隱丹參酮調(diào)節(jié)AMPK/Nrf2信號(hào)通路治療小鼠非酒精性脂肪性肝病作用機(jī)制

趙夢溪,羅 斌,呂建瑞,王 寧

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院,陜西 西安 710004)

非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種臨床常見的代謝性疾病,與代謝障礙、氧化應(yīng)激密切相關(guān),主要特征為脂肪過度蓄積于肝臟,肝細(xì)胞脂肪變性[1]。流行病學(xué)報(bào)道,近年來NAFLD的患病率顯著上升,當(dāng)前在全球范圍內(nèi),NAFLD的患病率約為25%[2]。本病與長時(shí)間高脂高糖飲食密切相關(guān),此外,還與體內(nèi)胰島素受體對(duì)胰島素敏感性降低有關(guān)[3]。若NAFLD不加以控制,可逐漸進(jìn)展至非酒精性脂肪性肝炎[4]。目前,NAFLD的治療以改變生活方式為基礎(chǔ),臨床暫未發(fā)現(xiàn)具有顯著療效的藥物,多數(shù)藥物在改善肝臟脂質(zhì)的同時(shí)給肝臟帶來一定的負(fù)擔(dān),不適合長期使用,因此需要不斷探索新療法、開發(fā)新藥物[5-6]。絕大多數(shù)西藥是通過化學(xué)方法合成的藥物,是在現(xiàn)代工藝下合成的藥物;而中藥多來源于自然界中的植物、動(dòng)物、礦石等,不良反應(yīng)較少[7-8]。此外中醫(yī)對(duì)非酒精性脂肪肝有獨(dú)特見解,認(rèn)為本病屬“肝癖”范疇,病位在肝,與脾、腎相關(guān),病理因素為痰濕瘀聚于脅下所致,其中“瘀”又是核心之一[9]。丹參屬活血化瘀藥,具有祛瘀活血、養(yǎng)血安神的作用,丹參酮是中藥丹參的主要成分之一。既往研究表明,丹參酮具有保護(hù)肝臟的作用。本研究基于腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)/核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)信號(hào)通路,從氧化應(yīng)激角度探究隱丹參酮對(duì)NAFLD的治療作用,以為臨床NAFLD的藥物治療提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:60只雄性6周齡C57BL/6小鼠清潔級(jí),體重18～22 g,購于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SCXK(陜)2020-001]。小鼠飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,飼養(yǎng)于12 h/12 h光、暗交替環(huán)境,濕度50%～60%,溫度25 ℃,日常自由覓食。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:隱丹參酮(含量98%,批號(hào)35825-57-1,上海同田生物);谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、總膽固醇(Total cholesterol,TC)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)檢測試劑盒(批號(hào)C010-2-1、C009-2-1、A111-1-1、A110-1-1、A001-3-2、A003-1-2、A006-1-1,南京建成生物);HE染色試劑盒(批號(hào)ST2023,上海尚寶生物);ECL發(fā)光液(批號(hào)34578、賽默飛世爾);PVDF膜(0.45 μm)(批號(hào)IPFL00010,默克西格瑪奧德里奇公司);OCT包埋劑(批號(hào)4583,北京索萊寶);AMPK、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、Nrf2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(批號(hào)AHO1332、PA5-17831、PA5-88084、MA5-15738-D680,賽默飛世爾科技中國公司);二抗(批號(hào)HRPDS-0003,北京中杉金橋)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:常規(guī)垂直電泳儀(型號(hào)Mini-PROTEAN,美國Bio-Rad);酶標(biāo)儀(型號(hào)BIO-DL K3 Plus,上海素秋儀器);精密電子天平(型號(hào)WT20003,常州萬泰天平儀器);化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號(hào)Chemi Doc XRS+,美國Bio-Rad);組織石蠟包埋機(jī)(型號(hào)ES500,美國Them Fisher Scietific);石蠟切片機(jī)(型號(hào)HM 325,美國Them Fisher Scietific);冰凍切片機(jī)(型號(hào)EM FC7,德國徠卡)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 造模、分組與給藥:60只小鼠隨機(jī)分為正常組12只和造模組48只,造模時(shí)用普通飼料喂養(yǎng)正常組,造模組小鼠給予高脂飼料+5%的紅糖水日常飲用喂養(yǎng),高脂飼料喂養(yǎng)8周后,正常組處死2只,造模組處死8只,通過肝臟HE染色和油紅O染色檢測造模結(jié)果,結(jié)果示本研究小鼠均造模成功。造模成功后,將造模組剩余的40只小鼠隨機(jī)分為模型組、隱丹參酮低劑量組、隱丹參酮中劑量組和隱丹參酮高劑量組,每組10只。治療時(shí),正常組和模型組小鼠給予0.9%氯化鈉溶液1 ml/(kg·d)腹腔注射,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠分別給予隱丹參酮7.5、15、30 mg/(kg·d)腹腔注射,治療4周后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 取材:治療結(jié)束后,所有大鼠禁食不禁水12 h,次日取出小鼠稱重后麻醉,打開腹腔,心臟取血法收集小鼠血液,收集血液后將其置入冰塊中,以3000 r/min離心10 min取上清液,存放于-80 ℃冰箱中備用。收集血液后取出肝臟,其中左外側(cè)葉的肝臟保存于組織固定液中用于肝臟組織病理學(xué)觀察,其余肝臟組織放入超低溫冰箱中,備用于Western blot檢測。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 小鼠肝臟組織和血清TG、TC檢測:稱取100 mg肝臟組織,將其用組織提取液提取后收集上清液,定量并調(diào)平,然后采用TG和TC檢測試劑盒檢測TG、TC水平;心臟取血,離心后取上清液,檢測血清TG、TC水平。

