雞骨架和雞胸肉復(fù)合底物酶解工藝優(yōu)化及產(chǎn)物呈味特性研究

李自會(huì)，段曉杰,, ，劉昆侖，布冠好, ，王 亮，張順棠，井金鋒，任 偉

（1.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南鄭州 450001；2.蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股份有限公司，河南項(xiàng)城 466200）

我國作為雞肉生產(chǎn)大國，2020 年雞肉產(chǎn)量達(dá)到了1865.6 萬噸，2021 年上半年，雞肉產(chǎn)量同比增長10.8%[1]。雞骨是雞肉加工過程中的副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量達(dá)16.3%，為畜禽骨肉蛋白質(zhì)之最[2]。此外，雞骨架中鮮味氨基酸（18.37%）和含硫氨基酸（1.22%）含量較高，是生產(chǎn)雞肉風(fēng)味基料的理想原料[3]。目前，雞骨主要作為寵物飼料或直接被丟棄，利用率低。如何將雞骨進(jìn)行深加工，提高產(chǎn)品附加值，對(duì)于低值禽骨的開發(fā)具有重要意義。

蛋白在蛋白酶的作用下被水解成小肽或氨基酸的過程稱作蛋白的酶解[4]。酶解主要有反應(yīng)條件溫和、專一性強(qiáng)、安全性高以及能耗低等優(yōu)點(diǎn)，已成為食品加工領(lǐng)域中提高蛋白質(zhì)價(jià)值的有效方法[5?6]。肉類蛋白經(jīng)酶解后可生成大量游離氨基酸和小肽，其組成和含量變化顯著影響酶解液的呈味特點(diǎn)。楊波等[7]研究發(fā)現(xiàn)，隨著酶解時(shí)間的延長，脫脂蠶蛹蛋白酶解物中苦味氨基酸含量不斷增加，一些苦味氨基酸有增強(qiáng)酶解液呈味復(fù)雜性的作用；多數(shù)鮮味氨基酸以肽的形式存在于酶解液，更加有利于產(chǎn)生鮮味肽。這些經(jīng)酶解后產(chǎn)生的呈味肽和呈味氨基酸等，可用于制備呈味基料[8]。目前研究者多以雞肉或雞骨架單一底物酶解制備調(diào)味基料。張永生等[9]利用復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶同步酶解（酶配比1:1）雞胸肉，制得的酶解液苦味輕柔，有濃郁雞肉味和鮮味。趙永珍等[10]以雞骨為原料，采用風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶2:1 酶解制備的產(chǎn)物總體風(fēng)味較好。以雞肉為底物得到的產(chǎn)品香味濃郁，但是成本較高；而酶解雞骨架生產(chǎn)呈味基料，成本相對(duì)低，但風(fēng)味較淡[11]。因此，針對(duì)酶解單一底物存在的弊端，研究一種以雞胸肉和雞骨架為復(fù)合底物酶解制備呈味基料的工藝，在實(shí)現(xiàn)提升產(chǎn)品風(fēng)味的同時(shí)可以降低生產(chǎn)成本。

本研究采用雞骨架和雞胸肉作為復(fù)合底物，選用不同的蛋白酶進(jìn)行酶解，通過考察水解度和酶解產(chǎn)物感官評(píng)價(jià)，確定復(fù)配酶的最佳酶解工藝條件，并分析了酶解產(chǎn)物中的游離氨基酸及肽分子量分布變化規(guī)律，為風(fēng)味濃郁、安全營養(yǎng)的調(diào)味品研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮雞骨架、雞胸肉 購于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；木瓜蛋白酶（Papain，8×105U/g）、菠蘿蛋白酶（Bromelain，6×105U/g）、堿性蛋白酶（Alcalase，2×105U/g）北京Solarbio 公司；中性蛋白酶（Neutrase，0.8 AU/g）、復(fù)合蛋白酶（Protamex，1.6 AU/g）、風(fēng)味蛋白酶（Flavourzyme，500 LAPU/g）丹麥諾維信公司；水合茚三酮 上海麥克林生化科技有限公司；細(xì)胞色素 C（Mw=12384 Da）、抑肽酶（Mw=6511 Da，3 TIU/mg）、桿菌肽（Mw=1422 Da）、乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸（Mw=451 Da）、乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸（Mw=189 Da）美國Sigma 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

