基于毛細管凝膠電泳與DNA 條形碼技術鑒別可食用動物內臟摻假方法的研究

勵炯，吳 瓊，江 海，扈明潔，金朦娜，閆金花

（杭州市食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310017）

食用動物內臟一直是我國幾千年飲食文化中重要的一部分，爆炒雞心、熘肝尖、紅燒鴨腸等等，很多可食用內臟是我國各種菜系中的經典之作，同時，近年來特別流行的火鍋、燒烤及鹵味文化，更是把各種動物內臟的吃法發(fā)揮到極致[1]。動物內臟不僅美味，而且營養(yǎng)豐富[2]，能有效補充人體各種微量元素和維生素等營養(yǎng)元素的需求，防止由于這些營養(yǎng)元素的缺失而導致的各種疾病[3]。市面上常見的畜禽類內臟食材通常以整個部位進行銷售，而豬牛羊畜類動物以及雞鴨鵝等禽類動物內臟，由于其體型和種屬相近的緣由，再加上不法商家會采用香精等對其原有的氣味進行掩蓋，經過粉碎、煙熏、腌制等深加工處理的可食用內臟，使其原有的感官性狀發(fā)生改變，普通消費者很難用感官進行判斷鑒別[4?6]。其次，不同來源內臟的價格差異，增加了用低價內臟來替代高價內臟的風險性。

近年來，越來越多基于分子水平的技術研究應用于食品摻假鑒別中，一般包括蛋白分析技術或者基于DNA 分析[7?12]。由于基于蛋白的摻假技術存在無法區(qū)分相近物種或者深加工食品摻假等問題，基于DNA 的技術具有較強的特異性和靈敏度，也可以對深加工食品進行鑒別，越來越多的摻假研究集中在基于DNA 分析的技術方面[13?15]。

由于缺乏標準化和通用性等問題，大多數(shù)基于DNA 分析的鑒別技術沒有得到廣泛的應用，局限性較明顯，可靠性和專屬性不強[16?17]。DNA 條形碼技術（DNA Barcoding）作為一種可靠快速的鑒定手段，越來越多的應用于各種領域的物種的鑒別，其是利用一段相對較短的DNA 片段，該片段容易擴增且有足夠的變異性[18?20]。很多研究采用線粒體細胞色素C 氧化酶亞基Ι（Cytochrome Coxidase Subunit I，COI）基因的650 bp 左右大小的片段區(qū)域來研究可食用動物內臟的摻假，該片段符合DNA 條形碼技術對目標基因需具有足夠的特異性和種間足夠的多樣性的要求，被用于多種動物源食品的摻假鑒別與應用中，也稱全片段DNA 條形碼技術（Full-length DNA Barcoding）[21?22]。毛細管凝膠電泳分析系統(tǒng)是利用高壓電場下，由于各DNA 片段的大小、帶電荷數(shù)、等電點等性質不同，在凝膠電泳上的遷移速度不一致，各組分依次移動至毛細管輸出端附近的光檢測器，檢測和記錄其吸光度，并將各組分以吸收峰的形式動態(tài)直觀地記錄下來，自動分析出各目的片段的堿基數(shù)[23?24]。毛細管凝膠電泳分析技術極大的簡化了PCR 產物的分析步驟，提高了檢測效率，其檢測分辨率低至3～5 bp，記錄的吸光值使得PCR 產物的分析更加直觀并可以進行量化分析[25?26]。

目前關于可食用動物內臟的摻假研究有限，未曾有對整個可食用動物內臟摻假風險進行系統(tǒng)性研究和評估，也沒有一套完整的摻假鑒別技術來提供相關的技術支持，特別是可食用內臟復雜的基質以及摻假鑒別技術對樣品前處理的特殊要求（比如防止漏檢和誤檢），給可食用內臟鑒別帶來一定的困難，再加上經濟利益驅動，給一些不法商家提供了可乘之機，市售可食用內臟摻假行為層出不窮。本文以常見的7 種動物源的5 類可食用內臟為研究對象，首次將毛細管凝膠電泳分析系統(tǒng)與DNA 條形碼技術結合，建立基于COI 序列的鑒別可食用動物內臟摻假的檢測技術，以期能為市售可食用動物內臟的質量監(jiān)督提供技術支持和保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

