Chinese)

[8] 田永蕾, 劉冬梅, 張永江, 李明福, 馬占鴻. 黃瓜綠斑駁花葉病毒北京和山東分離物的生物學測定及其基因組比較. 植物檢疫, 2009, 23(6): 1-6.

TIAN Y L, LIU D M, ZHANG Y J, LI M F, MA Z H. Bioassay and genomic studies on the two isolates of cucumber green mottle mosaic virus from Beijing and Shandong. Plant Quarantine, 2009, 23(6): 1-6. (in Chinese)

[9] 趙慧茹, 林振亞, 朱俊子, 張亞東, 高必達. 湖南首次檢測到黃瓜綠斑駁花葉病毒. 植物病理學報, 2013, 43(2): 219-221.

ZHAO H R, LIN Z Y, ZHU J Z, ZHANG Y D, GAO B D. First report of cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) in Hunan Province. Acta Phytopathologica Sinica, 2013, 43(2): 219-221. (in Chinese)

[10] UGAKI M, TOMIYAMA M, KAKUTANI T, HIDAKA S, KIGUCHI T, NAGATA R, SATO T, MOTOYOSHI F, NISHIGUCHI M. The complete nucleotide sequence of cucumber green mottle mosaic virus (SH strain) genomic RNA. Journal of General Virology, 1991, 72(7): 1487-1495.

[11] 李俊香, 古勤生. 黃瓜綠斑駁花葉病毒傳播方式的研究進展. 中國蔬菜, 2015(1): 13-18.

LI J X, GU Q S. Research progress on the transmission mode of cucumber green mottle mosaic virus. China Vegetables, 2015(1): 13-18. (in Chinese)

[12] YANG L L, LI Q L, HAN X Y, JIANG X L, WANG H, SHI Y J, CHEN L L, LI H L, LIU Y Q, YANG X, SHI Y. A cysteine-rich secretory protein involves in phytohormone melatonin mediated plant resistance to CGMMV. BMC Plant Biology, 2023, 23(1): 215.

[13] NAKANO T, SUZUKI K, FUJIMURA T, SHINSHI H. Genome-wide analysis of the ERF gene family inand rice. Plant Physiology, 2006, 140(2): 411-432.

[14] RIECHMANN J L, HEARD J, MARTIN G, REUBER L, JIANG C, KEDDIE J, ADAM L, PINEDA O, RATCLIFFE O J, SAMAHA R R,.transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes. Science, 2000, 290(5499): 2105-2110.

[15] MIZOI J, SHINOZAKI K, YAMAGUCHI-SHINOZAKI K. AP2/ERF family transcription factors in plant abiotic stress responses. Biochimica et Biophysica Acta, 2012, 1819(2): 86-96.

[16] ZHU Y, ZHANG X, ZHANG Q, CHAI S, YIN W, GAO M, LI Z, WANG X. The transcription factors VaERF16 and VaMYB306 interact to enhance resistance of grapevine toinfection. Molecular Plant Pathology, 2022, 23(10): 1415-1432.

[17] LI Y, LIU K, TONG G, XI C, LIU J, ZHAO H, WANG Y, REN D, HAN S. MPK3/MPK6-mediated phosphorylation of ERF72 positively regulates resistance tothrough directly and indirectly activating the transcription of camalexin biosynthesis enzymes. Journal of Experimental Botany, 2022, 73(1): 413-428.

[18] YANG H, SUN Y, WANG H, ZHAO T, XU X, JIANG J, LI J. Genome-wide identification and functional analysis of the ERF2 gene family in response to disease resistance againstin tomato. BMC Plant Biology, 2021, 21(1): 72.

[19] HONG Y, WANG H, GAO Y, BI Y, XIONG X, YAN Y, WANG J, LI D, SONG F. ERF transcription factor OsBIERF3 positively contributes to immunity against fungal and bacterial diseases but negatively regulates cold tolerance in rice. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(2): 606.