SP36S 攪拌機(jī) 浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司；PHS-3E pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；HSHZ-B 水浴搖床 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；TDL-5-A 離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；722s 可見分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；Waters 2695 高效液相色譜儀 美國Waters 公司；S-433（D）氨基酸分析儀 德國Sykam。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 新鮮的雞骨架、雞胸肉清洗干凈，去除雞骨架表面的雞皮、雞油以及附著的雞肉等。將雞骨架與雞胸肉按一定比例混合，放入殺菌鍋中130 ℃蒸煮60 min，然后放入攪拌機(jī)進(jìn)行粉碎，即為雞肉糜。

1.2.2 酶解工藝 將雞肉糜與蒸餾水按1:2 g/mL 比例均勻混合，調(diào)節(jié)至每種酶適宜的溫度及pH，添加0.2%蛋白酶（以雞肉糜質(zhì)量計(jì)）酶解3 h；滅酶（90 ℃，15 min）；冷卻后調(diào)節(jié)pH 至中性，取部分酶解液離心20 min，轉(zhuǎn)速為4000 r/min；收集上清液測(cè)定水解度，剩余的冷凍干燥用于感官評(píng)價(jià)。

1.2.3 單一酶的篩選 選取木瓜蛋白酶（pH6.5，50 ℃）、菠蘿蛋白酶（pH6.5，50 ℃）、中性蛋白酶（pH7.0，50 ℃）、復(fù)合蛋白酶（pH8.0，50 ℃）、堿性蛋白酶（pH8.0，50 ℃）和風(fēng)味蛋白酶（pH8.0，50 ℃），在各酶適宜的溫度和pH 條件下進(jìn)行酶解，考察蛋白酶對(duì)水解度及酶解物感官評(píng)價(jià)的影響。

1.2.4 復(fù)配酶的篩選 根據(jù)單一酶篩選結(jié)果，選取產(chǎn)物風(fēng)味較好的蛋白酶與其他五種蛋白酶分別復(fù)配（酶配比1:1），考察復(fù)配酶對(duì)水解度和酶解物感官特征的影響。

1.2.5 復(fù)配酶酶解單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 底物比例 將雞骨架:雞胸肉按9:1、8:2、7:3、6:4、5:5 的比例分別混合處理，固定料液比為1:2，添加0.2%酶配比為1:1 的復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解，在50 ℃、pH8.0 條件下酶解3 h，通過考察酶解物水解度和整體風(fēng)味，確定最佳底物比例。

1.2.5.2 酶配比 選擇上述確定的底物比例，復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶配比分別為3:1、2:1、1:1、1:2、1:3，其他酶解條件保持不變，以水解度和整體風(fēng)味為指標(biāo)，選擇最優(yōu)酶配比。

1.2.5.3 料液比 選定最優(yōu)底物比例和酶配比，在料液比1:1、1:2、1:3、1:4、1:5（g/mL）的條件下分別酶解3 h，根據(jù)測(cè)定酶解物水解度和整體風(fēng)味結(jié)果，確定最佳料液比。

1.2.5.4 酶解溫度 固定上述最佳底物比例、酶配比以及料液比，酶解溫度選擇45、50、55、60、65 ℃五種不同水平，其他酶解條件不變，根據(jù)酶解液水解度及所得酶解物風(fēng)味評(píng)價(jià)結(jié)果，確定最佳酶解溫度。

1.2.5.5 酶解pH 在其他酶解條件固定的情況下，選擇pH 為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5 分別進(jìn)行酶解，根據(jù)酶解液水解度和酶解物風(fēng)味結(jié)果，確定最佳酶解pH。

