單寧酶在黑曲霉中的高效表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究

仝丹心，李 杰，何洪彬 ，張 會(huì),

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東濟(jì)南 250014）

單寧酶（單寧?；饷福珽C3.1.1.20）也稱鞣酸酶，可在水相中水解沒食子酸單寧、沒食子酸脂類的酯鍵、縮酚酸酯鍵和縮酚羧鍵，生成葡萄糖、沒食子酸和其他醇類化合物[1?4]。自然界中的單寧酶廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)，尤其是真菌類的曲霉屬、青霉屬和根霉屬[5?7]。單寧酶已被列入食品工業(yè)的安全添加劑，并在食品、飼料等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[8?9]?？山档筒铚袉螌幩岷?，解決茶飲料“冷后渾”問題[10]；可降低單寧含量，解決果汁類飲料除澀、抗氧化等問題[11?14]；可降低飼料中單寧酸含量，提高營養(yǎng)物質(zhì)利用率等[15?17]。

不同來源的單寧酶酶學(xué)性質(zhì)差異較大，多數(shù)單寧酶的最適溫度在35～50 ℃范圍內(nèi)，最適pH 在5.5～7.0 范圍內(nèi)[18?20]。王喆麗[21]發(fā)現(xiàn)野生型黑曲霉中單寧酶的酶活力為0.782 U·mL?1，優(yōu)化后酶活力增加至2.686 U·mL?1。林健輝等[22]以β-環(huán)糊精為碳源優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基后的單寧酶酶活力為116.51 U·mL?1。徐璐等[23]在土壤中篩選出產(chǎn)單寧酶的黑曲霉Lys117高活性菌株，并對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后酶活達(dá)到233.78 U·mL?1。

黑曲霉是規(guī)模化生產(chǎn)重組蛋白的理想系統(tǒng)，被譽(yù)為“理想的真核蛋白細(xì)胞工廠”，是目前和未來工業(yè)蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)研究的熱點(diǎn)[24?25]。目前單寧酶仍存在產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高等問題。本研究以糖化酶黑曲霉工業(yè)生產(chǎn)菌為宿主菌，該菌株的糖化酶基因位點(diǎn)為轉(zhuǎn)錄活躍位點(diǎn)，因此，以內(nèi)源高表達(dá)的糖化酶基因glaA位點(diǎn)為基因整合的靶位點(diǎn)，并使用glaA 六拷貝強(qiáng)啟動(dòng)子和信號肽來提高單寧酶的表達(dá)量，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，以期使單寧酶的生產(chǎn)性能達(dá)到國內(nèi)領(lǐng)先水平。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生型糖化酶生產(chǎn)菌黑曲霉TH-2 由肇東日成酶制劑有限公司贈(zèng)予；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α

購于北京全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌AGL1

由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌遺傳工程研究室保存；載體pSZHG6R-AnTan、黑曲霉菌株A1（ΔglaA:AnTan）

為本研究構(gòu)建；克隆載體pMD-19T、Es Taq Master Mix、限制性內(nèi)切酶、DNA Maker、T4 DNA 連接酶 均購于TaKaRa 生物公司；利福平（Rifamycin）、頭孢霉素（Cefalexin）、乙酰丁香酮（Acetylsyringone）、氨芐青霉素（Ampicillin）、卡那霉素（Kanamycin）、潮霉素B（Hygromycin B）均購于Sangon 公司；Protein Maker 購于Thermo 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA 凝膠回收試劑盒、植物DNA 基因組提取試劑盒 均購于康為世紀(jì)生物科技有限公司；羅丹寧 購于上海aladinn 生化科技股份有限公司；檸檬酸 購于天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；甲醇、磷酸氫二鈉 均購于天津市天力化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸正丙酯 購于南京都萊生物公司；沒食子酸購于北京Solarbio 科技有限公司；葡萄糖、麥芽糖均購于西安天茂化工有限公司；糊精 購于山東萍聚生物科技有限公司；FeSO4·7H2O 購于武漢北國奉化工有限公司；ZnSO4·7H2O 購于上海鋪振生物科技有限公司；CuSO4·5H2O 購于重慶名宏化工材料有限公司；MgSO4·7H2O 購于長沙銳啟化工產(chǎn)品有限公司；MnCl2·4H2O 購于武漢吉業(yè)升化有限公司；CaCl2購于山東皓宇新材料科技有限公司；K2SO4購于湖北興銀河化工有限公司；EDTA 購于陜西晨明生物科技有限公司；SDS 購于無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；玉米漿 購于天津市利發(fā)隆化工科技有限公司。

