清肺抗敏合劑下調(diào)RORγt及SOCS1/3表達(dá)改善哮喘小鼠炎癥反應(yīng)機(jī)制研究

劉 智,李巧慧,唐 菲,謝輝輝,楊 蕾

(衡水市人民醫(yī)院,河北 衡水 053099)

哮喘患者多伴隨慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性[1]。既往多數(shù)學(xué)者從Th17/Treg和Th1/Th2失衡方面進(jìn)行了大量研究,并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子維甲酸孤兒核受體γt(Retinoic acid receptor-related orphan receptor γt,RORγt)及信號(hào)傳導(dǎo)抑制因子1/3(Suppressor of cytokine signaling1/3,SOCS1/3)在哮喘中具有重要作用[2]。RORγ是維甲酸孤兒核受體(ROR)的成員之一,RORγt是RORγ在免疫細(xì)胞上特異性表達(dá)的亞型,調(diào)控人類Th17關(guān)鍵性的轉(zhuǎn)錄因子,而Th17與呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)感染后哮喘有密切關(guān)系[3-4]。SOCS蛋白家族成員與炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系,SOCS1和SOCS3是SOCS家族重要的成員,其對多種炎性因子的表達(dá)水平均有一定的抑制作用[5]。痰瘀互結(jié)是哮喘反復(fù)發(fā)作的主要病因[6]。清肺抗敏合劑以麻杏石甘湯為主方,由麻黃、杏仁、石膏、虎杖、桑白皮、柴胡、黃芩、敗醬草、蘆根、桔梗組成,具有抗炎及改善免疫功能的效果,且可以降低氣道高反應(yīng)性[7]。本研究通過誘發(fā)小鼠哮喘模型,研究清肺抗敏合劑對RORγt及SOCS1/3 mRNA的影響及對RSV誘發(fā)哮喘小鼠炎癥反應(yīng)的作用,進(jìn)而探討清肺抗敏合劑改善RSV誘發(fā)哮喘小鼠炎癥反應(yīng)的生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:60只SPF級(jí)雄性BALA/c小鼠,體重18～20 g,購于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)有限公司,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYKX(浙)2018-0099。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑:氫氧化鋁(批號(hào)20200421,成都科龍);卵清蛋白(OVA,批號(hào)WXBD2568Z,美國Sigma);乙酰甲膽堿(Mch,批號(hào)SKZX37517,美國Sigma);免疫球蛋白E(IgE)、白介素-4(IL-4)、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒和髓過氧化物酶(MPO)試劑盒(批號(hào)20200721、20200618、20200422、20200319、20200513,南京建成生物);兔抗SOCS1/3多克隆抗體(批號(hào)ab62632,美國Abcam);RORγt引物由上海市生物工程有限公司合成并提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器:動(dòng)物肺功能儀(Flexivent型,德國Emka);顯微鏡(CKX41型,日本Olympus);多功能酶標(biāo)儀(Spectra Max M4型,美國Molecular Devices);壓縮空氣式霧化器(SS-7B型,江蘇雙盛醫(yī)療器械有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 清肺抗敏合劑制備:清肺抗敏合劑由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑室制備。處方如下:麻黃3 g,杏仁、黃芩各5 g,石膏15 g,虎杖、敗醬草各10 g,桑白皮、柴胡、蘆根、桔梗各8 g;加水煎煮、抽濾、濃縮至1 g/ml,高溫滅菌后備用。

1.2.2 分組:將60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為對照組、模型組、地塞米松組(0.5 mg/kg)和清肺抗敏合劑低劑量組(17.5 mg/kg)、清肺抗敏合劑中劑量組(35.0 mg/kg)、清肺抗敏合劑高劑量組(70.0 mg/kg),每組10只。

1.2.3 哮喘模型小鼠的制備:于實(shí)驗(yàn)開始第1天,模型組和各給藥組小鼠采用多點(diǎn)致敏法皮下注射2%OVA-氫氧化鋁凝膠制備哮喘模型。致敏后第14天,各組分別腹腔注射0.2 ml的0.2% OVA,加強(qiáng)致敏7 d后,予1% OVA霧化激發(fā),并進(jìn)行灌胃給藥,每日給藥1次,連續(xù)14 d;于實(shí)驗(yàn)第21天和第35天以50 μl 1×106PFU的RSV滴入小鼠鼻腔;第35天檢測肺功能后處死小鼠并取出肺組織。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 小鼠氣道反應(yīng)性檢測:采用Emka動(dòng)物肺功能儀對小鼠的基礎(chǔ)肺功能進(jìn)行檢測。

