QuEChERS EMR Lipid 凈化結合同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定畜肉中17 種β-受體激動劑

毛銳，林 浩，劉 川，姚 靜，肖全偉，戴 琴

（成都市食品檢驗研究院，國家市場監(jiān)督管理總局重點實驗室（營養(yǎng)與健康化學計量及應用），四川成都 611130）

β-受體激動劑（俗稱“瘦肉精”），是一類具有促腎上腺素功能的人工合成化合物，在醫(yī)學上主要用于治療支氣管哮喘、阻塞性肺炎等病癥[1?2]。該類化合物具有苯乙醇胺母核，根據苯環(huán)上取代基不同，可分為苯酚型（非諾特羅、特布他林、萊克多巴胺、沙丁胺醇、福莫特羅等）和苯胺型（克倫特羅、馬布特羅、溴布特羅、馬噴特羅、克侖潘特等）[3]。β-受體激動劑具有營養(yǎng)物質“再分配效應”，可促進脂肪分解和蛋白質合成，顯著提高家畜瘦肉率[4]，常被不良商家非法用于家畜飼養(yǎng)。人食入β-受體激動劑殘留的畜肉制品后可出現(xiàn)心慌、心悸、惡心、嘔吐等癥狀，造成急、慢性中毒，全國食品安全整頓工作辦公室發(fā)布的整頓辦函〔2010〕50 號已明確將β-受體激動劑類藥物列入食品中可能違法添加的非食用物質名單。

目前β-受體激動劑的常見檢測方法有高效液相色譜法（HPLC）[5]、液相色譜-串聯(lián)質譜法（HPLC-MS/MS）[6?10]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法（GC-MS/MS）[11]、酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）[12?13]。β-受體激動劑代謝后殘留于動物體內的含量非常低，HPLC 檢出限難以滿足檢測要求；GC-MS/MS 測定時需要衍生化，操作繁瑣，影響檢測效率；ELISA 專屬性差，檢測中易出現(xiàn)假陽性；相比之下HPLC-MS/MS 無需衍生，靈敏度高、選擇性強，已成為國內外β-受體激動劑定量分析的主要檢測手段。

苯酚型β-受體激動劑在代謝過程中軛合作用較強，進入動物體內后極易與硫酸或葡萄糖醛酸形成軛合物[14?15]，因此在建立苯酚型β-受體激動劑多殘留分析方法時，需先對樣品進行酶解，將待測物從軛合狀態(tài)轉化為游離態(tài)后再進行提取凈化。畜肉含有豐富的蛋白質，脂肪含量高，樣品基質復雜，常見的凈化方式主要有固相萃取法[16?17]與QuEChERS 凈化法[18?19]，QuEChERS 法無淋洗、洗脫步驟，與固相萃取法相比更簡便、快速，凈化時僅選擇性吸附雜質，不會造成目標分析物損失，在畜肉中β-受體激動劑的檢測上應用越來越廣泛。

增強型脂質去除填料EMR-Lipid 是一種改良的QuEChERS 技術，能高選擇性地去除基質中的脂類雜質，與傳統(tǒng)QuEChERS 法相比更適用于脂肪、蛋白質含量較高的樣品，方法穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。目前已有文獻采用QuEChERS EMR-Lipid 凈化法[20]進行畜肉中β-受體激動劑的檢測，但在定量時多數(shù)文獻采用基質匹配標準曲線法[21]進行結果校正，實際檢測工作中發(fā)現(xiàn)，基質曲線樣品與待測樣品中蛋白質、脂肪等組成不完全相同，β-受體激動劑在不同樣品中的基質效應存在差異，校正效果有限，影響測定結果的準確性。同位素內標與待測物性質相近，二者在前處理及離子化過程中受到的影響基本一致，響應比值穩(wěn)定[22]，采用同位素內標法定量比基質匹配標準曲線法更加準確，但現(xiàn)有文獻[23]在內標品種的選擇上有較大局限性，非同位素內標與待測物在前處理及離子化過程中受到的影響存在差異，對測定結果的校正效果不佳。

