NSCLC患者胸腔積液ROS1、EGFR基因突變與臨床病理及靶向治療的關(guān)系研究

伍秉翔,楊雪榮,劉 龍△

上海天佑醫(yī)院:1.腫瘤科;2.中醫(yī)科,上海 200061

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)2018年公布的數(shù)據(jù)顯示,在全球惡性腫瘤中,肺癌發(fā)病率為11.6%,病死率為18.4%,均排在首位[1]。我國(guó)國(guó)家癌癥報(bào)告中也指出,肺癌發(fā)病率與病死率在惡性腫瘤中占比最高[2]。根據(jù)病理分型,肺癌可分為小細(xì)胞肺癌(SCLC)、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC),后者在肺癌中占比約為80.0%,主要為腺癌、鱗癌等[3]。盡管臨床診治惡性腫瘤均獲得了一定進(jìn)展,但多數(shù)肺癌患者在確診時(shí)已發(fā)展至中晚期,此時(shí)難以進(jìn)行手術(shù)治療。近年來(lái),分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展使特異性分子靶向治療在臨床惡性腫瘤治療中應(yīng)用增多。分子靶向治療具有高度特異性,能夠更好地作用于腫瘤特定位點(diǎn),選擇性殺死腫瘤細(xì)胞,有利于改善肺癌患者預(yù)后[4]。在分子靶向治療中,以肉瘤致癌因子-受體酪氨酸激酶(ROS1)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)等為靶點(diǎn)的靶向藥物酪氨酸激酶抑制劑(TKI)應(yīng)用較多,但并非所有患者均可從TKI治療中獲得滿意效果,ROS1、EGFR基因突變是TKI藥物靶向治療的前提條件[5]。有研究指出,EGFR基因突變與患者性別、病理分型等有關(guān)[6]。因此了解NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變情況,并對(duì)患者特征進(jìn)行分析總結(jié),對(duì)指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。因NSCLC患者確診時(shí)多處于中晚期,大多不符合手術(shù)要求,而穿刺標(biāo)本取樣少,加之腫瘤組織本身具有異質(zhì)性,故需尋找其他方法來(lái)完成檢測(cè)。胸腔積液的獲取安全性相對(duì)較高,實(shí)時(shí)性強(qiáng),可作為ROS1、EGFR基因突變檢測(cè)的生物學(xué)材料。本研究檢測(cè)了NSCLC患者胸腔積液中ROS1、EGFR基因突變情況,并分析了胸腔積液ROS1、EGFR基因突變與患者臨床特征及治療效果的關(guān)系,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年10月至2021年2月上海天佑醫(yī)院收治的285例NSCLC患者,其中有197例患者采用靶向治療(靶向治療組),88例患者采用傳統(tǒng)化療(化療組)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《腫瘤綜合診療新進(jìn)展》[7]中NSCLC相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn),且經(jīng)病理學(xué)檢查確診;(2)在進(jìn)行胸腔積液ROS1、EGFR基因突變檢測(cè)前未行放化療;(2)臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并其他惡性腫瘤;(2)心、肝、腎功能不全;(3)合并免疫系統(tǒng)疾病。

1.2方法

1.2.1治療方法 (1)靶向治療:口服厄洛替尼片(上海羅氏制藥有限公司)150 mg/d,連續(xù)治療2個(gè)月。(2)化療:順鉑(江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司)70 mg/m2,第1天靜脈滴注;吉西他濱(南京正大天晴制藥有限公司)1 000 mg/m2,第1、8天靜脈滴注;每21天為1個(gè)周期,連續(xù)治療2個(gè)周期。

1.2.2檢測(cè)方法

(1)胸腔積液ROS1、EGFR提取。取經(jīng)細(xì)胞學(xué)檢查確定有癌細(xì)胞的胸腔積液50 mL,4 ℃保存并于24 h內(nèi)進(jìn)行DNA提取及基因檢測(cè)。于4 ℃環(huán)境中3 000 r/min離心10 min;吸取上清液,再在4 ℃環(huán)境中3 000 r/min離心10 min;吸取上清液加入Buffer SPL和蛋白酶K溶液,于63 ℃水浴消化。加入DNA示蹤劑、異丙醇,1 000 r/min離心5 min。清洗2次,1 000 r/min離心5 min,收集DNA。采用廈門艾德生物醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)的人類ROS1融合基因檢測(cè)試劑盒與EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)儀器為ABI7500儀器,檢測(cè)方法為突變擴(kuò)增系統(tǒng)-聚合酶鏈反應(yīng)(ARMS-PCR)。離心機(jī)為美國(guó)Beckman Coulter公司Allegra 64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)。

(2)ROS1基因檢測(cè)。于-20 ℃冰箱中取出ROS1混合酶和N(ROS1樣本數(shù))條8聯(lián)PCR反應(yīng)管條,均離心15 s。移取1.5 μL ROS1混合酶至待測(cè)樣本cDNA、陽(yáng)性及陰性對(duì)照中,振蕩混勻后快速離心10 s。進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件:第1階段95 ℃ 5 min;第2階段95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,15個(gè)循環(huán);第3階段93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 20 s,35個(gè)循環(huán)。