1.2.5.6 加酶量 選擇上述最佳酶解條件，加酶量為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%，在其他酶解條件保持不變的情況下分別進(jìn)行酶解，考察酶解物水解度和整體風(fēng)味評(píng)分，確定最佳加酶量。

1.2.5.7 酶解時(shí)間 保持上述所選酶解條件不變，酶解時(shí)間選擇1、2、3、4、5 h 不同水平，通過考察酶解產(chǎn)物水解度和整體風(fēng)味評(píng)分，確定最佳酶解時(shí)間。

1.2.6 復(fù)配酶正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取料液比、酶解溫度、加酶量及酶解時(shí)間4 個(gè)因素作為研究對(duì)象，以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)。水平及因素選取如表1 所示。

表1 復(fù)配酶酶解正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factor level of orthogonal experiment of enzymatic hydrolysis of complex enzyme

1.2.7 水解度測(cè)定方法 利用茚三酮比色法[12]測(cè)定水解度。將酶解液稀釋一定倍數(shù)后，吸取1 mL 于25 mL 比色管中，然后加入1 mL 的pH8.0 的磷酸鹽緩沖液和1 mL 的茚三酮混合均勻，沸水浴煮沸15 min，立即冷卻至室溫，定容至25 mL，搖勻，靜置15 min 后在波長570 nm 處測(cè)定其吸光度值。按照公式（1）計(jì)算水解度。

1.2.8 感官評(píng)價(jià)方法 感官評(píng)價(jià)采用5 分制評(píng)分法，由7 個(gè)經(jīng)感官評(píng)價(jià)培訓(xùn)的食品專業(yè)人員對(duì)雞肉酶解物的滋味（包括鮮味、咸味、苦味、酸味、整體風(fēng)味）及風(fēng)味特征進(jìn)行評(píng)價(jià)（表2）。標(biāo)準(zhǔn)品分別為0.25%味精、0.5%氯化鈉、0.05%咖啡因、0.025%檸檬酸，滋味標(biāo)準(zhǔn)品記為5 分。取1 g 凍干后的酶解物，加入100 mL純凈水混合均勻，與4 種標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行比較打分。取評(píng)分的平均值作為滋味評(píng)價(jià)結(jié)果。

表2 酶解物滋味評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Taste scoring criteria of enzymatic hydrolysates

1.2.9 游離氨基酸組成測(cè)定 首先，取400 μL 酶解液與100 μL 10%磺基水楊酸混合均勻，在4 ℃條件下靜置60 min；然后在14500 r/min 轉(zhuǎn)速下離心15 min，上層清液二次離心5 min，以pH 為2.2 的檸檬酸緩沖液1:50 稀釋上層清液，經(jīng)0.22 μm 過濾器過濾，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣瓶中通過氨基酸自動(dòng)分析儀分析測(cè)定。

1.2.10 肽分子量分布分析 采用高效液相色譜儀（配2487 紫外檢測(cè)器和Empower 工作站GPC 軟件）測(cè)定肽分子量分布[13]。樣品制備：將100 mg 樣品用水溶解于10 mL 容量瓶?jī)?nèi)，超聲5 min 后以10000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾處理。色譜條件：色譜柱為TSKgel 2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流動(dòng)相由乙腈/水/三氟乙酸40/60/0.1（v/v/v）組成；流速0.5 mL/min；柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

相同條件下，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差；統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS 進(jìn)行（P<0.05）；繪圖采用Origin 2018。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一酶篩選

酶的特異性是影響水解產(chǎn)物特性的主要因素[14]。由圖1（a）可知，堿性蛋白酶酶解后的水解度最高，達(dá)到12.39%，風(fēng)味蛋白酶酶解后的水解度最低，為6.53%；由于風(fēng)味酶是外切蛋白酶，只能酶解肽鏈的兩端，酶切位點(diǎn)不足，故水解度較低[15]。結(jié)合圖1（b）發(fā)現(xiàn)，使用堿性蛋白酶酶解制得的產(chǎn)物鮮味評(píng)分不高、有明顯苦味，且腥味、堿味較重。而經(jīng)風(fēng)味蛋白酶酶解制備的酶解物鮮味評(píng)分最高，苦味較低。有研究表明，風(fēng)味蛋白酶可以有效改善酶解液風(fēng)味[16?17]。因此，選定風(fēng)味蛋白酶與其他五種單酶進(jìn)行復(fù)配酶解。

