基于ICP-MS 和HS-GC-IMS 分析3 種黃精中的無機元素及VOCs 差異

曾珠亮，劉人源，李 權(quán)

（1.凱里學(xué)院大健康學(xué)院，貴州凱里 556011；2.宿遷學(xué)院，江蘇宿遷 223800）

黃精（Polygonatumspp.）為百合科黃精屬多年生草本植物，是多花黃精、雞頭黃精、滇黃精等干燥根莖的總稱[1?2]，又稱貓兒姜、山生姜、老虎姜、救荒草、野生姜等，主要分布于除南方熱帶以外的亞熱帶與溫帶地區(qū)。黃精是傳統(tǒng)的滋補良藥，可藥食兼用，不僅營養(yǎng)價值高，還具有抗氧化、抗菌、抗衰老等功效[3?5]。黃精在藥食同源方面有著非常重要的作用和應(yīng)用前景[6]。一般姜形黃精主產(chǎn)于四川盆地[7]，云南的品種主要是大黃精和雞頭黃精[8]，貴州、湖南和廣西等地則主產(chǎn)雞頭黃精和姜形黃精。《中國藥典》收載黃精為多花黃精（Polygonatum cyrtonema）、滇黃精（Polygonatum kingianum）、雞頭黃精（Polygonatum sibiricum）等三種植物為其原生藥，民間藥用種類更為普遍，大約有幾十個種被應(yīng)用。植物體內(nèi)的無機元素也就是礦質(zhì)元素，是人和動物體不可缺少的成分。不同產(chǎn)地和品種黃精的無機元素，化學(xué)成分及風(fēng)味等存在差異，可影響其藥用和食用價值[9?10]。探究不同產(chǎn)地和品種黃精的無機元素和風(fēng)味物質(zhì)，對明確其化學(xué)成分、風(fēng)味差異和品質(zhì)優(yōu)劣的鑒別具有重要的理論意義和實踐價值。

常規(guī)的元素檢測如原子吸收分光光度法、原子熒光光譜法等存在操作復(fù)雜、效率低、精度低等缺點，電感耦合等離子體-質(zhì)譜（Inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）具有靈敏度高、干擾小、線性范圍寬等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用于生態(tài)環(huán)境、食品安全、制藥等領(lǐng)域[11?12]。國內(nèi)外常用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）定性和定量果蔬及藥材的香氣成分[13?15]。但藥材中揮發(fā)性氣味物質(zhì)濃度通常較低，大多數(shù)風(fēng)味物質(zhì)的含量在ppb 級[16]，目前的檢測技術(shù)如GC、GC-MS 需要固相微萃取的方式進(jìn)行樣品前處理，熱敏性樣品在加熱后風(fēng)味成分會發(fā)生變化，儀器檢測到的結(jié)果并非樣品原有真實的氣味[17]。而頂空-氣相色譜-離子遷移譜（Headspace-gas chromatography-ion mobility spectrometry，HS-GC-IMS）是一種高靈敏度、簡易快捷、低檢測限的檢測技術(shù)，融合了GC 突出的分離特點和IMS 快速響應(yīng)、高靈敏度的優(yōu)勢，可用于對植物揮發(fā)性有機物（VOCs）的鑒定并繪制指紋圖譜[18]。目前利用ICP-MS 和HS-GC-IMS 技術(shù)系統(tǒng)性研究不同品種黃精中的無機元素及VOCs 差異還鮮有報道。

本文選取材料采集自貴州種植栽培面積較大的4 個主產(chǎn)地（分別為凱里市、雷山縣、鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣、黃平縣）且商業(yè)價值高并具有一定的代表性的3 種黃精（多花黃精、滇黃精和雞頭黃精）為研究對象，采用ICP-MS 和HS-GC-IMS 技術(shù)分析鑒定黃精的無機元素及VOCs 組成，可為黃精的質(zhì)量安全、藥理研究及鑒別工作提供判斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