DK-8D 型三溫三控水槽 購于上海百典儀器有限公司；SW-CJ-1G 型超凈工作臺 購于上海鼎科科學(xué)儀器有限公司；DTC-3G 型PCR 儀 購于西安天隆科技有限公司；GELDoc Go 型凝膠成像系統(tǒng)、1658033 型蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng) 購于BIO-RAD 公司；UV-5100 型紫外可見分光光度計(jì) 購于上海元析儀器有限公司；DYCZ-24 型蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng) 購于北京六一儀器廠；A6 型勻漿器 購于上海歐河機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 a.YEB（Yeast extract beef medium）：由1 g 酵母提取物，5 g 蛋白胨，0.493 g 硫酸鎂，5 g 蔗糖，5 g 牛肉膏定容至1 L，pH 調(diào)至7.0，固體培養(yǎng)基加入10% 瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌1 h；b.PDA 培養(yǎng)基：由200 g 土豆（稱量200 g 土豆，去皮后切成小塊，加入1 L 蒸餾水，電磁爐煮30 min，紗布過濾留濾液），20 g 葡萄糖，3 g 磷酸二氫鉀，1.5 g硫酸鎂。固體培養(yǎng)基按100 mL 加入15 g 瓊脂粉；c.液體發(fā)酵培養(yǎng)基：由10 g 葡萄糖，2 mL 玉米漿（濃度52%，蛋白質(zhì)含量47%），2 g 豆餅粉定容至100 mL，pH5.0～6.0，固體培養(yǎng)基加入10%瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌1 h。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank 單寧酶序列（Gene ID: 4990850），單寧酶基因AnTan的上下游引物P1、P2 是通過Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)而來。P3 和P4為鑒定同源重組菌株所用引物（如表1 所示）。

表1 所需引物序列Table 1 The desired prime sequence

1.2.3 基因克隆 以黑曲霉TH-2 基因組DNA 為模板，以P1 和P2 為引物，通過PCR 技術(shù)擴(kuò)增出大小為1700 bp（PCR 擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，（變性95 ℃ 30 s、退火56 ℃ 45 s、延伸72 ℃ 90 s）共30 個(gè)循環(huán)，終延伸72 ℃ 10 min，4 ℃ 2 h）的目的基因片段AnTan。基因片段AnTan和克隆載體pMD-19T 進(jìn)行連接反應(yīng)，將獲得的質(zhì)粒送到測序公司進(jìn)行測序，選擇Blast結(jié)果為100%的質(zhì)粒進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 單寧酶基因AnTan表達(dá)載體的構(gòu)建 用Xba I/Hind III 雙酶切克隆載體質(zhì)粒pT-AnTan，回收約1700 bp 的目的基因片段。用Nhe I/Hind III 雙酶切表達(dá)載體質(zhì)粒pSZHG6R，回收約15000 bp 的表達(dá)載體片段pSZHG6R，將回收的目的基因片段AnTan和表達(dá)載體片段pSZHG6R 用T4 DNA Ligase 連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pSZHG6R-AnTan（ΔglaA:AnTan），質(zhì)粒圖如圖1 所示。

圖1 pSZHG6R-AnTan 表達(dá)載體質(zhì)粒圖Fig.1 Plasmid map of pSZHG6R-AnTan expression vector