1.3.2 肺組織病理學(xué)改變:末次給藥后,將小鼠麻醉后取出左肺小葉,固定、包埋、切片后進(jìn)行HE染色,觀察肺組織病理學(xué)改變。

1.3.3 炎癥因子及炎癥細(xì)胞水平檢測:末次給藥并麻醉后,將小鼠右側(cè)肺葉取出并結(jié)扎,用于制備肺泡灌洗液(BALF)。離心BALF并提取上清液,采用ELISA測定BALF中CD31、IgE、IL-4、TNF-α水平,采用比色法測定MPO含量。下層沉淀稀釋后,采用瑞士-吉姆薩染色分類計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞,包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞。

1.3.4 RT-PCR法檢測肺組織RORγt mRNA表達(dá)水平:取肺組織100 mg,加入0.5 ml TRIzol后提取細(xì)胞總RNA。采用紫外分光光度計(jì)測量總mRNA的純度和含量后,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,-20 ℃凍存,然后以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性0.5 min,60 ℃退火0.5 min,72 ℃延伸0.5 min,循環(huán)30次,然后72 ℃延伸10 min。RORγt上游和下游引物序列分別為5’-CGCGGAGCAGACACACTTA-3’和5’-CCCTGGACCTCTGTTTTGGC-3’,片段長度167 bp;β-actin上游和下游引物序列分別為5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3’和5’-GTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3’,片段長度540 bp。以β-actin為內(nèi)參,比較RORγt和β-actin的相對吸光度值,同時(shí)對RORγt mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析。采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

1.3.5 qPCR法測定肺組織SOCS1/3 mRNA表達(dá)水平:采用TRIzol試劑盒提取總mNRA,測定純度和含量后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸40 s,循環(huán)40 s,進(jìn)行40個(gè)循環(huán),45～95 ℃末端延伸,溫度升高0.1 ℃/s。引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析,兩組間比較和多組間比較分別采用獨(dú)立t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn);P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠相對肺阻力比較 見表2。對照組小鼠吸入梯度濃度的Mch后氣道阻力無顯著變化,而模型組吸入梯度濃度的Mch后氣道阻力與對照組比較顯著增加(均P<0.05);地塞米松組及清肺抗敏合劑不同劑量組吸入梯度濃度的Mch后氣道阻力與模型組比較顯著降低(均P<0.05)。

表2 各組小鼠相對肺阻力比較(%)

2.2 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變 HE染色結(jié)果顯示(圖1),不同劑量的清肺抗敏合劑處理后均可以改善小鼠肺組織的病理學(xué)損傷,對炎性細(xì)胞浸潤具有明顯的緩解作用。病理學(xué)評分結(jié)果顯示,模型組HE評分顯著高于對照組(P<0.05);地塞米松組和清肺抗敏合劑不同劑量組HE評分顯著低于模型組(均P<0.05),且隨著清肺抗敏合劑劑量的增加,HE評分降低。見表3。

表3 各組小鼠HE評分比較(分)

2.3 各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量比較 見表4。與對照組比較,模型組小鼠中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加(均P<0.05);與模型組比較,地塞米松組及清肺抗敏合劑小鼠中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著降低(均P<0.05)。

表4 各組小鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量比較(×105/ml)

2.4 各組小鼠BALF中CD31、IgE、IL-4、MPO和TNF-α水平比較 見表5。與對照組比較,模型組小鼠BALF中CD31、IgE、IL-4、MPO和TNF-α水平顯著增加(均P<0.05);與模型組比較,地塞米松組及清肺抗敏合劑不同劑量組小鼠BALF中CD31、IgE、IL-4、MPO和TNF-α水平顯著降低(均P<0.05)。

表5 各組小鼠BALF中CD31、IgE、IL-4、MPO和TNF-α水平比較

2.5 各組小鼠肺組織RORγt、SOCS1/3 mRNA表達(dá)水平比較 見表6。與對照組比較,模型組小鼠肺組織RORγt及SOCS1/3 mRNA表達(dá)水平顯著增加(均P<0.05);地塞米松組及清肺抗敏合劑不同劑量組小鼠組織RORγt及SOCS1/3 mRNA表達(dá)水平顯著低于模型組(均P<0.05)。