[20] LIU D, CHEN X, LIU J, YE J, GUO Z. The rice ERF transcription factor OsERF922 negatively regulates resistance toand salt tolerance. Journal of Experimental Botany, 2012, 63(10): 3899-3911.

[21] HUANG Y, ZHANG B L, SUN S, XING G M, WANG F, LI M Y, TIAN Y S, XIONG A S. AP2/ERF transcription factors involved in response to tomato yellow leaf curly virus in tomato. The Plant Genome, 2016, 9(2). doi: 10.3835/plantgenome2015.09.0082.

[22] ZHANG G, CHEN M, LI L, XU Z, CHEN X, GUO J, MA Y. Overexpression of the soybean GmERF3 gene, an AP2/ERF type transcription factor for increased tolerances to salt, drought, and diseases in transgenic tobacco. Journal of Experimental Botany, 2009, 60(13): 3781-3796.

[23] TESORIERO L A, CHAMBERS G, SRIVASTAVA M, SMITH S, CONDE B, TRAN-NGUYEN L T T. First report of cucumber green mottle mosaic virus in Australia. Australasian Plant Disease Notes, 2016, 11: 1.

[24] THIRUGNANASAMBANTHAM K, DURAIRAJ S, SARAVANAN S, KARIKALAN K, MURALIDARAN S, ISLAM V I H. Role of ethylene response transcription factor (ERF) and its regulation in response to stress encountered by plants. Plant Molecular Biology Reporter, 2015, 33(3): 347-357.

[25] YANG R, LIU J, LIN Z, SUN W, WU Z, HU H, ZHANG Y. ERF transcription factors involved in salt response in tomato. Plant Growth Regulation, 2018, 84: 573-582.

[26] PHUKAN U J, JEENA G S, TRIPATHI V, SHUKLA R K. MaRAP2-4, a waterlogging-responsive ERF from, regulates bidirectional sugar transporter AtSWEET10 to modulate stress response in. Plant Biotechnology Journal, 2018, 16(1): 221-233.

[27] LI Z, ZHANG Y, REN J, JIA F, ZENG H, LI G, YANG X. Ethylene-responsive factor ERF114 mediates fungal pathogen effector PevD1-induced disease resistance in. Molecular Plant Pathology, 2022, 23(6): 819-831.

[28] ALAZEM M, HE M H, CHANG C H, CHENG N, LIN N S. Disrupting the homeostasis of high mobility group protein promotes the systemic movement of bamboo mosaic virus. Frontiers in Plant Science, 2020, 11: 597665.

[29] LIU A C, CHENG C P. Pathogen-induced ERF68 regulates hypersensitive cell death in tomato. Molecular Plant Pathology, 2017, 18(8): 1062-1074.

[30] CATINOT J, HUANG J B, HUANG P Y, TSENG M Y, CHEN Y L, GU S Y, LO W S, WANG L C, CHEN Y R, ZIMMERLI L. ETHYLENE RESPONSE FACTOR 96 positively regulatesresistance to necrotrophic pathogens by direct binding to GCC elements of jasmonate- and ethylene-responsive defence genes. Plant, Cell and Environment, 2015, 38(12): 2721-2734.

[31] JU S, GO Y S, CHOI H J, PARK J M, SUH M C. DEWAX transcription factor is involved in resistance toinand. Frontiers in Plant Science, 2017, 8: 1210.

[32] DONG L, CHENG Y, WU J, CHENG Q, LI W, FAN S, JIANG L, XU Z, KONG F, ZHANG D, XU P, ZHANG S. Overexpression of GmERF5, a new member of the soybean EAR motif-containing ERF transcription factor, enhances resistance toin soybean. Journal of Experimental Botany, 2015, 66(9): 2635-2647.

[33] ZHANG Y, ZHANG L, MA H, ZHANG Y, ZHANG X, JI M, VAN NOCKER S, AHMAD B, ZHAO Z, WANG X, GAO H. Overexpression of the apple (×) MdERF100 inincreases resistance to powdery mildew. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(11): 5713.