為提高β-受體激動劑定量分析的準確性，本研究將QuEChERS EMR-Lipid 凈化法與同位素內標稀釋技術相結合，盡可能多地采用與待測物相對應的同位素內標進行校正，建立了畜肉中17 種β-受體激動劑藥物殘留的液相色譜-串聯(lián)質譜（UPLC-MS/MS）檢測方法，在簡化前處理步驟、提高檢測結果準確性方面具有顯著優(yōu)勢，可滿足食品安全風險監(jiān)測精準定量的技術要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉、豬肉、羊肉樣品 購自當?shù)厥袌?，用料理機攪碎備用；克侖潘特鹽酸鹽、羥甲基克倫特羅、噴布特羅、鹽酸克侖特羅、硫酸特布他林、萊克多巴胺鹽酸鹽、富馬酸福莫特羅、沙丁胺醇、鹽酸班布特羅、非諾特羅鹽酸鹽標準品 純度均≥96%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司；馬噴特羅鹽酸鹽、鹽酸溴布特羅、苯乙醇胺A、氯丙那林、妥布特羅鹽酸鹽、鹽酸馬布特羅、西布特羅標準品 純度均≥99%，德國WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof 公司；馬布特羅-D9鹽酸鹽、班布特羅-D9鹽酸鹽、妥布特羅-D9鹽酸鹽、氯丙那林-D7、噴布特羅-D9鹽酸鹽、特布他林-D9醋酸鹽半水化合物、溴布特羅-D9、苯乙醇胺A-D3、西布特羅-D9標準品 純度均≥99%，德國WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof 公司；萊克多巴胺-D3鹽酸鹽標準品 純度97.0%，加拿大C/D/N Isotopes Inc 公司；克侖特羅-D9、沙丁胺醇-D3標準品 濃度：100 μg/mL，德國Dr.Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈、甲酸 色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；乙酸銨 色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；實驗用水 超純水，由Milli-Q 型超純水儀制備；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶>100.000 Units/mL 上海安譜實驗科技股份有限公司；QuEChERS dSPE EMR-Lipid、QuEChERS Final Polish EMR-Lipid 安捷倫科技有限公司。

AB SCIEX QTRAP 5500 三重四極桿串聯(lián)質譜儀 配有電噴霧離子源（ESI），美國應用生物系統(tǒng)公司；ACQUITYTM UPLC I-Class 超高效液相色譜儀美國沃特世科技公司；CORTECSTMUPLC?C18柱（3.0 mm×100 mm，1.6 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）美國沃特世科技公司；Eppendorf Centrifuge 5810 R 型高速冷凍離心機 德國艾本德股份公司；IKA VORTEX 3 旋渦混勻器 德國艾卡公司；Heidolph 渦旋振蕩器 德國海道爾夫公司；Mettler-Toledo ME204 型電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團；BP211D 型電子分析天平 德國賽多利斯集團；Milli-Q 超純水儀 美國默克集團。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 混合標準溶液的配制：分別稱取適量β-受體激動劑標準品，用甲醇溶解，配制成1 mg/mL 的單一標準儲備液，于?20 ℃冰箱中儲存。取適量各標準儲備液用甲醇稀釋得17 種β-受體激動劑的混合標準溶液。

混合內標溶液的配制：分別稱取適量馬布特羅-D9鹽酸鹽、班布特羅-D9鹽酸鹽、妥布特羅-D9鹽酸鹽、氯丙那林-D7、噴布特羅-D9鹽酸鹽、特布他林-D9醋酸鹽半水化合物、溴布特羅-D9、苯乙醇胺AD3、西布特羅-D9、萊克多巴胺-D3鹽酸鹽標準品，用甲醇溶解，配制成0.5 mg/mL 的單一內標儲備液，于-20 ℃冰箱中儲存。取適量上述內標儲備液及克侖特羅-D9、沙丁胺醇-D3標準品（濃度100 μg/mL），用甲醇稀釋得混合內標溶液。

標準曲線工作液的配制：分別準確量取適量β-受體激動劑混合標準溶液及混合內標溶液，用10%甲醇水溶液逐級稀釋，配制得濃度為0、0.5、1、2、5、10、20 ng/mL 的標準曲線工作液，內標濃度2 ng/mL，臨用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 提取 稱取均勻樣品2 g（精確到0.01 g）置50 mL 離心管中，加入0.2 mol/L 乙酸銨緩沖溶液（pH5.2）5 mL、β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶100 μL，2000 r/min 渦旋振蕩1 min，于37 ℃避光水浴2 h。取出后放置至室溫，加入100 ng/mL 混合內標溶液40 μL、5%甲酸乙腈15 mL，2000 r/min 渦旋振蕩提取20 min，于4 ℃下以9500 r/min 離心5 min，待凈化。