圖1 不同蛋白酶對(duì)水解度和感官評(píng)價(jià)的影響Fig.1 Effects of different proteases on the degree of hydrolysis and sensory evaluation

2.2 復(fù)配酶篩選

復(fù)配酶解包括分步酶解和同步酶解兩種方式，多酶分步酶解一般較同步酶解的水解效果好，而多酶同步酶解工藝操作簡(jiǎn)單[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，分步水解與同步水解對(duì)雞骨酶解物影響并不顯著[19]，為了簡(jiǎn)化工藝，本文采用同步酶解工藝。由圖2（a）可知，風(fēng)味蛋白酶與堿性蛋白酶復(fù)配后酶解效果最佳，此時(shí)水解度為12.43%，風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶分別復(fù)配后水解度無明顯差異，分別為8.93%、8.89%和9.43%。圖2（b）顯示，與其他復(fù)配酶相比，風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶復(fù)配酶解時(shí)，所得酶解產(chǎn)物鮮味和整體風(fēng)味較突出，酸味、苦味不明顯；且腥味較淡、肉香濃郁。邱燕翔等[20]發(fā)現(xiàn)，僅使用復(fù)合蛋白酶或風(fēng)味蛋白酶單酶水解雞肉時(shí)存在苦味重、雞肉風(fēng)味較淡或水解度不高等缺點(diǎn)，而復(fù)配酶可以有效提高水解度以及保持雞肉風(fēng)味。因此，選擇風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶作為復(fù)配的兩種蛋白酶。

圖2 不同復(fù)配酶對(duì)水解度和感官評(píng)價(jià)的影響Fig.2 Effects of different complex enzymes on the degree of hydrolysis and sensory evaluation

2.3 復(fù)配酶酶解單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 底物比例的確定 由圖3 可知，雞骨架和雞胸肉的比例為6:4、5:5 和9:1 時(shí)，酶解液水解度較高，水解度分別為8.98%、8.44%和8.42%，比例為7:3時(shí)制得酶解液水解度最低，為6.47%。在酶解液整體風(fēng)味評(píng)分方面，五種比例底物的酶解液風(fēng)味沒有顯著差異（P>0.05），綜合考慮水解度和成本因素，故選擇9:1 的比例進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 底物比例對(duì)水解度和酶解產(chǎn)物風(fēng)味的影響Fig.3 Effects of substrate ratio on hydrolysis degree and flavor of enzymatic hydrolysates

2.3.2 水解酶復(fù)配比例確定 由圖4 可知，隨著風(fēng)味蛋白酶添加量的增加，水解度先上升后下降，之后又有所上升。當(dāng)復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)配比為1:3 時(shí)水解效果最佳，此時(shí)水解度為9.86%，這可能與兩種酶不同的特異性有關(guān)。復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)配比為3:1 時(shí)酶解物整體評(píng)分最高，肉香味濃郁，故酶配比選擇3:1。

圖4 酶配比對(duì)水解度和酶解產(chǎn)物風(fēng)味的影響Fig.4 Effects of enzyme ratio on hydrolysis degree and flavor of enzymatic hydrolysates