為了保證研究的動物內臟沒有摻假，所用的5類可食用動物內臟（包括胃、腸、肝、腎、肺）于屠宰場屠宰整只豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、兔時取樣，作為本研究方法學建立與優(yōu)化的原料；共計25 批次新鮮動物內臟及其制品 研究所用的實際樣品來自杭州市農貿市場及超市，置于?20 ℃保存。

血液與組織DNA 提取試劑盒、QIAxcel DNA High Resolution Kit（1200）、QX Alignment Marker 15/600 bp、QX DNA Size Marker 15～1500 bp 均購自德國Qiagen 公司；即用PCR 擴增試劑、擴增產物回收試劑盒 購自上海生工公司；T4連接試劑盒、DH5α感受態(tài)細胞 購自TaKaRa 公司。

QIAxcel 全自動毛細管凝膠電泳分析系統(tǒng) 購自德國Qiagen 公司；Veriti 96 孔梯度PCR 儀 購自美國ABI 公司；EYELA FDU-1100 真空冷凍干燥器購自日本東京理化公司；NanoDrop 1000 微量核酸蛋白測定儀、冷凍高速離心機 均購自美國Thermo公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 將7 種動物的5 類可食用內臟以及25 批次可食用動物制品分別用刀切成小塊或小段后，取100 g 樣品泡于250 mL 生理鹽水中，超聲處理30 min，過濾，去掉濾液，反復處理后直至除去血水，殘渣用料理機進行粉碎處理，在?80 ℃下預冷4 h 后的樣品置真空冷凍干燥箱（溫度≤?50 ℃，真空度≤1×10?4Pa）處理24 h，冷凍干燥處理后的樣品經粉碎過篩后，室溫存放于干燥器中，備用。

1.2.2 DNA 提取與純化 由于動物內臟基質較復雜，需要一定的DNA 純化步驟才可以保證7 種動物的5 類內臟的DNA 的擴增效率，本文在DNeasy 血液與組織提取試劑盒的操作規(guī)程的基礎上進行一定的改進，具體操作如下：0.5 g 樣品中加入2 mL ATL緩沖溶液和0.2 mL 蛋白酶K，56 ℃裂解至溶液澄清。取裂解液0.25 mL，純化過程按照試劑盒說明進行操作。最后將純化的DNA 用37 ℃預熱的AE 緩沖液洗脫DNA，?20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 COI 基因的擴增 本文最終選用了Ivanova等[27]公開發(fā)表的一對引物（COI-A，詳細序列見表1），為了方便DNA 測序，在每對引物上連接M13，引物合成由杭州擎科生物技術有限公司提供支持。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequence of genes

本文采用了25 μL 的PCR 擴增體系，每個體系由以下試劑組成：12.5 μL 即用PCR 擴增試劑（上海生工公司），9.5 μL 重蒸水，0.5 μL 10 μmol/L 正向引物，0.5 μL 10 μmol/L 反向引物，2 μL DNA 模板。DNA 條形碼片段擴增程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性1 min，46 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s（5 個循環(huán)）；95 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s（35個循環(huán)）；最后72 ℃延伸10 min。將擴增片段儲存于?20 ℃，備用。

1.2.4 毛細管凝膠電泳確認 采用QIAxcel 毛細管凝膠電泳分析系統(tǒng)對PCR 擴增產物進行確認分析，對可食用動物內臟的COI 基因的擴增效率進行初步確認。將Alignment Marker 校準過并進行平衡的凝膠卡夾置于儀器內，樣品分析盤內分別放入已加入10 μL DNA size marker 以及動物內臟的擴增產物的小管，由于本文采用的擴增條件的擴增效率很高，本文最終將擴增產物用緩沖液稀釋至100 倍后再進行分析，毛細管凝膠電泳分析時間為5 min。PCR 擴增產物經DNA High Resolution Kit（1200）凝膠電泳分離后進行確認分析。確認后的PCR 產物送公司進行測序（杭州擎科生物技術有限公司），所得的測序結果經刪除兩端引物序列，獲得最終的擴增序列。