1.2.2.2 凈化 在裝有QuEChERS dSPE EMR-Lipid粉末的離心管中加入5 mmol/L 乙酸銨溶液5 mL，渦旋30 s 使EMR-Lipid 充分混合。將1.2.2.1 中離心后的上清液全部倒入此管，渦旋1 min，于4 ℃下以9500 r/min 離心5 min。精密吸取上清液8 mL 置另一50 mL 離心管中，倒入Final Drying Pouches-MgSO4粉末（約3.5 g），迅速振搖，渦旋1 min，于4 ℃下以9500 r/min 離心5 min。精密吸取3 mL 上清液置離心管中，在50 ℃水浴下氮氣吹干，加入0.4 mL 10%甲醇水，渦旋30 s 復溶，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定[24]。

1.2.3 色譜條件 CORTECS? UPLC?C18柱（3.0 mm×100 mm，1.6 μm）；柱溫：35 ℃；流速：0.2 mL/min；進樣量5.0 μL；流動相A 為5%甲醇水溶液（含0.1%甲酸），B 為甲醇；梯度洗脫程序：0～8.00 min，10%～30% B；8.00～15.00 min，30%～95%B；15.00～18.00 min，95% B；18.00～19.00 min，95%～10% B；19.00～20.00 min，10% B。

1.2.4 質譜條件 電噴霧離子源（ESI）：正離子模式；掃描方式：分時段多反應監(jiān)測（Scheduled MRM，sMRM），監(jiān)測窗口（MRM detection window）：60 s，掃描時間（Target scan time）：0.3 s。電噴霧電壓：5500 V；霧化氣（GS1）壓力：60 psi；輔助氣（GS2）壓力：60 psi；氣簾氣（CUR）壓力：20 psi；離子源溫度：450 ℃；碰撞池入口電壓：10 V；碰撞池出口電壓：13 V。

1.3 數(shù)據處理

采用Analyst 1.6.3 軟件采集數(shù)據，MultiQuant 3.0.2 軟件建立標準曲線、計算結果，Microsoft Excel 2013 處理數(shù)據及繪制圖表。本文基質效應和絕對萃取回收率均采用三個平行樣品計算，以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的優(yōu)化β-受體激動劑是在苯乙醇胺母核上修飾得到的系列化合物，結構相近，分離難度大。本文比較了CORTECS? UPLC?C18柱（3.0 mm×100 mm，1.6 μm）和ACQUITY UPLC BEH C18柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）對17 種β-受體激動劑的分離效果，妥布特羅、溴布特羅、馬布特羅、克侖潘特因極性相近，在BEH C18柱上難以分離，換用粒徑更小的實心核顆粒CORTECS? UPLC?C18柱分離效果更好，且各化合物峰形尖銳（見圖1），因此選用CORTECS? UPLC?C18柱分離17 種β-受體激動劑。

圖1 17 種β-受體激動劑的提取離子流色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatogram of 17 β-receptor agonists

在相同梯度條件下比較了甲醇水、乙腈水兩種流動相體系的分離效果，結果發(fā)現(xiàn)乙腈較甲醇有更強的洗脫能力，在乙腈水系統(tǒng)下β-受體激動劑出峰快，分離度更差，因而選用甲醇水系統(tǒng)。電噴霧離子源正離子模式下，流動相中加入適量甲酸可增強待測組分離子化效率，提高檢測靈敏度，本文以甲醇-0.1%甲酸水作為流動相，調整梯度洗脫程序，盡可能使各組分基線分離，減少組分間離子化競爭。在優(yōu)化后的色譜條件下（見1.2.3）17 種β-受體激動劑分離度良好，均可獲得滿意的檢測靈敏度，優(yōu)化后的譜圖見圖1。

2.1.2 質譜條件的優(yōu)化 電噴霧離子源正離子模式下，用流動注射泵將濃度為200 ng/mL 的17 種β-受體激動劑混合標準溶液以5 μL/min 的流速注入質譜儀，通過Q1全掃描，找出準確的母離子峰，再對母離子施加一定的碰撞能量進行MS2掃描，獲得各自的二級碎片離子，選取2 個信號較強且干擾小的碎片離子與其母離子組成監(jiān)測離子對。在MRM 模式下，分別對去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等質譜參數(shù)進行優(yōu)化。為了提高方法靈敏度，本研究根據17 種β-受體激動劑的保留時間，采用智能時間分段的方法進行多反應監(jiān)測掃描（Scheduled MRM，sMRM），最終確定的離子對信息及質譜參數(shù)見表1。sMRM數(shù)據采集模式可根據每個化合物的保留時間自動調整監(jiān)測窗口，每對離子均有最恰當?shù)难h(huán)時間和駐留時間，能夠顯著提高檢測方法靈敏度[25?26]。

表1 17 種β-受體激動劑的質譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of 17 β-receptor agonists