1.2.5 單寧酶基因AnTan黑曲霉共培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化子的篩選、鑒定 采用凍融法將重組表達(dá)載體pSZHG6RAnTan 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。向新鮮滅菌的液體YEB 培養(yǎng)基（含100 mg·L?1Rif，100 mg·L?1km+）中加入鑒定正確的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行初次活化，28 ℃，200 r·min?1振蕩培養(yǎng)12～14 h；另取一瓶新鮮滅菌的液體YEB 培養(yǎng)基（含100 mg·L?1Rif，100 mg·L?1km+和200 μmol·L?1As）接入初次活化的菌液（按1:10 的比例），28 ℃，200 r·min?1振蕩培養(yǎng)4～5 h；待菌液搖起后吸取200～300 μL 菌液置于EP 管中，12000 r·min?1，離心1 min，留取沉淀以備使用；取1 mL 的黑曲霉TH-2 菌液，勻漿器打碎后靜置15 min，取75 μL 上清和75 μL 菌絲于農(nóng)桿菌沉淀的EP 管中混勻，取50 μL 的混合菌液涂布于鋪有玻璃紙的PDA 固體培養(yǎng)基（含200 μmol·L?1As）上，放置于30 ℃恒溫箱，培養(yǎng)2 d；取新鮮滅菌的PDA 固體培養(yǎng)基（含200 mmol·L?1頭孢，200 mmol·L?1Hygromycin B）將覆有菌絲的玻璃紙倒置其中，30 ℃恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為12 h，玻璃紙揭去后繼續(xù)培養(yǎng)6～8 d 直至長出黑曲霉單菌落。向液體PDA 培養(yǎng)基（含200 mmol·L?1頭孢，200 mmol·L?1Hygromycin B）中加入長勢良好的黑曲霉單菌落，培養(yǎng)2～3 d；待菌絲大量生長后，吸取1 mL 菌絲液于EP 管中進(jìn)行基因組DNA 的提取，提取方法參考基因組提取試劑盒。以提取的基因組DNA 為模板，將P3 和P4 作為上下游引物進(jìn)行PCR 鑒定，以水為陰性對照，重組表達(dá)載體質(zhì)粒pSZHG6R-AnTan 為陽性對照，篩選出單寧酶基因AnTan黑曲霉純合重組菌，標(biāo)記為A1。

1.2.6 單寧酶基因AnTan黑曲霉純合重組菌株的SDS-PAGE 檢測 向裝有100 mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶中分別接入10 mL 的野生型菌株TH-2 和單寧酶黑曲霉重組菌株A1，然后將錐形瓶置于30 ℃270 r·min?1的培養(yǎng)箱里振蕩培養(yǎng)，吸取第4 d～第11 d的發(fā)酵液上清進(jìn)行SDS-PAGE 檢測。

1.2.7 單寧酶酶活力測定 參考文獻(xiàn)[26]方法，單寧酶酶活定義：30 ℃條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol 沒食子酸所需單寧酶的量為一個(gè)酶活力單位，計(jì)算公式如下：

式中：U：單寧酶酶活力（μmol·mL?1），X：沒食子酸濃度（μmol·L?1），D：發(fā)酵液上清總稀釋倍數(shù)，t：酶解反應(yīng)時(shí)間（min）。

1.2.8 重組單寧酶的酶學(xué)性質(zhì)分析 將搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的100 mL 培養(yǎng)液于第11 d 取出，收集上清。對上清液進(jìn)行抽濾，去除雜質(zhì)。

1.2.8.1 最適溫度 取8 份A1 發(fā)酵液上清，用pH7.0的0.2 mol·L?1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進(jìn)行稀釋，加入0.05 mol·L?1甲醇饒丹寧底物，分別在20、30、40、50、60、70、80、90 ℃的條件下反應(yīng)30 min 后測定A1 的酶活力，計(jì)算各組酶活數(shù)值與最大值的比值為相對酶活力，繪制相對酶活力與溫度曲線關(guān)系，以最大酶活力為100%[27]。

1.2.8.2 溫度穩(wěn)定性 取9 份A1 發(fā)酵液上清，其中8 份分別在20、30、40、50、60、70、80、90 ℃水浴鍋中保溫15、30、45、60 min，之后在pH 為7.0，溫度為50 ℃的條件下反應(yīng)30 min 后測定A1 的酶活力；另一份酶液作為對照組不進(jìn)行保溫處理，并定義其酶活力為100%[27]，計(jì)算處理組與對照組酶活比值為殘余酶活力并繪制曲線關(guān)系。