2.3.3 料液比的選擇 由圖5 可知，料液比1:1 g/mL時(shí)水解度最高為15.18%，料液比持續(xù)增加，水解度降低，1:5 g/mL 時(shí)水解度最低，為3.72%。這說明當(dāng)加酶量固定時(shí)，底物濃度不斷減小，酶與底物接觸幾率降低，反應(yīng)受限，水解度不斷降低[21]。料液比1:2 g/mL時(shí)整體評(píng)分最高，所得產(chǎn)物有肉香味，而料液比為1:1 g/mL 時(shí)雖然肉香味較濃，但有腥味，因此，選擇料液比為1:1、1:2、1:3 g/mL 進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖5 料液比對(duì)水解度和酶解產(chǎn)物風(fēng)味的影響Fig.5 Effects of solid-liquid ratio on hydrolysis degree and flavor of enzymatic hydrolysates

2.3.4 酶解溫度的選擇 由圖6 可知，水解度首先隨溫度的上升而增加，在50 ℃時(shí)水解度最高，為9.47%，而后繼續(xù)升高溫度水解度又逐漸降低。其主要原因是在某一特定的溫度區(qū)間，酶解效率隨溫度升高相應(yīng)加快，但蛋白酶在較高溫度下會(huì)變性，導(dǎo)致酶解效率降低[2]。整體風(fēng)味評(píng)分隨溫度的升高先上升后降低，50 ℃時(shí)風(fēng)味評(píng)分最高，肉香味厚重。因此，選擇45、50、55 ℃進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖6 溫度對(duì)水解度和酶解產(chǎn)物風(fēng)味的影響Fig.6 Effects of temperature on hydrolysis degree and flavor of enzymatic hydrolysates

2.3.5 酶解pH 的確定 如圖7 所示，pH 為7.0（10.96%）、7.5（11.17%）和8.0（10.56%）時(shí)水解度沒有顯著差異（P>0.05）。結(jié)合感官評(píng)分，pH7.5 時(shí)，整體風(fēng)味最高，肉香味濃厚，而pH 為7.0 和8.0 時(shí)，酶解產(chǎn)物的肉香味較淡，且有腥味。因此，復(fù)合蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶復(fù)配作用的適宜pH 為7.5。

圖7 pH 對(duì)水解度和酶解產(chǎn)物風(fēng)味的影響Fig.7 Effects of pH on hydrolysis degree and flavor of enzymatic hydrolysates

2.3.6 加酶量的選擇 由圖8 可知，復(fù)配酶總加酶量為0.6%時(shí)，水解度最大，為13.44%，繼續(xù)加酶時(shí)水解度有所降低?？赡苁敲附膺^程是底物與酶的特異性結(jié)合過程，在料液比保持不變的情況下，隨著加酶量的增加，酶解效率大幅度增加。同時(shí)，復(fù)配酶之間可能還存在相互作用，在加酶量少時(shí)，相互作用影響不明顯，而加酶量大時(shí)，相互作用明顯，可能造成酶活力降低[22]。加酶量為0.6%和0.8%時(shí)，整體風(fēng)味評(píng)分較高，且產(chǎn)品肉香味濃郁。選取0.4%、0.6%、0.8%進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖8 加酶量對(duì)水解度和酶解產(chǎn)物風(fēng)味的影響Fig.8 Effects of enzyme dosage on hydrolysis degree and flavor of enzymatic hydrolysates

2.3.7 酶解時(shí)間的選擇 由圖9 可知，水解度在酶解1～2 h 過程中迅速增加，之后上升平緩，3 h 時(shí)水解度為14.43%，時(shí)間延長，水解度增加不顯著（P>0.05）。這可能是因?yàn)槊冈谂c底物完全結(jié)合之后會(huì)隨時(shí)間而趨于飽和，繼續(xù)延長時(shí)間，酶解速率降低，水解度上升緩慢[23]。酶解時(shí)間3 h 時(shí)，鮮味較突出，肉香味濃厚。酶解4 h 和5 h 制得的酶解物可能會(huì)有部分短肽類的苦味物質(zhì)生成，導(dǎo)致整體風(fēng)味下降。選擇2、3、4 h進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

圖9 酶解時(shí)間對(duì)水解度和酶解產(chǎn)物風(fēng)味的影響Fig.9 Effects of enzymatic hydrolysis time on hydrolysis degree and flavor of enzymatic hydrolysates