2.2 酶解條件的確定

GB/T 22286-2008[27]、GB/T 21313-2007[28]測定畜肉中β-受體激動劑時需先將樣品酶解過夜，俞曉蘭等[29]研究表明β-受體激動劑在37 ℃酶解2 h 后水解作用已基本完成，繼續(xù)延長酶解時間對提取效率的影響不顯著，且隨水解時間延長，以特布他林為代表的部分β-受體激動劑水解產物不穩(wěn)定導致測定結果降低。本文參考該文獻將樣品于37 ℃酶解2 h 后再用QuEChERS EMR-Lipid 凈化，與β-受體激動劑日常監(jiān)管常用的檢測方法[27?28]相比，在保證測定結果準確性的基礎上縮短了前處理時間，提高了樣品檢測效率。

2.3 同位素內標的選擇

本文考察了牛肉、豬肉、羊肉加標樣品前處理后17 種β-受體激動劑的絕對萃取回收率，結果見圖2，班布特羅、克倫特羅、羥甲基克倫特羅、氯丙那林、馬布特羅、妥布特羅、溴布特羅、苯乙醇胺A、馬噴特羅、克侖潘特絕對萃取回收率大于60%，其余7 種絕對萃取回收率在46.3%～58.9%之間。同位素內標與待測物化學結構、理化性質相似，在前處理過程中受到的影響基本一致，二者響應比值穩(wěn)定，在絕對萃取回收率不高的情況下仍能保證測定結果的準確性。為實現(xiàn)精準定量分析，本研究在經費許可的情況下，盡可能多地購置與待測物相對應的同位素內標，定量分析時均以自身同位素內標進行計算。非諾特羅、福莫特羅、克侖潘特、馬噴特羅、羥甲基克倫特羅未購得對應的同位素內標，非諾特羅、福莫特羅與萊克多巴胺同屬苯酚型β-受體激動劑，三者具有相近的絕對萃取回收率與基質效應（見圖2、圖3），故以萊克多巴胺-D3作為非諾特羅、福莫特羅的內標?？藖雠颂亍ⅠR噴特羅、羥甲基克倫特羅均為苯胺型化合物，絕對萃取回收率與同為苯胺型的馬布特羅、克倫特羅相近（見圖2），但克倫特羅和羥甲基克倫特羅基質抑制效應較強（見圖3），以克倫特羅-D9作羥甲基克倫特羅的內標可補償基質抑制效應對羥甲基克倫特羅的影響，故選擇克倫特羅-D9為羥甲基克倫特羅的內標，馬布特羅-D9為克侖潘特、馬噴特羅的內標。

圖2 牛肉、豬肉、羊肉樣品中17 種β-受體激動劑的絕對萃取回收率Fig.2 Absolute extraction recovery of 17 β-receptor agonists in beef,pork and mutton

圖3 牛肉、豬肉、羊肉樣品中17 種β-受體激動劑的基質效應Fig.3 Matrix effect of 17 β-receptor agonists in beef,pork and mutton

2.4 基質效應的考察

基質效應（ME）計算方法見公式（1），式中A1為待測物溶于有機溶劑中的峰面積，A2為待測物溶于空白基質溶液中的峰面積，ME 在±20%以內為可接受范圍[30?31]。

基質效應結果見圖3，牛肉、豬肉、羊肉對17 種β-受體激動劑均呈現(xiàn)出基質抑制效應，其中克倫特羅、特布他林ME 絕對值大于20%，具有明顯的基質抑制效應，其余15 種β-受體激動劑ME 絕對值在5.16%～17.9%之間，基質效應較弱，表明QuEChERS EMR-Lipid 法凈化效果良好?？藗愄亓_、特布他林定量分析時均以自身同位素標志物作內標，補償了基質抑制效應對測定結果的影響，提高了定量準確性。

2.5 QuEChERS 法與MCX 固相萃取法凈化及提取效果對比

以牛肉為例，比較QuEChERS 法與MCX 法對17種β-受體激動劑的凈化效果?；|效應對比結果見圖4，兩種前處理方法均呈現(xiàn)基質抑制效應，大多數(shù)β-受體激動劑基質效應不明顯，僅有QuEChERS法克倫特羅和特布他林的ME 絕對值略大于20%，表明兩種前處理方法均有較強的基質干擾去除效果。

圖4 牛肉樣品QuEChERS 法與MCX 法基質效應對比圖Fig.4 Matrix effect comparison between QuEChERS method and MCX method in beef samples