1.2.8.3 最適pH 取7 份A1 發(fā)酵液上清，分別用pH 為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的0.2 mol·L?1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液進(jìn)行稀釋，加入0.05 mol·L?1甲醇饒丹寧底物，50 ℃條件下反應(yīng)30 min 后測定A1 的酶活力，以最大酶活力為100%[27]。

1.2.8.4 pH 穩(wěn)定性 取8 份A1 發(fā)酵液上清，其中7 份分別用0.2 mol·L?1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調(diào)成pH 為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的酶液混合液，37 ℃處理30、60、90、120 min。用pH5.0 的緩沖液稀釋處理后的樣品，加入0.05 mol·L?1甲醇饒丹寧底物，50 ℃條件下反應(yīng)30 min 后測定A1 的酶活力，另一份酶液作為對照組未經(jīng) pH 處理，并定義其酶活力為100%[27]，計(jì)算處理組與對照組比值為殘余酶活力并繪制曲線關(guān)系。

1.2.8.5 金屬離子和化學(xué)試劑對A1 活性的影響取9 份A1 發(fā)酵液上清，其中8 份分別添加終濃度為5 mmol·L?1KCl、MnSO4、ZnSO4、MgSO4、CaCl2、CuSO4、FeSO4、EDTA，在50 ℃、pH5.0 條件下處理1 h，研究不同金屬離子和化學(xué)試劑對A1 酶活力的影響，另一份酶液作為對照組不加任何金屬離子，并定義其酶活力為100%[27]，計(jì)算處理組與對照組酶活比值為殘余酶活力并繪制曲線關(guān)系。

1.3 數(shù)據(jù)處理

在酶活性相關(guān)實(shí)驗(yàn)中，每組數(shù)據(jù)處理重復(fù)三次，計(jì)算得到的酶活數(shù)據(jù)利用SPSS 軟件進(jìn)行單因素方差分析，以確定組間顯著差異，使用Graphpad Prism v 8.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧酶AnTan 基因黑曲霉重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存的單寧酶基因載體質(zhì)粒pSZHG-tan 為模板，以單寧酶基因引物P1 和P2 為引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到大小約1700 bp 的基因片段AnTan，結(jié)果如圖2 所示。將測序后的序列在GenBanK上進(jìn)行Blast 序列比對分析，結(jié)果該序列與登錄號XM_001401772 相似性達(dá)100%，表明單寧酶基因片段AnTan克隆成功。

圖2 AnTan 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplification of AnTan by PCR

將回收的目的基因片段AnTan和表達(dá)載體片段pSZHG6R 用T4 DNA Ligase 連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pSZHG6R-AnTan，Xba I/Hind III 雙酶切重組質(zhì)粒，獲得大小約15000 和3300 bp 的片段，結(jié)果如圖3 所示，說明重組表達(dá)載體pSZHG6R-AnTan 構(gòu)建成功。

圖3 pSZHG6R-AnTan 的酶切鑒定結(jié)果（Xba I/Hind III）Fig.3 Enzyme digestion of pSZHG6R-AnTan by Xba I/Hind III

2.2 單寧酶AnTan 基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子的篩選及鑒定

采用凍融法將單寧酶黑曲霉重組表達(dá)載體質(zhì)粒pSZHG6R-AnTan 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL1 中，28 ℃培養(yǎng)3～4 d 至長出單菌落，挑取菌落為模板，水為陰性對照，表達(dá)載體質(zhì)粒pSZHG6R-AnTan 為陽性對照，用單寧酶基因特異引物P1、P2 進(jìn)行菌落PCR 鑒定。結(jié)果如圖4 所示，菌落1 擴(kuò)增出與陽性對照相同大小的片段，證明單寧酶黑曲霉重組表達(dá)載體pSZHG6R-AnTan 成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL1。

圖4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子菌落PCR 鑒定Fig.4 Identification of Agrobacterium tumefaciens transformants by PCR