2.4 酶解工藝的正交試驗(yàn)結(jié)果

如表3 極差R 結(jié)果可知，四因素對(duì)水解度的影響大小次序?yàn)椋築>A>D>C，最佳水平組合取為A2B2C2D3；對(duì)感官效果的影響次序?yàn)椋築>D>C>A，最佳水平組合為A2B2C3D2。由表4 得知，四因素對(duì)水解度均有極顯著的影響（P<0.01）；對(duì)感官評(píng)分影響極顯著的因素是酶解溫度（P<0.01），加酶量等其余因素對(duì)感官評(píng)分均沒有顯著影響（P>0.05）。為了得到整體風(fēng)味較高的酶解產(chǎn)物，考慮酶成本，最終的酶解工藝選為：料液比1:2 g/mL、酶解溫度50 ℃、加酶量0.6%、酶解時(shí)間3 h。對(duì)該條件進(jìn)行了驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，所得酶解物水解度為13.60%，酶解產(chǎn)物肉香味突出，感官評(píng)分為4.7。

表3 復(fù)配酶酶解正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of compound enzyme enzymolysis

表4 水解度和感官評(píng)分試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of hydrolysis degree and sensory evaluation test results

2.5 不同水解時(shí)間游離氨基酸分析

氨基酸可以改善食品的口感[24]。其按照呈味特性可以劃分為四種，即鮮味、甜味、苦味及無味氨基酸[25]。如表5 所示，酶解0 h 時(shí)，游離氨基酸總量為2.02 mg/mL，其中，鮮甜味氨基酸與苦味氨基酸含量分別為0.52 mg/mL 和0.99 mg/mL，苦味氨基酸占總游離氨基酸的49.01%；最優(yōu)工藝條件下，游離氨基酸總量增至3.82 mg/mL，鮮甜味氨基酸含量為0.61 mg/mL，苦味氨基酸含量為2.74 mg/mL，占總游離氨基酸的71.73%；酶解時(shí)間延長至5 h，產(chǎn)物中苦味氨基酸含量顯著（P<0.05）增加，含量達(dá)3.44 mg/mL，占總游離氨基酸的73.19%，這可能是酶解5 h 后產(chǎn)物產(chǎn)生苦味的原因。這與Kong 等[26]研究結(jié)果相似，其指出苦味氨基酸是雞肉酶解產(chǎn)物中的主要氨基酸，占游離氨基酸總量的一半以上。酶解液中還檢測(cè)出了芳香族氨基酸苯丙氨酸，芳香族氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)、維持生命的基本物質(zhì)，是人體不可或缺的成分[27]。由表5 可知，酶解液中共檢測(cè)出了8 種必需氨基酸，總含量顯著（P<0.05）高于酶解前，可以很好地補(bǔ)充身體需要的氨基酸，因此其具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。

表5 不同酶解時(shí)間產(chǎn)物的游離氨基酸含量Table 5 Contents of free amino acids in hydrolysates at different enzymolysis times

不同氨基酸的味覺閾值存在差異，盡管樣品中一些風(fēng)味物質(zhì)含量偏低，但因?yàn)樗鼈兊拈撝递^低而對(duì)口感有很大的影響。常采用滋味活性值（Taste activity value，TAV）評(píng)估物質(zhì)對(duì)樣品呈味的貢獻(xiàn)程度，其計(jì)算方法是樣品測(cè)定濃度與其閾值之比[28]。TAV>1時(shí)，表明這種物質(zhì)促進(jìn)了樣品整體滋味的改善，其值越大促進(jìn)效果越好。相反，認(rèn)為這種物質(zhì)對(duì)于樣品的呈味作用沒有明顯促進(jìn)作用[29]。由表6 可知，酶解3 h 時(shí)，除谷氨酸和甘氨酸外的其余游離氨基酸TAV 值明顯增大。繼續(xù)延長酶解時(shí)間，苦味氨基酸TAV 值持續(xù)升高，5 h 時(shí)的TAV 值顯著高于3 h 的TAV 值。在酶解前后檢測(cè)出的16 種氨基酸中組氨酸TAV 值最高（TAV>1），并且隨著時(shí)間的延長TAV值不斷提高。其余呈味氨基酸TAV 均小于1，說明組氨酸對(duì)酶解液呈味貢獻(xiàn)較大。組氨酸是苦味氨基酸，可以增加呈味復(fù)雜性和提升鮮度[30]。研究表明，通常呈苦味的氨基酸不具備味覺活性，其苦味易被其他呈味氨基酸的味道掩蓋，另外，芳香族氨基酸含量低于其閾值時(shí)，可以提高酶解液的鮮味和甜味[31]。