安捷倫多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液 NCS185041，鋼研納克檢測技術(shù)股份有限公司；硝酸 分析級，美國默克公司，由酸純化器二次純化；過氧化氫溶液 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；凱里市下司鎮(zhèn)的凱里市多花黃精（KL）、雷山縣丹江鎮(zhèn)的雷山縣多花黃精（LS）、鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣羊場鎮(zhèn)的鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣滇黃精（ZY）、黃平縣舊州鎮(zhèn)的黃平縣雞頭黃精（HP）共4 個產(chǎn)地3 個品種 采集時間為2021 年10 月中下旬。黃精采挖后，去掉莖葉，洗凈泥沙，除去須根，洗凈去皮后置于40 ℃烘箱中烘干至含水率為6%。

iCAPQ 型電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀 美國Thermo Scientific 公司；SINEO MDS-6G 型微波消解儀 湖南譜發(fā)科技發(fā)展有限公司；FlavourSpec?風(fēng)味分析儀 德國G.A.S.公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃精中無機元素測定方法 取黃精用粉碎機進(jìn)行粉碎，過60 目篩，收集粉碎過的樣品，待測定。采用減重稱量法稱取黃精樣品約0.2 g，放入微波消解內(nèi)罐中，加入8 mL 硝酸，蓋上蓋子放置過夜。擰緊罐蓋，放置于微波消解儀中消解，微波消解工作參數(shù)見表1 所示，最終超純水洗至容量瓶中，定容至10 mL。同時做空白實驗，平行實驗3 次。

表1 微波消解工作參數(shù)Table 1 Working parameters for microwave digestion

按照GB 5009.268-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測定》[19]，采用微波消解ICP-MS 法測定黃精中的硼、鈉、鎂、鋁、鉀、鈣、鈦、釩、鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、砷、硒、鍶、鉬、鎘、錫、銻、鋇、鉈、鉛、鋰共26 種元素含量。ICP-MS 條件：射頻功率1100 W，等離子體氬氣流速15 L/min，輔助氣流速1.0 L/min，霧化器氣體流速0.855 L/min，采樣錐孔徑1.0 mm，截取錐孔徑0.8 mm，樣品提升速度0.6 mL/min，進(jìn)樣沖洗時間30 s，蠕動泵轉(zhuǎn)速20 r/min，掃描次數(shù)3 次，駐留時間50 ms，采集時間3600 ms，模式為碰撞反應(yīng)模式。樣品中待測元素含量的計算公式：

式中：X 為試樣中待測元素含量（mg/kg）；ρ為試樣中所測元素質(zhì)量濃度（mg/L）；ρ0為空白試樣所測元素質(zhì)量濃度（mg/L）；V（mL）為消化液定容體積（mL）；f 為試樣稀釋倍數(shù)（本實驗稀釋倍數(shù)為1 倍）；m 為稱取質(zhì)量（g）。