牛肉樣品QuEChERS 法與MCX 法的絕對萃取回收率對比結果見圖5，17 種β-受體激動劑在QuEChERS 法中的萃取回收率普遍高于MCX 法。MCX 柱是混合型陽離子交換柱，具有反相和陽離子交換雙重保留性能，對非極性的堿性化合物具有更高的選擇性。MCX 柱凈化需經歷上樣、淋洗、洗脫過程，17 種β-受體激動劑母體結構中苯環(huán)上取代基不同，極性與堿性各有差異，在MCX 柱上呈現(xiàn)出不同的保留特性，同一凈化條件下理化性質差異大的化合物易在淋洗中損失或在洗脫中流出不完全，難以兼顧所有化合物的絕對萃取回收率，MCX 凈化下噴布特羅、苯乙醇胺A、福莫特羅的絕對萃取回收率僅有12.3%、16.4%、27.2%。QuEChERS 法使用的EMRLipid 是一種新型吸附材料，該吸附劑結合體積排阻和疏水作用兩種機制，能高選擇性地去除基質中的脂類雜質，凈化時僅有雜質吸附與脫水過程，不會造成目標分析物損失，對17 種β-受體激動劑能提供更為均衡的絕對萃取回收率，最低絕對萃取回收率也能達到46.3%，與MCX 法相比更適用于多殘留的同時檢測，因而本研究選用QuEChERS EMR-Lipid 法進行樣品前處理。

圖5 牛肉樣品QuEChERS 法與MCX 法絕對萃取回收率對比圖Fig.5 Absolute extraction recovery comparison between QuEChERS method and MCX method in beef samples

2.6 方法學考察

2.6.1 線性范圍與檢出限 取標準曲線系列工作液進樣測定，以標準品與相應內標的峰面積比為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程。采用逐步稀釋法，以3 倍信噪比（S/N）為檢出限，10 倍信噪比（S/N）為定量限，結果見表2。17種β-受體激動劑在0～20 ng/mL 范圍內線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.99，檢出限為0.01～0.09 μg/kg，定量限為0.05～0.31 μg/kg，可滿足檢測要求。

表2 17 種β-受體激動劑線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Linear equation,correlation coefficient,LOD,LOQ of 17 β-receptor agonists

2.6.2 回收率與精密度 選擇豬肉、牛肉、羊肉陰性樣品，以低（0.5 μg/kg）、中（2.0 μg/kg）、高（5.0 μg/kg）三個濃度進行加標回收試驗，每個濃度水平各6 份，按照1.2.2 項下方法處理樣品后進樣測定，計算方法回收率與精密度，結果如表3 所示，3 個濃度水平下，豬肉樣品中17 種β-受體激動劑的平均回收率為83.1%～109.3%，相對標準偏差為0.8%～9.8%，牛肉樣品中17 種β-受體激動劑的平均回收率為81.7%～111.8%，相對標準偏差為1.0%～10.2%，羊肉樣品中17 種β受體激動劑的平均回收率為86.5%～111.6%，相對標準偏差為1.0%～10.3%。本方法具有較好的準確度和精密度，可滿足畜肉中17 種β-受體激動劑的檢測要求。12 種以自身同位素標志物作內標的β-受體激動劑平均回收率在91.4%～111.8%之間，與部分已有方法[10,23]相比準確度更高，定量更為精準可靠。

表3 17 種β-受體激動劑回收率及精密度（n=6）Table 3 Recoveries and RSD of 17 β-receptor agonists (n=6)

2.7 實際樣品測定

采用本文建立的方法對100 批市售生鮮畜肉中17 種β-受體激動劑進行檢測，其中豬肉31 批，牛肉38 批，羊肉31 批，結果均為未檢出，暫未發(fā)現(xiàn)生鮮畜肉中β-受體激動劑殘留風險，與GB/T 22286-2008《動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留量的測定 液相色譜串聯(lián)質譜法》檢測結果一致。

3 結論

本研究采用QuEChERS EMR-Lipid 凈化法及同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術建立了畜肉中17 種β-受體激動劑藥物殘留的檢測方法。酶解2 h 后的樣品經QuEChERS EMR-Lipid 凈化，前處理步驟簡便，凈化效果良好，有效消除了基質效應影響，同時縮短酶解時間，提高了樣品檢測效率。采用同位素內標法定量，補償了樣品前處理過程對測定結果的影響，17 種β-受體激動劑在0～20 ng/mL 范圍內線性關系良好，3 個加標濃度水平下平均回收率為81.7%～111.8%，RSD 為0.8%～10.3%，檢出限為0.01～0.09 μg/kg，定量限為0.05～0.31 μg/kg，定量精準可靠，適用于大批量畜肉樣品中多種β-受體激動劑藥物殘留的同時檢測，為動物源性食品風險監(jiān)測提供了技術支持，具有廣闊的應用前景。