1.2.5 PCR 產物克隆測序 切膠回收純化后的PCR產物與pGEM-T 載體連接后，導入DH5α感受態(tài)細胞。36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，經過藍-白篩選后，挑取10 個不同的白色菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜（36 ℃，150 r/min 搖床），取菌液1 mL 提取質粒DNA，送杭州擎科生物技術有限公司進行測序。

1.2.6 測序結果分析 將經刪除兩端引物和質粒序列后的測序結果提交本地數(shù)據(jù)庫進行比對，進行DNA 序列比對，便可以得到摻假樣品中混有其他不同動物來源的內臟的序列，從而準確的分析出摻假樣品中含有的動物源種類。同時利用美國國家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）數(shù)據(jù)庫對樣品的COI 序列進行鑒定和相似度分析。

2 結果與分析

2.1 摻假樣品預處理方法的優(yōu)化

相對其他生物樣本，動物內臟的基質較為復雜，一般在DNA 提取純化之前，需要采用一定的預清理方式，將含有的組織液和血液進行清除[28?30]。本文將切成小塊的動物內臟用生理鹽水浸泡并進行超聲清洗處理。DNeasy 血液與組織提取試劑盒的說明書的取樣方式是采用一次性鑷子直接從樣品上取一定量的樣品，由于本文是針對摻假樣品的研究，取樣的均一性和代表性直接影響最終實驗結果。摻混樣品預處理方式的選擇會直接決定取樣之前樣品的均一性，是影響被取樣品的代表性的最重要的因素。一般動物組織的分子生物學實驗的預處理方式有2 種，即料理機粉碎混勻和液氮研磨法。而現(xiàn)代高科技技術的不斷進步，涌現(xiàn)出很多先進的樣品前處理技術和設備，真空冷凍干燥技術也越來越多的應用于各個領域的前處理技術中。本文采用含10%雞源性成分的鴨腸，來考察上述三種預處理方式的可靠性，具體操作如下：各取5 組含10%雞源性成分的鴨腸（每組20 份樣品），分別經三種預處理方式，前處理和分析參照1.2 節(jié)，結果用雞腸檢出率來對樣品均一性進行分析，由圖1 可知：采用真空冷凍干燥法進行預處理的樣品檢測結果，與其他兩種預處理檢測結果有顯著性差異（P<0.001），雞源性成分檢出率達到100%，采用真空冷凍干燥處理后的摻假樣品，由于將樣品直接冷凍干燥，再用粉粹機處理成均一性較好的粉末混合樣品，而其他兩種方式處理的樣品，有不同程度的漏檢情況發(fā)生，所以本文最終選擇真空冷凍干燥法對樣品進行預處理。

圖1 不同前處理方式（A）和不同取樣量（B）對鴨腸摻假模型（含10%雞源性成分）中的摻假成分檢出率的影響Fig.1 Effect of different pretreatment methods (A) and sampling volumes (B) on the detection rate of adulterated ingredients in the duck sausage adulteration model (containing 10% chicken-derived ingredients)

一般生物樣品的DNA 提取與凈化均可以完全按照DNA 提取試劑盒的說明進行操作，比如樣品的取樣，用一次性鑷子取10～25 mg 即可。由于摻假樣品對均一性的要求，取樣量太少會影響樣品的代表性，從而影響摻假檢出情況，造成實驗結果誤判。本文采用含10%雞源性成分的鴨腸考察動物內臟摻假樣品中的最佳取樣量，采用0.025、0.1、0.5 g 三個取樣量進行研究，結果發(fā)現(xiàn)，當取樣量為0.5 g 時，樣品中檢出雞源性成分的比例為100%，而取樣量為0.025 g和0.1 g 時，均有不同程度的漏檢情況，所以本文最終采用0.5 g 的取樣量對可食用內臟摻假樣品進行DNA提取。