2.3 單寧酶AnTan 基因黑曲霉純合重組菌株的篩選及鑒定

用同源臂引物P3 和P4 對重組菌株進(jìn)行基因組PCR 鑒定，野生型菌株黑曲霉TH-2 和重組菌株均能擴(kuò)增出約4500 bp 條帶，因此，通過PCR 方法不能直接鑒定出轉(zhuǎn)化子。進(jìn)一步將PCR 產(chǎn)物用Hind III 單酶切，結(jié)果如圖5 所示，泳道0 為野生型菌株黑曲霉TH-2，糖化酶基因表達(dá)框上無Hind III 酶切位點(diǎn)，因此切不開；泳道0+為單寧酶黑曲霉重組表達(dá)載體質(zhì)粒，可將擴(kuò)增出的單寧酶基因表達(dá)框切成3300和1200 bp 條帶；泳道1 為重組菌株，能切出與陽性質(zhì)粒一樣大小的條帶，而無野生型菌株4500 bp 條帶，證明其為純合的單寧酶黑曲霉重組菌株，記為A1。

圖5 黑曲霉純合重組菌株的篩選和鑒定（Hind III）Fig.5 Screening and identification of Aspergillus niger homozygous recombinant strains（Hind III）

2.4 單寧酶黑曲霉重組菌株A1 的SDS-PAGE 檢測

不改變培養(yǎng)基其他成分的條件下，分別以10%葡萄糖、10%糊精及10%麥芽糖為碳源，按10%接種比例分別將野生型菌株黑曲霉TH-2 和單寧酶黑曲霉重組菌株A1 進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，取第4～11 d的發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE 檢測，經(jīng)CalMolWt 軟件預(yù)測，A1 蛋白條帶大小約為76 kDa，結(jié)果如圖6 所示。實(shí)驗(yàn)室前期對野生型菌株黑曲霉TH-2 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和分泌蛋白質(zhì)組測序分析表明，圖中位置1 為糖化酶，位置2 為酸穩(wěn)定的ɑ-淀粉酶，位置3 為ɑ-淀粉酶，本研究將單寧酶基因定點(diǎn)整合到位置1 糖化酶基因位點(diǎn)，所以重組菌株失去了糖化酶基因活性，與野生型菌株黑曲霉TH-2 相比，在位置4 處觀察到一條明顯的蛋白條帶，大小約為76 kDa，與預(yù)估值相似，且沒有位置1 的糖化酶蛋白帶，證明重組菌株A1 為純合同源重組菌株。

圖6 重組菌株A1 的SDS-PAGE 蛋白表達(dá)電泳圖譜Fig.6 SDS-PAGE detection of recombinant strain A1

2.5 單寧酶黑曲霉重組菌株A1 的酶活測定

取第4～11 d 的發(fā)酵上清液進(jìn)行單寧酶活性檢測，野生型菌株A.nigerTH-2 單寧酶酶活力最高為0.7 U·mL?1。重組菌株A1 單寧酶酶活力分別為75.23 U·mL?1（10%葡萄糖），134.36 U·mL?1（10%糊精），88.97 U·mL?1（10%麥芽糖），最高約為野生型菌株的192 倍，具有明確的產(chǎn)業(yè)化價(jià)值。以葡萄糖為基準(zhǔn)，碳源為糊精時(shí)，單寧酶酶活力提高約78.60%，碳源為麥芽糖時(shí)，單寧酶酶活力提高約18.26%，因此，糊精是單寧酶黑曲霉重組菌株A1 的最佳碳源，結(jié)果如圖7 所示。

圖7 A1 重組菌株酶活測定結(jié)果Fig.7 Emyze activity of recombinant strain A1

2.6 單寧酶黑曲霉重組菌株A1 中單寧酶酶學(xué)性質(zhì)分析

2.6.1 溫度對重組酶活性的影響及其穩(wěn)定性 不同溫度（20～90 ℃）下，單寧酶的活性變化差異顯著，結(jié)果如圖8 所示，當(dāng)溫度處于40～70 ℃范圍內(nèi)時(shí)，酶活性相對較高，說明單寧酶適宜的溫度范圍較廣；在50 ℃時(shí)，酶活達(dá)到最大值。熱穩(wěn)定性結(jié)果如圖9 所示，不同溫度（20～90 ℃）條件下處理60 min 之后，酶在20～50 ℃范圍內(nèi)相對穩(wěn)定，殘余酶活力仍然在50%以上；60 ℃時(shí)殘余酶活力維持在40%左右；酶在80～90 ℃范圍內(nèi)時(shí)，殘余酶活不足10%。

