櫟屬植物組織培養(yǎng)研究現(xiàn)狀

羅珍珍 張嬋嬋 劉瀟陽 高 瑞

（1榆林市林木種苗工作站，陜西榆林 719000；2榆林市林業(yè)科學(xué)研究所，陜西榆林 719000；3榆林市草原工作站，陜西榆林 719000；4麻黃梁黃土地質(zhì)公園開發(fā)建設(shè)中心，陜西榆林 719000）

櫟屬樹種種類豐富，分布范圍廣，具有重要的生態(tài)價值和經(jīng)濟(jì)價值。廣義的櫟屬包括青岡亞屬，狹義的櫟屬僅包括櫟亞屬，即Camus[1]定義的櫟亞屬，中國分布有60余種[2]。櫟屬植物分布于我國各地，普遍為森林組成樹種[3]。櫟屬樹種普遍具有良好的木材品質(zhì)，可以用于家具或作為優(yōu)質(zhì)建材使用，其果實(shí)、葉片還可用作飼料等[4]。櫟樹在工業(yè)原料、生態(tài)恢復(fù)、家具用材、環(huán)境美化等方面有顯著的功效及經(jīng)濟(jì)價值。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用組織培養(yǎng)技術(shù)已獲得1 500多種的再生植物，累計(jì)130 多科[5]，其中有涵蓋了果樹的400多種的木本植物，且數(shù)量依舊在不斷遞增[6]。組織培養(yǎng)已被應(yīng)用于櫟屬植物的多個物種（見表1）。

表1 部分櫟屬植物組織培養(yǎng)情況

1 外植體選取

組織培養(yǎng)合理挑選外植體是特別重要的一步，需要挑選有較強(qiáng)分化能力的材料，進(jìn)而確保可以成功進(jìn)行組培。造成組培植物生理形態(tài)差異的因素主要有外植體的基因型、親本材料的年齡、生長環(huán)境，以及發(fā)育時期、取材季節(jié)、取材部位、天氣現(xiàn)狀等[21]。

外植體的基因型影響組培效果。張存旭[8]以4 株栓皮櫟的未成熟合子胚作為外植體進(jìn)行體胚誘導(dǎo)，研究發(fā)現(xiàn)母樹基因型對體胚誘導(dǎo)率有顯著影響。魏爽[11]在遼東櫟母樹基因型試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，不同母樹基因型體胚發(fā)生頻率差異較大。

不同的取材區(qū)域也存在不同的誘導(dǎo)成效。唐羅忠等[22]分析和對比了種胚、去皮種子、嫩枝、幼嫩莖、一年生木質(zhì)枝條等的組培成效，結(jié)果表明，嫩枝和嫩莖有良好的成效，試驗(yàn)過程中污染少、組培苗成活率比較高、小苗生長和發(fā)育迅速。蘇瑪櫟自然條件下萌發(fā)的枝條，無論是頂芽還是帶腋芽的莖段，都存在非常嚴(yán)重的污染與褐變情況，沒有通過離體培養(yǎng)獲得再生植株[14]。Vengadesan等[18]將從體外生長8周齡的幼苗上切下的子葉節(jié)作為外植體，通過叢芽誘導(dǎo)，成功對北美紅櫟枝條進(jìn)行了體外繁殖。通過對栓皮櫟未成熟合子胚、葉片、莖段3種外植體的體胚誘導(dǎo)比較發(fā)現(xiàn)，未成熟合子胚的體胚誘導(dǎo)率累計(jì)57.8%，和莖以及葉片的誘導(dǎo)率有顯著差異，莖的誘導(dǎo)成功率為25%，葉片的體胚誘導(dǎo)率為35%[4]。

能否成功進(jìn)行組織培養(yǎng)的主要影響因素之一為取材階段，具體取材時期因樹種而異。成齡栓皮櫟要想獲得較好的組培效果，最佳采集外植體的階段為3月上旬至4月上旬，在這期間采集外植體進(jìn)行試驗(yàn)，萌芽率超過90%[23]。4—5月采集的大樹嫩枝，污染率低、萌芽率高，為最適合采集大樹嫩枝的階段；采集幼苗莖段的階段為4 月和6 月，只有13.1%、14.3%的污染率，實(shí)現(xiàn)了74.7%、72.1%的萌芽率[22]。8 月上旬為遼東櫟體胚誘導(dǎo)的最佳采樣時間，此時未成熟合子胚體胚誘導(dǎo)率最高，為88.7%，與其他時期相比，誘導(dǎo)產(chǎn)生的體胚生長健壯、整齊[11]。