2.2 摻假樣品DNA 提取方式的優(yōu)化

近年來實驗室常用的商業(yè)化DNA 提取試劑盒一般有兩種類型，即快速提取法和柱模法提取試劑盒，快速提取試劑盒的優(yōu)點是簡單、快、效率高，缺點是沒有去雜質步驟，可能會影響PCR 擴增效率，而柱模法增加了深度純化DNA 的步驟，但是提取過程比較耗時[31?32]。本文采用兩種提取試劑盒對7 種動物的5 類可食用內臟的DNA 提取純化效率進行考察，純化效率用A260和A280的比值進行判斷判斷，如果比值在1.8～2.0 之間，可以認為該DNA 比較純，質量較好[33]，具體數(shù)據(jù)見圖2。

圖2 不同DNA 提取方法對可食用動物內臟DNA純度的總體影響統(tǒng)計Fig.2 Statistics on the overall effect of different DNA extraction methods on the purity of DNA from edible visceral

從圖2 的統(tǒng)計圖中可以看出，柱膜法提取的可食用內臟的DNA 的A260/A280比值要比快速提取法高，純度較高，質量較好，A260與A280的比值主要集中在1.8～2.0 之間，而快速提取法提取DNA 的A260與A280的比值在1.2～1.6 之間，純度較差，所以本文最終采用柱膜法對各種動物源的可食用內臟的DNA進行提取凈化。

2.3 COI 基因片段的擴增條件優(yōu)化

影響目標DNA 片段擴增效率關鍵因素主要包括引物的選擇、擴增體系中DNA 模板濃度以及擴增程序中的退火溫度[34?35]。DNA 條形碼技術的關鍵也是選擇合適的引物，作為通用引物，在同一個擴增體系和條件下，能有效的擴增出研究的幾種物種的目標DNA 片段。本文選用了三對通用引物COI-A、COIB 和COI-C（具體引物序列詳見表1），分別對7 種動物源內臟進行擴增效率進行考察，三對引物擴增的目標片段均是線粒體COI 基因上大小為658 bp 的片段。7 種動物的5 類可食用內臟DNA 經提取純化并擴增后，擴增產物經QIAxcel 毛細管凝膠電泳分析系統(tǒng)進行確認分析，結果發(fā)現(xiàn)，引物COI-B 雖然能非常有效的擴增出7 種動物的5 類可食用內臟的基因片段，但是鵝的5 類內臟的擴增效率低，相對于的條帶的熒光值較低；引物COI-C 幾乎對所有7 種動物的5 類內臟的擴增效率都很低，從條帶的熒光值可以判斷擴增失敗；而引物COI-A 能全部高效的擴增出658 bp 的目標片段，所以本文最終采用COIA 作為可食用內臟摻混研究的引物（具體見圖3）。

圖3 7 種動物源的可食用內臟（肝）DNA 條形碼的PCR 擴增電泳圖Fig.3 Electrophoresis images of DNA barcoding fragments amplified by PCR from liver of 7 anmials