表6 各組小鼠肺組織RORγt、SOCS1/3 mRNA表達(dá)水平比較

3 討 論

哮喘在中醫(yī)學(xué)里屬于“哮病”范疇[8]。清肺抗敏合劑主方為麻杏石甘湯[9-10]。麻杏石甘湯主藥為麻黃、杏仁、石膏,解表清肺,宣肺降氣;全方寒熱并用,再配伍黃芩等藥使得清肺平喘之功更甚[11-12]。此外,虎杖的有效單體白藜蘆醇對RSV的RNA聚合酶有較好的抑制作用。全方具有補(bǔ)虛效果,進(jìn)而改善免疫功能,使氣道高反應(yīng)性降低,且可以活血化瘀,消除氣道的慢性炎癥反應(yīng),進(jìn)而發(fā)揮抗哮喘效果。支氣管哮喘是一種氣道慢性變態(tài)反應(yīng)性炎癥,以氣道高反應(yīng)性及氣道炎癥為主要臨床特征[13]。哮喘反復(fù)發(fā)作的主要病理基礎(chǔ)是氣道慢性變應(yīng)性炎癥,其主要是以嗜酸性粒細(xì)胞為主,多種炎癥介質(zhì)和炎癥細(xì)胞參與其中[14]。Th2細(xì)胞因子,如IL-4等,作為主要的促炎因子,可以促進(jìn)IgE大量分泌,加劇氣道的炎癥反應(yīng)[15]。

本研究采用BLAB/c小鼠為模型動(dòng)物,既往研究顯示其哮喘模型與人哮喘病理特征接近,且有相近的生物學(xué)特性[16-17]。本研究采用OVA致敏并激發(fā)哮喘,模型組小鼠表現(xiàn)出典型的氣道高反應(yīng)和氣道炎癥。建模成功與否的關(guān)鍵是氣道高反應(yīng),測定肺功能氣道阻力等參數(shù)是評判基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中氣道高反應(yīng)性的“金標(biāo)準(zhǔn)”[18]。本研究結(jié)果顯示,模型組小鼠氣道阻力顯著高于對照組,且炎癥因子水平明顯提高,證實(shí)哮喘模型建立成功。本研究結(jié)果顯示,不同劑量清肺抗敏合劑處理后均可以改善小鼠肺組織的病理學(xué)損傷,緩解炎性細(xì)胞浸潤;清肺抗敏合劑不同劑量組小鼠肺組織病理半定量評分均顯著低于模型組,且具有一定的劑量依賴性。與模型組比較,清肺抗敏合劑不同劑量組小鼠中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量均顯著降低,CD31、IgE、IL-4、MPO和TNF-α水平均顯著降低。既往研究顯示,清肺抗敏合劑中柴胡具有治療咳嗽變異性哮喘的作用?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示,清肺抗敏合劑中柴胡可抗病毒、抗炎,提高免疫功能。柴胡提取物對NF-κB信號(hào)途徑具有抑制作用,進(jìn)而降低Th2/Th17細(xì)胞因子如IL-4、TNF-α、RORγ等的表達(dá)水平,減少炎癥細(xì)胞的積聚,進(jìn)而起到改善哮喘炎癥反應(yīng)的作用[19]。方中黃芩中多種活性成分如黃芩苷等具有抵抗RSV病毒感染的作用,進(jìn)而改善炎癥反應(yīng),減輕肺損傷。桑白皮的有效成分可以調(diào)控RSV肺炎小鼠PI3K/Akt信號(hào)通路與血清IFN-γ、IL-4的表達(dá)。

目前,Th17/Treg失衡學(xué)說在哮喘的發(fā)病機(jī)制中受到廣泛關(guān)注。RORγt是由Th17分化而來的特異性轉(zhuǎn)錄因子,可以促進(jìn)IL-17細(xì)胞因子表達(dá)和分泌,促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化,在免疫性疾病、感染性疾病及腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中都具有重要的參與作用[20]。RORγt可以通過誘導(dǎo)和促進(jìn)外周和淋巴組織,促進(jìn)Th0向Th17細(xì)胞的分化[21]。RORγt表達(dá)過量會(huì)增加IL-17的表達(dá)水平,而RORγt表達(dá)不足會(huì)降低IL-17的表達(dá)水平[22]。SOCS已被證實(shí)與多種炎性疾病有關(guān),且在Th1/Th2失衡學(xué)說中有重要作用。SOCS1在Th1細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于Th2細(xì)胞,而SOCS3在Th1細(xì)胞中表達(dá)水平低于Th2細(xì)胞[23]。本研究結(jié)果顯示,與模型組比較,清肺抗敏合劑組小鼠組織RORγt及SOCS1/3 mRNA表達(dá)水平均顯著降低。方中敗醬草和麻黃對氣道炎癥細(xì)胞浸潤具有抑制作用;桔梗中總皂苷能改善RSV感染所致的小鼠肺部炎癥反應(yīng);蘆根水提取物具有治療支氣管哮喘功效,可以調(diào)節(jié)Th1/Th2免疫失衡,緩解氣道慢性炎癥[24]。

綜上所述,清肺抗敏合劑可以通過下調(diào)RORγt及SOCS1/3 mRNA表達(dá)改善呼吸道合胞病毒誘發(fā)哮喘小鼠炎癥反應(yīng)。