1.3.2 小鼠血清AST、ALT、MDA、SOD水平檢測:將血清從超低溫冰箱中取出,按照試劑盒說明書,依次檢測AST、ALT、MDA、SOD水平,然后依次計(jì)算其表達(dá)水平。

1.3.3 小鼠肝臟組織HE染色和油紅O染色:從組織固定液中取出肝臟組織,用超純水將其反復(fù)沖洗后,依次將其置入70%、80%、90%、95%、100%乙醇中浸潤并脫水,然后將其浸入二甲苯溶液中進(jìn)行透明處理,最后采用石蠟包埋制作成石蠟塊。使用切片機(jī)將其切成3～5 mm薄片,切片脫蠟后,進(jìn)行HE染色和油紅O染色,然后收集圖像在光學(xué)顯微鏡下觀察,每個(gè)切片選取4個(gè)不同的視野。

1.3.4 Western blot檢測Nrf2、AMPK、p-AMPK蛋白表達(dá):稱取100 mg肝臟組織,將其用組織提取液提取后,收集上清液,定量并調(diào)平,然后采用SDS-PAGE垂直電泳將蛋白進(jìn)行電泳分離,電泳條件為80 V恒壓電泳30 min,120 V恒壓電泳60 min,電泳完成后,將目的蛋白轉(zhuǎn)移到預(yù)先用甲醇浸泡過的PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜完成后,將其取出用5%的脫脂牛奶封閉30 min,加入一抗過夜孵育,次日取出,加入二抗孵育30 min,最后采用ECL發(fā)光液進(jìn)行反應(yīng),凝膠成像儀收集圖像。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較采用Oneway ANOVA進(jìn)行,多組間比較采用LSD 方法進(jìn)行;P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠一般情況比較 正常組小鼠體毛光滑發(fā)白,反應(yīng)靈敏,喂食時(shí)精神活躍,觀察墊料濕度平均;模型組小鼠有明顯的毛色發(fā)黃干枯,反應(yīng)相對(duì)遲緩,同時(shí)墊料濕度高且明顯發(fā)臭;與模型組比較,隱丹參酮治療后,小鼠毛發(fā)、活動(dòng)等均明顯改善,其中隱丹參酮高劑量組改善最為明顯。

2.2 各組小鼠AST、ALT水平比較 見表1。模型組相較于正常組小鼠血清AST、ALT水平均呈明顯升高趨勢(P<0.05);隱丹參酮各治療組相較于模型組小鼠AST、ALT水平均明顯降低(P<0.05);隱丹參酮高劑量組與正常組小鼠ALT、AST水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組小鼠肝臟、血清TG及TC水平比較 見表2。與正常組比較,模型組小鼠血清及肝臟組織TG、TC水平均呈顯著升高趨勢(P<0.05);與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠肝臟和血清組織TG、TC水平均呈明顯降低趨勢(P<0.05)。

2.4 各組小鼠MDA、SOD、GSH水平比較 見表3。與正常組比較,模型組小鼠血清MDA水平明顯升高,SOD、GSH水平明顯降低(P<0.05);與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠MDA水平明顯降低,SOD、GSH水平明顯升高(P<0.05);隱丹參酮高劑量組與正常組小鼠MDA、SOD、GSH水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組小鼠MDA、SOD、GSH水平比較

2.5 各組小鼠肝臟組織病理學(xué)改變 肝臟組織病理學(xué)HE染色可見,正常組小鼠肝臟組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞核分布于細(xì)胞中間,細(xì)胞也未見明顯的脂肪空泡;模型組小鼠有明顯的肝臟脂肪變性,大量彌漫性的脂肪空泡聚集;與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠肝臟組織空泡數(shù)量明顯減少。肝臟組織油紅O染色可見,正常組小鼠切片未見紅色脂滴;模型組小鼠則表現(xiàn)有大量的脂滴;與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠紅色脂滴數(shù)量明顯降低,尤其是隱丹參酮高劑量組紅色脂滴數(shù)量與正常組相近。見圖1。

2.6 各組小鼠AMPK/Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與正常組比較,模型組小鼠Nrf2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠Nrf2表達(dá)明顯升高(P<0.05)。隱丹參酮低、中、高劑量組與模型組小鼠AMPK蛋白表達(dá)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與正常組比較,模型組小鼠p-AMPK蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05);與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠p-AMPK表達(dá)明顯升高(P<0.05)。見表4(圖2)。