2 培養(yǎng)基選擇

研究表明，夏櫟在WPM、BTM 培養(yǎng)基內(nèi)，比在GD、MS 培養(yǎng)基中有更大的誘導(dǎo)率，且生長更好；MS 培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率較低，為10%~25%，GD 培養(yǎng)基內(nèi)，誘導(dǎo)的嫩芽較短時間就枯死[24]。谷櫟叢芽誘導(dǎo)研究表明，基礎(chǔ)培養(yǎng)基對外植體的芽誘導(dǎo)數(shù)有顯著影響，BTM 和GD 培養(yǎng)基上誘出的芽總體上生長健壯，而在WPM 培養(yǎng)基上的芽通常萎黃[25]。李文文等[26]在基本培養(yǎng)基對蒙古櫟腋芽啟動和生長的影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，1/2 MS 培養(yǎng)基比BTM 和MS 培養(yǎng)基更有利于腋芽的啟動和生長，腋芽在BTM 和MS 培養(yǎng)基上啟動時間長，芽生長情況差，不伸長，后期直接枯死；而在1/2 MS培養(yǎng)基中啟動時間最早，有效芽數(shù)量最多，芽生長最為健壯，平均長約3.00 cm，最長5.20 cm；在WPM 培養(yǎng)基上生長狀況一般。呂秀立等[14]以MS、1/2 MS、WPM 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)試管苗在WPM培養(yǎng)基中比在MS、1/2 MS培養(yǎng)基上生長更好，在MS、1/2 MS 培養(yǎng)基的試管苗均生長較差，苗發(fā)黃莖細(xì)弱，生長一段時間后逐漸衰弱。由此可見培養(yǎng)基中某些元素的含量以及種類對櫟屬組培苗的生長有明顯影響。

在同一樹種不同誘導(dǎo)途徑的試驗(yàn)中，同一基本培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果千差萬別，因此不同誘導(dǎo)途徑對基本培養(yǎng)基的選擇也會不同。栓皮櫟莖段的離體培養(yǎng)選用低鹽培養(yǎng)基WPM、BTM、GD 比高鹽培養(yǎng)基MS誘導(dǎo)產(chǎn)生的叢生芽多，莖粗壯[27]，胚軸伸長快，誘導(dǎo)率也較高[8]。于艷等[28]在研究麻櫟的不定芽誘導(dǎo)時發(fā)現(xiàn)，選用1/4 MS（2倍鐵鹽）作為基本培養(yǎng)基時，誘導(dǎo)效果比MS、WPM培養(yǎng)基更好，誘導(dǎo)率達(dá)86.7%，且褐化率僅為5.0%。廖婧[29]利用麻櫟成熟合子胚進(jìn)行體胚誘導(dǎo)時發(fā)現(xiàn)，MS基本培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果好于WPM基本培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基的主要特點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度高，含有微量元素種類多，可以促進(jìn)體胚發(fā)生[30]。

同種材料處于初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)等不同階段時所用培養(yǎng)基也有所不同。研究認(rèn)為低鹽培養(yǎng)基更利于組培苗生根，因此在生根階段所用培養(yǎng)基的大量元素含量可以在原來的基礎(chǔ)上減半。在BMT 培養(yǎng)基中開展大葉櫟繼代培養(yǎng)，單芽生根試驗(yàn)在1/2 BMT培養(yǎng)基中開展和實(shí)施[31]。遼東櫟誘導(dǎo)叢生芽以及增殖芽的最佳培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，增殖系數(shù)高達(dá)4.3，生根培養(yǎng)環(huán)節(jié)應(yīng)用了降低大量元素含量的1/2 MS 培養(yǎng)基，不定芽生根率最高達(dá)77.8%[11]。蘇瑪櫟在1/2 MS基本培養(yǎng)基上初代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)在WPM培養(yǎng)基上生長情況更好，試管外生根率高達(dá)80%[14]。北美紅櫟的子葉節(jié)在MS 培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)率達(dá)到64.7%，而芽增殖和伸長在WPM 培養(yǎng)基上達(dá)到最佳，最高為73.3%[18]。蒙古櫟促萌莖段的離體培養(yǎng)過程中，在WPM 培養(yǎng)基上初代培養(yǎng)比在MS 和1/2 MS培養(yǎng)基上效果更好，腋芽生長伸長明顯，產(chǎn)生的叢生芽更多[12]。