1.2.2 黃精中VOCs 測定方法 將待測黃精切成寬1 mm 的薄片，稱重2 g 樣品，分別裝入4 個20 mL 萃取瓶中，然后快速密封，上部留有約2 cm 左右的空間，封口。經(jīng)頂空進(jìn)樣500 μL，用GC-IMS 進(jìn)行測試，每種樣品做3 次生物學(xué)重復(fù)。氣相色譜（GC）條件：柱溫80 ℃，運行時間59 min，采用正離子模式檢測，高純N2做漂移氣，IMS 溫度45 ℃，孵化溫度90 ℃，孵化時間15 min，進(jìn)樣體積500 μL，進(jìn)樣針溫度85 ℃，孵化轉(zhuǎn)速500 r/min，載氣程序為00:00，2 mL/min；02:00，2 mL/min；10:00，10 mL/min；20:00，100 mL/min；59:00，150 mL/min[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制表。使用GC-IMS儀器配套的分析軟件VOCal，用于查看分析譜圖和數(shù)據(jù)的定性定量，應(yīng)用軟件內(nèi)置的美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所數(shù)據(jù)庫（NIST 數(shù)據(jù)庫）和IMS 數(shù)據(jù)庫可對物質(zhì)進(jìn)行定性分析并按照每種物質(zhì)峰所占總峰面積的百分比進(jìn)行相對定量。Reporter 插件直接對比樣品之間的譜圖差異（三維譜圖、二維俯視圖和差異譜圖）；Dynamic PCA 插件對樣品進(jìn)行動態(tài)主成分分析，用于將樣品聚類分析和相似度分析，以及快速確定未知樣品揮發(fā)物質(zhì)的種類。運用Gallery Plot 插件對比不同樣品之間的VOCs 指紋圖譜差異。使用SPSS 21.0 進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯多重檢驗評估各參數(shù)之間的差異，P<0.05 表示顯著性差異，所有試驗數(shù)據(jù)均為三次生物學(xué)重復(fù)的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種黃精中26 種無機元素含量及其主成分分析

2.1.1 無機元素含量差異分析 黃精中不同無機元素含量測定結(jié)果見表2。Na、Mg、Al、K、Ca、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Zn、As、Se、Sr、Mo、Cd、Ba、Pb 在KL、LS、ZY、HP 這4 個產(chǎn)地3 個品種中差異顯著（P<0.05）。從常量元素看，K 的含量最高，各品種間差異大，在KL、LS、ZY、HP 中分別為5264.7850、4522.3190、7476.0310 和12358.2600 mg/kg，其次含量較高的元素為Ca、Mg、Fe、Al、Ba、Mn、Zn 和Na，這9 種元素含量在KL、LS、ZY、HP 中分別占26 種所測元素總含量的99.73%、99.74%、99.80%、99.85%。B、Ti、Ni、Cu 和Sr（KL、LS、ZY、HP）共5 種元素在樣品中的含量達(dá)到1～13 mg/kg，含量在0.1～1.0 mg/kg 之間的元素有V、Cr、Mo、Cd、Co（ZY）、Pb 和Li，含量低于0.1 mg/kg 的元素有Co（KL、LS、HP）、As（KL、LS、HP）、Se（LS、ZY、HP）、Sn 和Sb，只有Tl 元素沒有被檢出。參考2020年版《中國藥典》對黃精等藥材通過ICP-MS 測定的重金屬及有害元素限量值Pb≤5 mg/kg、Cd≤1 mg/kg、As≤2 mg/kg 和Cu≤20 mg/kg 的規(guī)定，本試驗測定的4 個產(chǎn)地3 種黃精樣品中的Pb、Cd、As 和Cu 含量均達(dá)標(biāo)[21]。對于相同品種的KL 和LS，在Ti、Cu 兩種元素差異不顯著，其他24 種元素相對含量的差距較小。本研究采用的方法相比傳統(tǒng)的原子吸收分光光度法、原子熒光光譜法等要更加快速準(zhǔn)確、靈敏度高、便捷高效，與樓柯浪等[22]對17 個產(chǎn)地多花黃精中11 種元素含量的主成分及相關(guān)性分析的結(jié)果相比，雖本研究選擇的黃精的產(chǎn)地不如其覆蓋的范圍廣，但測定黃精品種更多，除了多花黃精還比較了滇黃精與雞頭黃精，并且檢測的無機元素種類更多，研究結(jié)果排除了黃精中可能存在的重金屬等有害元素富集超標(biāo)的問題。同時發(fā)現(xiàn)不同品種黃精的無機元素含量也有一定差異，多花黃精Ca、Zn，滇黃精的Na、Fe，雞頭黃精的Mg、K 等有益元素方面含量更高，其可能原因是與不同品種的生長基質(zhì)及其對各元素吸附能力、自身代謝的差異有關(guān)。

表2 三種黃精的無機元素含量測定結(jié)果Table 2 Results of content determination of various inorganic elements