(3)EGFR基因檢測(cè)。于-20 ℃冰箱中取出EGFR混合酶和N(EGFR樣本數(shù))+2條8聯(lián)PCR反應(yīng)管條,均離心15 s。稀釋DNA,加入2.7 μL EGFR混合酶,振蕩后離心。行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增條件:第1階段95 ℃ 5 min;第2階段95 ℃ 25 s,64 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,15個(gè)循環(huán);第3階段93 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 20 s,35個(gè)循環(huán)。

1.2.3基因檢測(cè)結(jié)果判讀 ROS1基因檢測(cè)位點(diǎn)包含SLC34A2-ROS1、CD74-ROS1、SDC4-ROS1、EZR-ROS1、TPM3-ROS1、LRIG3-ROS1、GOPC-ROS1,若未檢測(cè)到上述突變則認(rèn)為ROS1融合陰性。EGFR基因檢測(cè)位點(diǎn)包含19-Del、L858R、T790M、20-Ins、G719X、S768I、L861Q。因EGFR基因除18～21外顯子外的突變極少見(jiàn)且目前與用藥不相關(guān),故如果未檢測(cè)到上述突變則判斷為EGFR野生型。

1.3療效評(píng)價(jià) 采用實(shí)體瘤臨床療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)評(píng)價(jià)治療效果,分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、疾病穩(wěn)定(SD)和疾病進(jìn)展(PD)?？陀^緩解率(ORR)=(CR例數(shù)+PR例數(shù))/總例數(shù)×100.00%,疾病控制率(DCR)=(CR例數(shù)+PR例數(shù)+SD例數(shù))/總例數(shù)×100.00%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)或連續(xù)性校正χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1NSCLC患者胸腔積液ROS1、EGFR基因突變情況 NSCLC患者胸腔積液ROS1基因突變率為3.51%(10/285),EGFR基因突變率為41.05%(117/285)。在ROS1基因突變中,SLC34A2-ROS1占比最高,其次為CD74-ROS1;在EGFR基因突變中,19-Del占比最高,其次為L(zhǎng)858R。見(jiàn)表1。

表1 NSCLC患者胸腔積液ROS1、EGFR基因突變類型[n(%)]

2.2NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系 女性NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變率高于男性NSCLC患者(P<0.05);腺癌NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變率高于非腺癌NSCLC患者(P<0.05);無(wú)吸煙史NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變率高于有吸煙史NSCLC患者(P<0.05);但不同年齡、腫瘤最大徑、解剖學(xué)部位、初診TNM分期患者ROS1、EGFR基因突變率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變與臨床特征的關(guān)系[n(%)]

2.3伴ROS1基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療效果比較 伴ROS1基因突變的NSCLC患者中,靶向治療組ORR、DCR與化療組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 伴ROS1基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療效果比較[n(%)]

2.4伴EGFR基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療效果比較 伴EGFR基因突變的NSCLC患者中,靶向治療組ORR、DCR均高于化療組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 伴有EGFR基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療效果比較[n(%)]

2.5伴ROS1基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療后的不良反應(yīng)比較 伴ROS1基因突變的NSCLC患者靶向治療組不良反應(yīng)發(fā)生率與化療組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 伴ROS1基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療后的不良反應(yīng)比較[n(%)]

2.6伴EGFR基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療后的不良反應(yīng)比較 伴EGFR基因突變的NSCLC患者靶向治療組惡心/嘔吐、肝損害、骨髓抑制的發(fā)生率均低于化療組(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 伴EGFR基因突變的NSCLC患者靶向治療與化療后的不良反應(yīng)比較[n(%)]

3 討 論

外科手術(shù)、放化療、免疫治療是NSCLC治療的常用手段,但由于多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)處于癌癥中晚期,故化療使用更多。然而化療不具有特異性,其在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損害,引起明顯不良反應(yīng)。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展,分子靶向治療NSCLC逐漸興起,與放化療相比較,其可減少不良反應(yīng),更好地延長(zhǎng)患者生存期。與NSCLC相關(guān)的基因較多,其中ROS1、EGFR基因?yàn)槟壳芭R床研究較多的驅(qū)動(dòng)基因,本次研究選取上述2種基因,分析其在NSCLC患者胸腔積液中的突變率,并探討了伴ROS1、EGFR基因突變的NSCLC患者臨床特征和治療效果。