3 植物生長調(diào)節(jié)劑對組織培養(yǎng)的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑的使用視具體情況而定，相同或不同植物途徑不同其應(yīng)用的植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度、種類等也有顯著的差別。

在成齡栓皮櫟的芽誘導(dǎo)中，6-BA是最利于芽誘導(dǎo)的細(xì)胞分裂素，過高濃度的6-BA促使植株形成愈傷組織，但會導(dǎo)致植株生長異常，0.2 mg/L的濃度最有利于成齡栓皮櫟芽誘導(dǎo)[23]。體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中不同階段需要添加不同的植物生長調(diào)節(jié)劑。張存旭[8]在栓皮櫟體胚誘導(dǎo)研究中發(fā)現(xiàn)，在繼代過程中，添加1.0 mg/L 6-BA 和0.25 mg/L NAA 更有利于體胚的增殖。趙丹[9]在誘導(dǎo)麻櫟腋芽萌發(fā)時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中添加1.0 mg/L 6-BA 時，腋芽顏色深綠，長勢較好；在進(jìn)行芽增殖時，相同濃度處理水平下，使用生長素NAA 的增殖系數(shù)均比用IBA 的增殖系數(shù)大；而對于細(xì)胞分裂素，6-BA 增殖效果要好于KT，濃度為1.0 mg/L 時，叢生芽長勢最好，6-BA 對麻櫟幼苗莖段芽的增殖生長起決定性作用，1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA是幼苗莖段增殖的最佳組合。麻櫟葉片誘導(dǎo)愈傷組織使用生長素2，4-D的效果要好于NAA，最佳濃度為1.5 mg/L。廖婧[29]將麻櫟成熟合子胚作為外植體，在體胚誘導(dǎo)中，將1.0 mg/L 6-BA與1.0 mg/L IBA 組合，獲得最佳誘導(dǎo)效果；將莖、葉作為外植體的體胚誘導(dǎo)中，又添加了0.1 mg/L TDZ。呂秀立等[15]利用蘇瑪櫟的莖、葉作為外植體，在MS+2 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT 的組合中獲得了較多的愈傷組織；而在增殖過程中，3.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA 的培養(yǎng)效果最好。歐洲栓皮櫟的葉片用于體胚誘導(dǎo)中，1.0 mg/L 2，4-D 與2.0 mg/L ZT 組合獲得了較高的誘導(dǎo)率[17]。對于蒙古櫟叢生芽的誘導(dǎo)，0.5 mg/L 2，4-D和6-BA一起使用誘導(dǎo)率達(dá)到76.7%，誘導(dǎo)效果最好；而在增殖階段，0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA是最佳組合，增殖系數(shù)可達(dá)到3.5[12]。6-BA作為有效的細(xì)胞分裂素，具有良好的誘導(dǎo)芽形成的能力，因此在增殖培養(yǎng)過程中，提高其濃度，有利于形成較多數(shù)量的叢生芽。

除了6-BA、2，4-D、NAA、IBA 等常用的植物生長調(diào)節(jié)劑，在有些試驗(yàn)中也會加入GA3、ABA等。北美紅櫟以子葉節(jié)為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)時，WPM中添加1.0 mg/L 6-BA、0.1 mg/L GA3的誘導(dǎo)效果好于MS添加6-BA和TDZ，芽誘導(dǎo)率高，誘導(dǎo)的叢芽數(shù)量多[18]。Purohit 等[32]也提出，雖然1.0 mg/L GA3可以協(xié)同6-BA進(jìn)一步提高芽誘導(dǎo)數(shù)量與芽高度，但會使芽生長細(xì)弱。張存旭[8]在進(jìn)行栓皮櫟體胚的成熟培養(yǎng)時，在MS培養(yǎng)基中加入了ABA，體胚的成熟率提高了3倍以上，低濃度的ABA（0.5 mg/L）使成熟體胚子葉明顯伸長變綠，偶有體胚會產(chǎn)生胚根。

4 生根培養(yǎng)

目前，生根培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)的一個難題。與作物相比，林木生根難度更大。因此，生根培養(yǎng)的難題是木本植物組織培養(yǎng)必須要重視的問題。