2.1.2 無機元素主成分分析 本研究采用SPSS 26.0 軟件對3 種黃精中的25 種含量不同的無機元素（排除未檢出的Tl）進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如表3，以特征值大于1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到3 個主成分，累計方差貢獻(xiàn)率為100.000%，表明前3 個主成分可以代表元素原始數(shù)據(jù)信息，故選取前3 個成分進(jìn)行分析。由表3 可知，在第1 主成分中起正向作用且具有較大載荷的元素為Na、Al、V、Fe、Co、As、Cd、Sb、Pb、Li，對第1 主成分起負(fù)向作用且載荷較大的元素為B、Mg、Cr、Ni、Mo，說明第1 主成分大時，Na、Al、V、Fe、Co、As、Cd、Sb、Pb、Li 含量升高，而B、Mg、Cr、Ni、Mo 含量降低，其他元素含量基本不變；第2 主成分具有較高正向載荷的元素為Ca、Ti、Mn、Zn、Sr、Sn、Ba，具有絕對值較高負(fù)向載荷的元素為K 和Cu，說明第2 主成分大時，Ca、Ti、Mn、Zn、Sr、Sn、Ba 含量也變大，而K 和Cu 含量降低，其他元素含量變化較?。坏? 主成分具有較高正向載荷的元素為Se，主要反映黃精中Se 信息，其他元素影響較小。

表3 成分載荷矩陣、特征值、方差貢獻(xiàn)率和累積方差貢獻(xiàn)率Table 3 Component load matrix,eigenvalue,variance contribution rate and cumulative variance contribution rate in Polygonatum spp.

參考董喆等[23]對25 種元素提取的3 個代表性的主成分進(jìn)行數(shù)學(xué)評價模型構(gòu)建，最后根據(jù)獲得綜合評價函數(shù)計算出各產(chǎn)地品種黃精無機元素的綜合評價分值，分值越高，質(zhì)量越好。各主成分得分及綜合得分見表4。由表4 可知，凱里市多花黃精綜合得分最高、質(zhì)量最好，其次為鎮(zhèn)遠(yuǎn)縣滇黃精和雷山縣多花黃精，黃平縣雞頭黃精綜合得分最低、質(zhì)量最差。

表4 各主成分得分及綜合得分Table 4 Score of each principal component and comprehensive score

2.2 不同產(chǎn)地3 種黃精的VOCs 差異及其主成分分析

2.2.1 3 個品種黃精的GC-IMS 譜圖 利用多元數(shù)據(jù)分析工具LAV 軟件中的Reporter 插件程序?qū)悠纷鞣治?，生? 個產(chǎn)地3 種黃精樣品的VOCs 三維對比圖。將VOCs 以指紋圖譜的形式展示出來，通過三維圖讓黃精的風(fēng)味分析實現(xiàn)了可視化并展現(xiàn)出各樣品之間的差異[24]。圖1 為不同產(chǎn)地黃精揮發(fā)性風(fēng)味化合物的保留時間、漂移時間和信號強度的三維地形圖，其顯示了所有化合物的原始信息，從中可確定樣品中每種揮發(fā)性風(fēng)味化合物的信號峰值強度和峰值位置，HS-GC-IMS 可很好地分離黃精揮發(fā)性成分。

圖1 黃精的氣相色譜離子遷移譜三維地形圖Fig.1 3D Spectra of Polygonatum spp.by GC-IMS

圖2 為3 種黃精的二維GC-IMS 譜圖，因其更加直觀、易于閱讀，可準(zhǔn)確提供關(guān)于VOCs 信息特征和強度的全面圖像。圖2 橫坐標(biāo)左側(cè)處紅色豎線為反應(yīng)離子峰（RIP 峰，經(jīng)歸一化處理），根據(jù)色點的有無，顏色的深淺和面積大小能直觀地看出3 種樣品的組分和濃度差異。由圖2 可知，4 個產(chǎn)地3 種黃精樣品的VOCs 可以通過GC-IMS 技術(shù)得到較好的分離和檢測，3 種樣品的VOCs 種類差異不大，但相對含量卻有較大差異。