ROS1為單體型受體酪氨酸激酶,人ROS1基因定位于6q21染色體中,其發(fā)生重排時(shí)會(huì)丟失細(xì)胞外區(qū)域,重排位點(diǎn)主要見(jiàn)于32～36外顯子[8]。有研究顯示,NSCLC中ROS1基因主要和CD74、SLC34A融合,可促使下游JAK/STAT、PI3K/AKT等信號(hào)通路呈持續(xù)激活狀態(tài),繼而促進(jìn)腫瘤發(fā)生[9-10]。有研究顯示,ROS1染色體重排在NSCLC中較少見(jiàn),僅為1%～2%[11-12]。劉光峨等[13]對(duì)黔北地區(qū)NSCLC患者ROS1基因突變進(jìn)行檢測(cè),顯示ROS1基因突變率為1.2%。吳丹等[14]研究顯示,NSCLC患者ROS1基因突變率為2.7%。本研究結(jié)果顯示,285例NSCLC患者胸腔積液ROS1基因突變率為3.51%(10/285),略高于以往研究,可能與患者居住地、生活習(xí)慣有關(guān)。EGFR基因位于第7號(hào)常染色體7p12-14區(qū),是人表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員之一,其發(fā)生突變或異常高表達(dá)均能夠引發(fā)腫瘤[15]。EGFR基因突變主要區(qū)域?yàn)門K區(qū)域18～21外顯子[16],本研究中,EGFR基因突變率為41.05%(117/285),19-Del占比最高(48.72%),其次為L(zhǎng)858R(38.46%)。魯濤等[17]研究顯示,NSCLC患者胸腔積液EGFR基因突變率為54.5%,且突變類型以19-Del、L858R為主,可見(jiàn)盡管不同研究中NSCLC患者EGFR基因突變率存在差異,但總體而言EGFR基因突變率較高,且主要類型為19-Del、L858R。

有研究顯示,ROS1、EGFR基因突變與性別、組織類型、地域等有關(guān),多數(shù)ROS1、EGFR基因突變陽(yáng)性者為女性、腺癌、東亞人群[18-19]。本研究結(jié)果中,女性、腺癌、無(wú)吸煙史的NSCLC患者ROS1、EGFR基因突變率高于男性、非腺癌、有吸煙史的NSCLC患者(P<0.05),但不同年齡、腫瘤最大徑、解剖學(xué)部位、初診TNM分期ROS1、EGFR基因突變率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示性別、病理分型和吸煙史與ROS1、EGFR基因突變有關(guān)。ROS1、EGFR基因突變是造成患者預(yù)后不良的影響因素之一,采用分子靶向藥物治療存在ROS1、EGFR基因突變位點(diǎn)的患者,可以減少不良反應(yīng),有效提升患者治療耐受性和生存質(zhì)量,延長(zhǎng)其無(wú)進(jìn)展生存期。本研究對(duì)采用靶向治療或化療的伴有ROS1、EGFR基因突變的NSCLC患者治療效果進(jìn)行觀察分析,發(fā)現(xiàn)ROS1基因突變陽(yáng)性患者中,靶向治療組ORR、DCR分別為42.86%、71.43%,高于化療組的0.00%、33.33%,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),這可能與例數(shù)太少有關(guān),提示通過(guò)靶向治療有提高伴ROS1基因突變NSCLC患者的療效的可能。EGFR基因突變陽(yáng)性患者中,靶向治療組ORR、DCR分別為61.25%、80.00%,高于化療組的32.43%、51.35%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明EGFR基因突變陽(yáng)性患者采用靶向治療可獲得更好的效果。筆者還對(duì)治療不良反應(yīng)進(jìn)行分析,顯示伴ROS1基因突變的NSCLC患者靶向治療組與化療組不良反應(yīng)發(fā)生率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),伴EGFR基因突變的NSCLC患者靶向治療組惡心/嘔吐、肝損害、骨髓抑制不良反應(yīng)發(fā)生率均低于化療組(P<0.05),提示伴有EGFR基因突變陽(yáng)性的NSCLC患者行靶向治療可以降低不良反應(yīng)發(fā)生率。雖然本次研究中胸腔積液EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有對(duì)應(yīng)的腫瘤組織檢測(cè)結(jié)果予以對(duì)比驗(yàn)證,但是該檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)下的靶向治療效果與過(guò)去在腫瘤組織檢測(cè)結(jié)果指導(dǎo)下的靶向治療效果相符[20],間接說(shuō)明了在病理質(zhì)控把關(guān)前提下的胸腔積液EGFR突變檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠,有確切的臨床價(jià)值。

綜上所述,NSCLC患者胸腔積液檢測(cè)可見(jiàn)ROS1、EGFR基因突變,其突變率分別為3.51%、41.05%,ROS1、EGFR基因突變與患者性別、病理分型和吸煙史等臨床特征有關(guān),且EGFR基因突變和療效、不良反應(yīng)存在關(guān)系。檢測(cè)NSCLC患者胸腔積液能夠有效指導(dǎo)NSCLC患者靶向治療。本次研究也存在不足之處,納入樣本量相對(duì)較少,使ROS1基因突變陽(yáng)性病例少,對(duì)研究結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定影響,還有待后續(xù)擴(kuò)大樣本量研究。