A:正常組;B:模型組;C:隱丹參酮低劑量組;D:隱丹參酮中劑量組;E:隱丹參酮高劑量組

表4 各組小鼠AMPK/Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)通過高脂高糖飲食構(gòu)建NAFLD動(dòng)物模型。本造模相對(duì)于其他造模方法,造模時(shí)間稍長,病變程度較輕,但其簡便易行,且造模成功率高,所構(gòu)建的NAFLD動(dòng)物模型與臨床NAFLD患者的病理特征相似[10-11]。因此本研究采用高脂高糖飲食構(gòu)建NAFLD小鼠模型,小鼠肝臟組織病理學(xué)觀察顯示,正常組沒有任何脂肪空泡,而模型組則出現(xiàn)大量的彌漫性脂肪空泡,這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符,說明采用高脂高糖飲食8周能夠構(gòu)建NAFLD小鼠模型。該種造模與中醫(yī)飲食不節(jié)、情志失調(diào)等因素相關(guān),由于小鼠長期的飲食不節(jié),過食肥甘厚味,導(dǎo)致脾失健運(yùn),水濕內(nèi)停,聚而為痰;加上長期關(guān)于鼠籠情志失調(diào),肝氣郁滯,導(dǎo)致氣滯血瘀,日久痰瘀互結(jié)為病[12-14]。

NAFLD的首要病理因素為痰瘀,治療以活血化瘀為治療總綱。諸多醫(yī)家在使用活血化瘀方劑治療NAFLD時(shí),丹參使用頻率較高且多作為君藥。隱丹參酮是從丹參酮中分離得到的一種具有藥理活性的單體化合物[15-16]。研究顯示,隱丹參酮具有較高的藥理活性,其具有抗癌、抗氧化、抗衰老作用,對(duì)部分腫瘤、冠心病、心絞痛、心肌損害有一定療效;隱丹參酮可通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá),抑制活性氧的產(chǎn)生和激活NF-κB,此外其對(duì)肝臟也具有一定的保護(hù)作用[17-18]。但是尚無相關(guān)研究將隱丹參酮用于NAFLD的治療,基于此本研究探討隱丹參酮治療NAFLD的作用機(jī)制。NAFLD最顯著的病理特征為肝功能和血脂指標(biāo)的異常以及抗氧化應(yīng)激能力的降低[19-20]。為此本研究觀察了氧化應(yīng)激指標(biāo)、肝功能和血脂指標(biāo)的變化特點(diǎn),研究結(jié)果顯示高脂高糖飲食喂食小鼠后,小鼠血清和肝臟組織TG、TC水平明顯升高,肝功能AST、ALT水平也明顯升高,同時(shí)氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA水平明顯升高,而抗氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、GSH水平則明顯降低,這進(jìn)一步證實(shí)了高脂高糖飲食8周確實(shí)可以構(gòu)建NAFLD模型[21]。采用不同劑量隱丹參酮治療后,小鼠肝功能指標(biāo)AST和ALT、血清和肝臟TG、TC及氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA則明顯降低,與模型組比較,抗氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD和GSH水平明顯升高,以上研究結(jié)果證實(shí)隱丹參酮對(duì)NAFLD有一定的治療作用。

AMPK/Nrf2信號(hào)通路是近年來研究較多的信號(hào)通路,目前研究已經(jīng)證實(shí)在NAFLD發(fā)生和發(fā)展過程中,AMPK/Nrf2信號(hào)通路參與了NAFLD脂肪蓄積、炎癥反應(yīng)以及氧化應(yīng)激等多條信號(hào)軸,通過調(diào)控AMPK/Nrf2信號(hào)通路能夠較好地實(shí)現(xiàn)對(duì)NAFLD的治療[22-23]。AMPK可表達(dá)于機(jī)體的任何器官中,能被包括細(xì)胞壓力、運(yùn)動(dòng)以及激素等影響細(xì)胞代謝的物質(zhì)所激活,進(jìn)而參與炎癥與氧化應(yīng)激反應(yīng),維持葡萄糖代謝的平衡[24-25]。而Nrf2主要參與氧化應(yīng)激反應(yīng),Nrf2能夠通過上調(diào)其自身的表達(dá),進(jìn)而減少氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的生成,維持機(jī)體氧化/抗氧化平衡[26-27]。Nrf2與AMPK相互協(xié)調(diào)共同促進(jìn)了NAFLD的發(fā)生與發(fā)展[28-29]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用隱丹參酮治療后,與正常組比較,模型組小鼠Nrf2蛋白表達(dá)明顯降低;與模型組比較,隱丹參酮低、中、高劑量組小鼠Nrf2表達(dá)明顯升高。模型組小鼠p-AMPK蛋白表達(dá)相較于正常組明顯降低;相較于模型組,隱丹參酮各治療組小鼠p-AMPK表達(dá)顯著升高。以上研究結(jié)果證實(shí)隱丹參酮對(duì)AMPK/Nrf2信號(hào)通路具有明顯的調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)肝臟作用。

綜上所述,隱丹參酮可能通過調(diào)節(jié)AMPK/Nrf2信號(hào)通路,提高抗氧化能力,減少肝臟脂質(zhì)蓄積發(fā)揮肝臟保護(hù)作用。