圖2 黃精的氣相色譜離子遷移譜二維圖Fig.2 2D Spectra of Polygonatum spp.by GC-IMS

為了更加明顯地觀察差異，采用4 個產(chǎn)地3 種黃精的氣相色譜離子遷移譜差異對比模式[25]。選取KL樣品譜圖為參照作為參比，其他3 種樣品的譜圖扣減參比。當(dāng)二者VOCs 一致，則扣減后的背景為白色，紅色表明該物質(zhì)的濃度高于參比，藍(lán)色代表該物質(zhì)的濃度低于參比。如圖3 所示，差異圖中更容易看出不同品種黃精VOCs 的差異，其中KL 和LS 較為相似。

圖3 三種黃精的氣相色譜離子遷移譜差異圖Fig.3 Difference diagram of three kinds of Polygonatum spp.by GC-IMS

2.2.2 3 種黃精成分的鑒定及VOCs 氣味指紋圖譜對比 從4 個產(chǎn)地3 種樣品中共檢測出159 種待分析峰，鑒定出其中的101 種VOCs（含單體、二聚體與三聚體）（見表5 所示）。黃精的化學(xué)成分是其藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。黃精成熟后會產(chǎn)生各種揮發(fā)性有機物[26]，其中醛類物質(zhì)含量最高，醇類物質(zhì)含量次之，酸類、酯類、酮類等物質(zhì)也占有一定比例。4 個產(chǎn)地3種黃精中的主要物質(zhì)均為己醛，并可能與黃精的清香有關(guān)。在KL、LS、ZY、HP 中的占比分別為21.55%、17.54%、19.50%和20.02%，占比差異可能與其生長的外界環(huán)境條件和品種有關(guān)。

表5 黃精中揮發(fā)性有機物定性結(jié)果Table 5 Qualitative results of volatile organic compounds of Polygonatum spp.

通過Gallery Plot 插件指紋圖譜對比，直觀且定量地比較不同樣品之間的揮發(fā)性有機物差異[27?28]。從圖4 可直觀地看出3 種黃精完整的VOCs 信息以及各樣品之間的明顯差異，每種樣品都含有各自含量較高的成分。除了己醛外，丙醛、丁烷-2-酮、丙烯醛、2-甲基丁醛、乙醇、戊醛、庚醛、（E）-2-己烯醛、2-戊基呋喃、1-戊醇、己酸乙酯、壬醛和乙酸等物質(zhì)在三種黃精中的相對含量均較高，其中（E）-2-己烯醛具有新鮮綠葉和水果香味；己酸乙酯具有曲香型和菠蘿香型的香氣；3-甲基-2-丁醇僅在KL 中被發(fā)現(xiàn)；1,4-二惡烷和4-甲基噻唑僅在LS 中被發(fā)現(xiàn)；2-甲基-2-戊烯醛和異戊醇僅在ZY 中被發(fā)現(xiàn)；α-蒎烯D、α-蒎烯T 和β-蒎烯D 僅在HP 中被發(fā)現(xiàn)。黃精中所含的風(fēng)味成分是次生代謝產(chǎn)物，在其生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，這些物質(zhì)含量的不同是導(dǎo)致3 種黃精風(fēng)味差異的主要原因。

圖4 黃精的VOCs 指紋圖Fig.4 The fingerprint of volatile organic compounds of Polygonatum spp.