在生根培養(yǎng)中，適當(dāng)降低培養(yǎng)基中礦質(zhì)元素濃度，生長調(diào)節(jié)劑只添加生長素，提高蔗糖濃度是誘導(dǎo)生根最常用手段。魏爽[11]在遼東櫟的生根培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在蔗糖濃度為30 g/L時，叢生芽在1/2 MS培養(yǎng)基中的生根情況比MS 更好，生根率提高了40%，平均根長為3.8 cm，且根系長勢很好；蔗糖濃度主要影響根的粗度和長度，蔗糖濃度為20 g/L時，盡管有健碩的根系，但平均根長度只有2.5 cm，葉片發(fā)黃，苗情不好。張存旭等[27]表示應(yīng)用NAA進(jìn)行生根誘導(dǎo)中，伴隨濃度的提高其生根率也表現(xiàn)出逐漸遞增的發(fā)展態(tài)勢，首先在IBA 濃度為0.5 g/L 的溶液內(nèi)浸泡1 min，隨后轉(zhuǎn)入空白培養(yǎng)基，僅需很短的出根時間，根長而粗壯，大多有側(cè)根，但生根率很低，并且在莖段區(qū)域有很大的愈傷塊；在培養(yǎng)基內(nèi)添加1.0 mg/L IBA 的處理，芽基部愈傷比前一處理小，生根率較高，苗生長正常，但形成的根數(shù)偏少。0.1 mg/L NAA+0.25 mg/L IBA 的組合最有利于栓皮櫟生根，生根率高，根系質(zhì)量好。丁世民等[13]得出誘導(dǎo)沈氏櫟試管苗生根的最佳組合是1/2 MS+0.4 mg/L NAA，生根率最高為97.7%，每莖段平均生根2.93 條，1/2 MS 比MS 與1/4 MS 更適合沈氏櫟生根，當(dāng)NAA濃度超過0.4 mg/L 后，生根率和平均生根條數(shù)反而降低。在蒙古櫟芽苗的生根培養(yǎng)中，1/4 MS 培養(yǎng)基添加20 g/L 蔗糖時，大部分芽苗枯黃、死亡，而添加30 g/L 蔗糖更有利于芽苗生長，能促進(jìn)生根[26]。添加0.1 mg/L IBA＋0.5 mg/L NAA 的1/2 MS培養(yǎng)基為蒙古櫟莖段的最佳生根培養(yǎng)基，生根率達(dá)到76.7%，每個單株的平均根數(shù)可以達(dá)到4.3 條，NAA 濃度超過0.5 mg/L 后生根率降低，表明較高的NAA 濃度會抑制生根[12]。于艷[28]在麻櫟組培體系優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，生根培養(yǎng)時NAA 處理后長出的根多為愈傷根，移栽不易成活，IBA比NAA更有利于麻櫟小苗生根。Chalupa[20]研究發(fā)現(xiàn)，材料越幼嫩越利于生根，影響生根的因素中基因型的影響力大于基本培養(yǎng)基與植物生長調(diào)節(jié)劑，12 個不同無性系的生根率為14%~86%。

此外，生根還有一步生根法、兩步生根法等。北美紅櫟的變種就用了兩步生根法，先將1.5~2.0 cm的繼代芽接入到含25 mg/L IBA 的1/2 WPM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，之后轉(zhuǎn)移到不含植物生長調(diào)節(jié)劑的1/2 WPM+4 g/L AC 培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接后不需要進(jìn)行暗處理，多個變種的生根率達(dá)到70%~90%[19]。

5 存在的問題與解決方法

5.1 污染

櫟屬組織培養(yǎng)中存在污染問題，造成污染的原因有許多，對污染原因的研究多是關(guān)于材料取材時期、消毒時間、外植體類型等。楊鋒利[23]從3—7 月每個月對栓皮櫟母株取材，在早春3 月上旬采集的成齡莖段誘導(dǎo)的嫩枝做外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)的效果最好，污染率只有6.6%，萌發(fā)率達(dá)96.7%，夏季7 月采集的莖段培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)效果最差，污染率達(dá)56.7%，萌發(fā)率僅為63.3%。這主要是因?yàn)? 月份外植體處于休眠后期，即生長停止，營養(yǎng)物質(zhì)積累，即將進(jìn)入萌發(fā)期，生理活性水平升高；同時此時氣溫低，雨水少，病菌等不易滋生，材料不易污染。消毒時間的選擇也很重要，消毒時間短不能有效殺死病菌，消毒時間過長時，消毒更徹底，污染率較低，但同時對植株的毒害作用較嚴(yán)重。栓皮櫟種子在0.1%升汞中消毒25 min，對胚的誘導(dǎo)效果最好；而胚根消毒4 min效果最好[23]。用麻櫟的去皮種子、大樹1年生木質(zhì)化枝條和胚作為外植體，污染率分別為70%、75%、50%，且萌發(fā)情況不好，死亡率較高，而選用種子萌發(fā)的幼苗和麻櫟大樹嫩枝作為外植體，污染率分別為5.0%、23.8%，萌發(fā)率分別為50%、70.7%，試驗(yàn)效果較好[9]。