選擇了合適的通用引物后，本文繼續(xù)對擴增體系中的DNA 模板量及PCR 擴增程序中的退火溫度進行優(yōu)化。由于毛細管凝膠電泳上的毛細管輸出端配置了光檢測器，擴增產物條帶在每個泳道上吸光度（熒光值）會被檢測器記錄，并轉化為相應的條帶信號，所以可以利用毛細管凝膠電泳分析系統(tǒng)記錄的各個產物條帶的熒光值，對擴增效率進行量化考察。在一定的擴增體系中，DNA 模板的濃度過高或者過低，都會影響擴增效率，從而降低PCR 擴增產物濃度，影響檢測結果的靈敏度和有效性。本文考察了三個體積的DNA 模板量，分別為1、2、3 μL，在同樣的擴增條件下進行擴增后，擴增產物經毛細管凝膠電泳分析系統(tǒng)后讀取相應的目標條帶的熒光值（RFU），結果見圖4。同時，在PCR 擴增程序中，合適的退火溫度是保證擴增效率以及產物特異性的關鍵因素，退火溫度太低，會影響擴增產物的特異性，反之則會大幅度降低擴增效率。本文采用50、53 以及57 ℃，3 個退火溫度分別對7 種動物的5 類內臟進行擴增效率的考察，擴增產物經毛細管凝膠電泳分析系統(tǒng)后讀取相應的目標條帶的熒光值（RFU），結果見圖4。

圖4 DNA 模板量與不同退火溫度對7 種動物源的可食用內臟DNA 條形碼的PCR 擴增效率的影響Fig.4 Effect of DNA template amount and different annealing temperatures on the PCR amplification efficiency of edible visceral DNA barcodes from seven animal source

從圖4 可以看出，當DNA 模板量為1 μL 和3 μL時，7 種動物源的5 類內臟的凝膠條帶的熒光值較模板量2 μL 時小，而熒光值大小與擴增效率成正比；選擇退火溫度為53 ℃，7 種動物源的5 類內臟的凝膠條帶的熒光值最高。所以本文最終選擇DNA 模板量為2 μL、退火溫度為53 ℃的擴增條件作為7 種動物源的5 類內臟DNA 條形碼基因的最佳擴增條件。從毛細管凝膠電泳系統(tǒng)中可以看出，7 種動物源的5 類內臟在700 bp 左右均有一條較明顯的擴增條帶（見圖3）。然后將7 種動物源的5 類內臟的PCR擴增產物送至生物公司進行克隆測序，測序結果見表2。

表2 7 種動物源內臟的DNA 條形碼檢測結果Table 2 DNA barcoding results for 7 samples found to contain one species

2.4 可食用動物內臟摻假模型靈敏度和穩(wěn)定性檢測

本文根據(jù)常見的可食用動物內臟的摻假類型，根據(jù)經濟價值的高低，對可能存在的摻假模式進行模擬，具體見表3。

表3 可食用內臟摻假模型Table 3 Animal viscera adulteration model

本文根據(jù)現(xiàn)有的可食用內臟的市場價格，根據(jù)其價格與供給量進行評估可食用內臟的經濟價值，分成高經濟價值可食用內臟和低經濟價值可食用內臟，根據(jù)類型和感官性狀等，建立了19 個可食用內臟摻假模型，對可食用動物內臟中有可能摻假的其他動物源內臟進行摻假靈敏度的考察。結果發(fā)現(xiàn)，19 個可食用內臟的摻假模型中的摻假成分檢出靈敏度較合理，最低檢出比例均能達到5%，能滿足日常的檢測要求。同時本文對19 個摻假模型，分別采用5%、10%、15%三個摻假比例，進行穩(wěn)定性考察。將上述擴增產物置?20 ℃進行保存，分別在第1、3、7 d 進行檢測，結果保持一致。

2.5 建立基于BLAST+的7 種可食用動物內臟的DNA條形碼本地數(shù)據(jù)庫

基本局域連配檢索工具（Basic local alignment search tool,BLAST）是由NCBI 開發(fā)的序列查找和比對工具，BLAST 及其相關數(shù)據(jù)庫是快速進行數(shù)據(jù)查詢匹配的有力工具[36]。目前BLAST 本地化工具（BLAST+）及其數(shù)據(jù)庫可以通過自行構建的方法脫機運行，即通過本地數(shù)據(jù)庫進行查找，而無需連接到美國NCBI 中央數(shù)據(jù)庫[37]。本文根據(jù)測定的7 種動物源的可食用動物內臟的COI 基因序列，構建了常見的可食用內臟摻假的內臟DNA 條形碼本地數(shù)據(jù)庫。將11 種肉的微條形碼片段核酸序列存為單一的FASTA 格式文件viscera07，然后使用BLAST+工具包的makeblastdb 命令（makeblastndb-in.viscera07.fasta-dbtype nucl-parse_seqids-out Viscera），對上述序列文件進行數(shù)據(jù)格式化和索引化，形成可供BLAST檢索的本地數(shù)據(jù)庫Viscera。