陳龍勝等[29]采用GC-MS 從9 個不同產(chǎn)地的多花黃精中鑒定出67 個化合物，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地多花黃精揮發(fā)性物質(zhì)組成差異性較大。本研究采用的GCIMS 檢測出的VOCs 不僅更多，而且方法快速準(zhǔn)確、靈敏度高、便捷高效，可為不同品種黃精的風(fēng)味識別、質(zhì)量評價和品質(zhì)控制提供重要的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。本研究結(jié)果證實了產(chǎn)地與外界環(huán)境等能夠影響不同品種黃精VOCs 物質(zhì)的生成和積累，不僅為不同藥材的風(fēng)味識別、質(zhì)量評價和品質(zhì)控制提供了重要的理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持，還為不同品種黃精質(zhì)量的大數(shù)據(jù)甄別提供了一種新的思路，對感官品控的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展具有積極的推動作用。

2.2.3 VOCs 的主成分分析 利用PCA 分析法降維處理數(shù)據(jù)，可以直觀地比較樣品間的相似度以及VOCs 差異。由圖5 可知，各樣品均能較好地分離，沒有出現(xiàn)重疊，證明GC-IMS 可有效區(qū)分不同品種黃精樣品中的VOCs。PC1，PC2 和PC3 的貢獻(xiàn)解釋了總變異的90%，KL 與LS 在圖中距離更近，說明KL 的VOCs 和LS 更為接近，并且不同品種樣品可以明顯區(qū)分開來，證明不同品種黃精的VOCs 有明顯的區(qū)別。相對而言，而ZY 的VOCs 與LS 的差別較大。

圖5 黃精樣品的三維主成分分析（PCA）圖Fig.5 Three-dimensional principal component analysis（PCA）graphs of Polygonatum spp.

3 結(jié)論

本研究建立電感耦合等離子體-質(zhì)譜（ICP-MS）法測定了4 個不同產(chǎn)地多花黃精、滇黃精、雞頭黃精藥材中26 種無機元素的含量，并對測定結(jié)果進(jìn)行了分析。研究發(fā)現(xiàn)K、Ca、Mg、Fe、Al、Ba、Mn、Zn、Na 和Sr（KL）含量超過10 mg/kg，測定的4 個產(chǎn)地3 種黃精樣品中Pb、Cd、As 和Cu 含量均符合2020年版《中國藥典》對黃精中重金屬及有害元素限量值的規(guī)定。無機元素主成分分析篩選出了影響黃精質(zhì)量的3 個主成分因子，通過綜合得分評估了黃精整體質(zhì)量的差異,樣品中得分最高、質(zhì)量最好的是凱里市多花黃精，得分比較低的是黃平縣雞頭黃精。通過主成分分析、氣味指紋圖譜分析可以將不同品種黃精的無機元素和VOCs 做明顯區(qū)分。4 個產(chǎn)地3 種黃精中共鑒定出101 種有機化合物（含單體、二聚體與三聚體），主要是醛類、醇類、酸類、酯類和酮類等物質(zhì)。3 種黃精的VOCs 組成存在一定差異，己醛在4 個產(chǎn)地3 種黃精中的占比最大。丙醛、丁烷-2-酮、丙烯醛、2-甲基丁醛、乙醇、戊醛、庚醛、（E）-2-己烯醛、2-戊基呋喃、1-戊醇、己酸乙酯、壬醛和乙酸等物質(zhì)在三種黃精中的相對含量均較高。3-甲基-2-丁醇僅在KL 中被發(fā)現(xiàn)；1,4-二惡烷和4-甲基噻唑僅在LS 中被發(fā)現(xiàn)；2-甲基-2-戊烯醛和異戊醇僅在ZY中有被發(fā)現(xiàn)；α-蒎烯D、α-蒎烯 T 和β-蒎烯 D 僅在 HP中有被發(fā)現(xiàn)。KL 和LS 的物質(zhì)種類和濃度差異最小，而ZY 與LS 的差異最大。產(chǎn)地和品種對黃精中無機元素含量和風(fēng)味物質(zhì)種類會造成一定差異，具體原因可能是不同環(huán)境氣候條件和不同品種的黃精對不同元素的吸附能力以及黃精自身代謝差異有關(guān)。