表6 不同酶解時(shí)間酶解產(chǎn)物游離氨基酸的TAVTable 6 TAV of free amino acids of hydrolysates at different enzymolysis times

2.6 不同水解時(shí)間肽分子量分布分析

酶解液的呈味特性與酶解液中含有的小分子肽有密切關(guān)系[32]。由表7 可以看出，酶解前以大分子肽為主，分子量>10 kDa 的多肽含量最高，為54.09%，分子量<3 kDa 的肽含量為29.84%；肽分子量分布隨酶解時(shí)間的延長整體上呈現(xiàn)分子量>5 kDa 的多肽減少，分子量<3 kDa 的肽含量逐漸增多的趨勢(shì)。其中1～5 kDa 的肽含量先增加后降低，這主要是因?yàn)殡S著酶解的進(jìn)行，多肽被酶解成更小的肽和氨基酸，這與楊波等[7]研究結(jié)果相一致。最優(yōu)工藝條件下，>10 kDa的肽含量?jī)H為0.10%，而<3 kDa 的肽占93.26%，其中<1 kDa 的肽含量為69.36%。繼續(xù)酶解至5 h，<1 kDa的肽含量增加至73.25%。酶解程度影響呈味肽的組成和含量，進(jìn)而影響產(chǎn)物的整體風(fēng)味。Chen 等[33]研究發(fā)現(xiàn)風(fēng)味肽的主要分子量分布小于3 kDa。鮮味肽通常為分子量小于1 kDa 的小分子肽，相對(duì)分子量較小的肽作為肉的風(fēng)味物質(zhì)前體物易于產(chǎn)生更多的揮發(fā)性化合物[34]。

表7 酶解產(chǎn)物的肽分子量分布Table 7 Peptide molecular weight distribution of enzymatic hydrolysis products

3 結(jié)論

選用風(fēng)味蛋白酶與復(fù)合蛋白酶酶解雞骨架和雞胸肉復(fù)合底物，通過正交試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳酶解工藝為：雞骨架與雞胸肉配比為9:1，料液比1:2 g/mL，溫度50 ℃，pH7.5，酶添加量分別為復(fù)合蛋白酶0.45%和風(fēng)味蛋白酶0.15%，酶解時(shí)間3 h。經(jīng)驗(yàn)證得到的水解度為13.60%，酶解產(chǎn)物肉香味濃郁，鮮味突出，呈味效果好。此條件下，游離氨基酸中的苦味氨基酸含量較高，其中組氨酸的TAV 值>1，是主要的呈味貢獻(xiàn)氨基酸；酶解產(chǎn)物中<3 kDa 的肽含量高于90%。本研究可為酶解雞骨架與雞胸肉復(fù)合底物制備呈味基料提供理論依據(jù)。酶解過程中，游離氨基酸、多肽、核苷酸、有機(jī)酸等組成和含量的變化共同作用導(dǎo)致了酶解液的呈味變化。后續(xù)將進(jìn)一步研究雞骨架與雞胸肉復(fù)合酶解物中的其他呈味物質(zhì)變化規(guī)律，分離鑒定其中的鮮味肽，解析風(fēng)味形成機(jī)制，為雞骨架在呈味基料開發(fā)中的應(yīng)用提供參考。