圖8 不同溫度下重組菌株A1 的酶活測定結(jié)果Fig.8 Enzyme activity of recombinant strain A1 at different temperature

圖9 不同溫度對重組菌株A1 的酶活穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of different temperature on enzyme activity stability of recombinant strain A1

2.6.2 pH 對重組酶活性的影響及其穩(wěn)定性 不同pH（pH3.0～9.0）條件下，單寧酶的活性變化差異顯著，結(jié)果如圖10 所示。pH 在3.0～7.0 之間酶活性呈上升趨勢，并在7.0 時(shí)酶活達(dá)到最大，說明單寧酶適宜的pH 范圍較廣，pH 在7.0～9.0 時(shí)，其酶活呈現(xiàn)下降趨勢。pH 穩(wěn)定性結(jié)果如圖11 所示，結(jié)果表明不同pH 條件下處理120 min 后，酶在pH6.0～8.0 條件下，殘余酶活總體仍然在50%以上，穩(wěn)定性相對較高；在pH3.0～5.0 條件下，殘余酶活在40%左右；在pH 在9.0 條件下，殘余酶活幾乎為0。

圖10 不同pH 下重組菌株A1 的酶活測定結(jié)果Fig.10 Enzyme activity of recombinant strain A1 at different pH

圖11 不同pH 對重組菌株A1 的酶活穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of different pH on enzyme activity stability of recombinant strain A1

2.6.3 金屬離子和化學(xué)試劑對重組酶活性的影響向重組菌株A1 的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同的金屬離子和化合物（濃度為5 mmol·L?1），結(jié)果如圖12 所示。其中，檢測結(jié)果表明，K+和Ca2+對重組菌株A1的酶活力沒有影響，Mg2+對重組菌株A1 的酶活力有微弱的促進(jìn)作用，Zn2+對重組菌株A1 的酶活力有明顯的促進(jìn)作用，Cu2+和Fe2+對重組菌株A1 的酶活力有微弱的抑制作用，Mn2+和化學(xué)試劑EDTA 對重組菌株A1 的酶活力有明顯的抑制作用，不同的二價(jià)金屬離子對酶的作用并不一致，其機(jī)理與原因有待進(jìn)一步研究。

圖12 不同金屬離子和化合物對重組菌株A1 的酶活力影響Fig.12 Effects of different metal ions and compounds on enzyme activity of recombinant strain A1

3 結(jié)論

本研究以黑曲霉糖化酶工業(yè)生產(chǎn)菌為宿主菌，以內(nèi)源高表達(dá)的glaA基因位點(diǎn)為整合靶位點(diǎn)，并使用內(nèi)源高表達(dá)的glaA 六拷貝強(qiáng)啟動(dòng)子PglaA6R 和信號肽SglaA，獲得單寧酶黑曲霉純合重組菌株A1，最高酶活為134.36 U·mL?1，約是野生型菌株的192 倍，具有明確的產(chǎn)業(yè)化價(jià)值。獲得的重組單寧酶最適作用溫度是50 ℃，最適作用pH 為7.0。Zn2+對重組酶有明顯的促進(jìn)作用，Mn2+和EDTA 對重組酶有明顯的抑制作用。未來可進(jìn)一步通過更換信號肽、基因融合、密碼子優(yōu)化、增加基因拷貝數(shù)、優(yōu)化培養(yǎng)條件及使用蛋白酶缺陷菌株等來提高重組蛋白的產(chǎn)量。通過多重策略的組合使用解除重組蛋白在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的限制，以期進(jìn)一步提高單寧酶的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn)單寧酶的工業(yè)化生產(chǎn)。