5.2 褐化

導(dǎo)致櫟屬植物培養(yǎng)材料褐變的因素很多，外植體的基因型不同、材料本身的生理性狀不同都會影響外植體的褐化。防止褐變的主要措施有選擇分生能力較強(qiáng)的材料作為外植體，在培養(yǎng)基中加入活性炭等抗褐化劑，在培養(yǎng)初期進(jìn)行連續(xù)轉(zhuǎn)移等。

在組織培養(yǎng)防止褐化的研究中，抗褐化劑主要有維生素C、硝酸銀（AgNO3）等[33]。劉光金等[34]發(fā)現(xiàn)，在不添加AC與維生素C的培養(yǎng)基上大葉櫟的褐化率高達(dá)80%，而在培養(yǎng)基中添加1.0~3.0 g/L AC或0.1~0.3 g/L 維生素C 之后褐化率降低至42.5%~58.3%。丁彤[35]研究表明，AgNO3、PVP、Na2S2O3、AC這4種抗褐化劑中，Na2S2O3抗褐化效果最好，在培養(yǎng)基中添加200 mg/L Na2S2O3的處理可將北美紅櫟的褐化/死亡率降低至20%。李文文等[26]在培養(yǎng)基中添加0.2 g/L PVP能有效抑制蒙古櫟外植體褐化，褐化率和褐化程度都明顯降低。另外，于艷等[36]研究認(rèn)為，選用5 年生實(shí)生苗幼嫩莖段作為外植體，0.1%HgCl2溶液表面消毒7 min 后接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在初代培養(yǎng)前期暗培養(yǎng)5~7 d，褐變死亡率可降至5%以下。

6 展望

櫟屬植物組織培養(yǎng)除了少數(shù)樹種組培技術(shù)比較成熟之外，依舊有很多樹種目前處于探索時期，獲得成功的樹種普遍是將幼嫩材料作為外植體，而老齡樹則很難，關(guān)鍵的問題為：①誘導(dǎo)培養(yǎng)時，污染與褐化嚴(yán)重；②繼代培養(yǎng)時，玻璃化及褐化現(xiàn)象普遍存在；③生根培養(yǎng)時，器官培養(yǎng)生根困難，體胚發(fā)生萌發(fā)階段也會出現(xiàn)生根困難等問題。

木本組織培養(yǎng)研究目的主要是進(jìn)行優(yōu)良種質(zhì)無性化推廣。要打破木本植物組織培養(yǎng)技術(shù)的瓶頸，下一步研究關(guān)鍵包括以下幾個方面：①優(yōu)良單株的高效幼化技術(shù)。通過對成齡材料進(jìn)行修剪、誘導(dǎo)根萌條，能夠有效提高成齡材料的組織培養(yǎng)效果。②基本培養(yǎng)基礦質(zhì)元素、有機(jī)物質(zhì)等的優(yōu)化調(diào)控，可提高增殖效果及芽的質(zhì)量。目前的研究試驗(yàn)中使用的培養(yǎng)基多為WPM、BMT、MS等固定元素含量的基本培養(yǎng)基，部分研究中會將這些培養(yǎng)基的礦質(zhì)元素含量降為1/2或1/4，受經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)水平的限制，大部分試驗(yàn)中都沒有對其中元素進(jìn)行調(diào)配。這也是今后的一個研究方向。③以成年優(yōu)樹為母本材料的體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)。大樹葉誘導(dǎo)體胚的成功，對于經(jīng)遺傳測定的優(yōu)良基因型的擴(kuò)繁具有重要意義；合子胚等幼年組織誘導(dǎo)率可達(dá)100%，而成年材料誘導(dǎo)率一般僅有20%[8]，因此，成年材料體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)的優(yōu)化提升也是未來研究的一個方向。

櫟屬植物的組織培養(yǎng)研究還有很大的發(fā)展空間，其技術(shù)研究有待進(jìn)一步深入，褐變、玻璃化、生根等技術(shù)難題需要科研人員更多的努力，才能取得新的突破。隨著櫟屬組織培養(yǎng)技術(shù)的成熟及其在櫟屬植物育種和遺傳轉(zhuǎn)化中的廣泛應(yīng)用，櫟屬植物的經(jīng)濟(jì)價值、生態(tài)價值和園林應(yīng)用價值也將得到更大程度的發(fā)揮。