[34] LI H Y, XIAO S, CHYE M L. Ethylene- and pathogen-inducibleacyl-CoA-binding protein 4 interacts with an ethylene- responsive element binding protein. Journal of Experimental Botany, 2008, 59(14): 3997-4006.

[35] BüTTNER M, SINGH K B.ethylene-responsive element binding protein (AtEBP), an ethylene-inducible, GCC box DNA-binding protein interacts with an ocs element binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1997, 94(11): 5961-5966.

[36] KIM N Y, JANG Y J, PARK O K. AP2/ERF family transcription factors ORA59 and RAP2.3 interact in the nucleus and function together in ethylene responses. Frontiers in Plant Science, 2018, 9: 1675.

Function of Transcription Factor NbERF RAP2-1 in Cucumber Green Mottle Mosaic Virus Infection

YU LianWei1, JIANG XingLin1, YANG LingLing1, WANG He1, ZHANG YuYang1, XIE LiNa1, XIA ZiHao5, LI HongLian1,3,4, YANG Xue1,2, SHI Yan1

1College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;2Crop science postdoctoral programme of Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002;3Collaborative Innovation Centre of Henan Grain crops, Zhengzhou 450002;4State Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science, Zhengzhou 450002;5College of Plant Protection, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866

【Background】Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) is an important quarantine plant virus in China, which has caused serious economic losses to vegetable and melon industry. The ERF transcription factor is involved in biotic and abiotic stress and the defense response against a variety of plant pathogens. In previous study, it was demonstrated that the host transcription factor NbERF RAP2-1 was significantly down-regulated after CGMMV infection.【Objective】Theobjective of this study is to clarify the function of the ERF transcription factor family members in CGMMV infection, and to provide a theoretical basis for disease control caused by CGMMV.【Method】MEGA7.0 was used to construct a phylogenetic tree to analyze the amino acid sequence of NbERF RAP2-1. The expression vector-GFP was constructed to observe the subcellular localization of. The transcript level ofat different stages of CGMMV infection was analyzed by qRT-PCR. VIGS and transient overexpression ofwere conducted to analyze the function ofduring CGMMV infection.【Result】Phylogenetic tree analysis showed that NbERF RAP2-1 was highly homologous to ERF transcription factors in tobacco, and was far from ERF transcription factors in. The results of subcellular localization showed that NbERF RAP2-1 was localized in the nucleus and acted as a transcription factor. The effect of CGMMV infection on the transcript level of theshowed that the expression level ofdid not significantly change at the 6, 9, and 12 d after inoculation, but at the 15 and 18 d after inoculation, the expression level of1 was significantly down-regulated. tobacco rattle virus (TRV) mediated VIGS was used to silence the, and CGMMV was inoculated in TRV:and TRV: 00 plants. At 8 d after inoculation, the leaves of TRV: 00 plants showed mottling and curling, while the TRV:plants showed no symptoms. At the same time, the detection results of CGMMV RNA and protein levels showed that TRV:could effectively inhibit the accumulation of CGMMV. Similarly, transient overexpression of NbERF RAP2-1 inhibited the accumulation of CGMMV at 24, 48, and 72 h, respectively.【Conclusion】effectively inhibit the initial CGMMV replication, i.e. the viral RNA replication stage. With the invasion of CGMMV, i.e. the intercellular and systemic movements of CGMMV, CGMMV recognizes and inhibits the transcript level of. Whenis knocked down, that may inhibit the transcription of downstream proteins, thereby inhibiting the accumulation of CGMMV at a later stage.plays an important role during the CGMMV infection.

cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV);; pathogenic mechanism

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.15.007

2023-05-11；

2023-06-10

國家自然科學基金（3210170372）、河南省青年人才托舉工程項目（2022HYTP037）、河南農(nóng)業(yè)大學科技創(chuàng)新項目（KJCX2021A13）、河南省重點研發(fā)與推廣專項（222102110059）

于連偉，E-mail：ylwnet972@163.com。通信作者楊雪，E-mail：yangxuepphappy@126.com。通信作者施艷，E-mail：shiyan00925@126.com

（責任編輯 岳梅）