取本文研究的可食用內臟的摻假模型、實際樣品的測序結果，使用本地數(shù)據(jù)庫的blastn 命令將待檢索序列結果對數(shù)據(jù)庫進行檢索，結果自動保存于result.txt 文件。在結果目錄下打開result.txt 文件，根據(jù)比對得分（Score）情況進行結果分析。

2.6 可食用內臟制品檢測

按照本文建立的方法，對25 批次可食用內臟制品進行摻假鑒別，將克隆測序結果經建立的可食用動物內臟的DNA 條形碼本地數(shù)據(jù)庫進行blast 比對分析，結果見表4。

表4 實際樣品檢測結果Table 4 Actual sample test results

本文利用建立的檢測和分析方法對25 批次可食用內臟制品進行摻假鑒別研究，25 批次可食用內臟制品包括6 批次的牛百葉（牛胃）、5 批次的鵝肝、4 批次的鵝腸、3 批次的牛肝、2 批次的羊肝、2 批次的牛腸、2 批次的羊肺以及1 批次的牛肺。所有的樣品經預處理、DNA 提取純化擴增后，在毛細管凝膠色譜分析上700 bp 左右的位置均有一條較清晰的條帶。將擴增產物進行切膠純化后，進行克隆測序，測序結果經建立的可食用動物內臟的DNA 條形碼本地數(shù)據(jù)庫進行blast 比對分析。比對結果發(fā)現(xiàn)，25 批次的可食用內臟制品檢出2 批次的豬源性成分和2 批次的鴨源性成分，摻假比例為16%：其中6 批次的牛百葉制品中檢出2 批次的豬源性成分，不合格率為33%；4 批次的鵝腸制品中檢出1 批次的鴨源性成分，不合格率為25%；5 批次的鵝肝制品中檢出1 批次的鴨源性成分，不合格率為20%。為了驗證本檢測方法的可靠性，我們對上述4 批次的摻假樣品參照農業(yè)部標準NY/T 3309-2018《肉類源性成分鑒定 實時熒光定性PCR 法》進行檢測，結果與本方法一致（見表4）。從上述檢測結果可以看出，市售可食用內臟制品中，牛百葉、鵝腸、鵝肝等三類內臟制品比較容易有摻假問題，需要重點關注。

3 結論

本文建立了基于QIAxcel 毛細管凝膠電泳分析系統(tǒng)結合DNA 條形碼技術對7 種可食用內臟進行摻假鑒定，優(yōu)化了樣品前處理、DNA 提取和PCR 擴增條件。擴增產物進行克隆測序所得的COI 基于序列在建立的可食用動物內臟的DNA 條形碼本地數(shù)據(jù)庫Viscera 進行BLAST 比對，進行摻假鑒別。本方法檢出靈敏度較合適，適合正常的可食用內臟摻假鑒別，又不會出現(xiàn)誤判。傳統(tǒng)的基于DAN 分析的鑒定技術一般使用特異性引物進行擴增，方法的通用性不強，摻假篩選能力一般；而DNA 條形碼技術采用通用型引物，可以一次性檢測可食用動物內臟中的7 種動物源成分，效率高，通用性強。但是本方法也存在一定的缺點，比如DNA 條形碼擴增產物的后續(xù)分析和確認需要較昂貴的設備和需要較專業(yè)的技術人員，且克隆測序的時間較長，所以今后在動物源成分的摻假鑒定技術研究方向，亟需開發(fā)一種耗時短、效率高、特異性強的DNA 條形碼擴增產物確認技術手段。