半枝蓮水提液體外抑菌及抑菌穩(wěn)定性研究

錢志瑤 羅永迪 李麗瓊 覃容貴

[摘要]?目的?探究半枝蓮水提液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、恥垢分枝桿菌的體外抑菌活性及抑菌穩(wěn)定性，為臨床應用及開發(fā)植源性抑菌藥物提供研究基礎。方法?采用紙片擴散法測定半枝蓮水提液對供試菌的抑菌活性，瓊脂稀釋法測定其最小抑菌濃度（minimum?inhibitory?concentration，MIC）；同時以抑菌圈直徑為指標，探究鹽濃度、紫外光照射和不同pH對半枝蓮水提液抑菌穩(wěn)定性的影響。結果?半枝蓮水提液對4種供試菌有抑菌活性，抑菌圈直徑分別為（18.27±0.25）、（18.0±0.50）、（17.7±0.26）、（18.0±0.00）mm，為高度敏感，MICs分別為5.41、6.08、6.08、5.41mg/ml。抑菌穩(wěn)定性實驗結果表明，鹽濃度、紫外光照射、pH對半枝蓮水提液體外抑菌活性均無顯著影響（P>0.05），抑菌活性保留率均>95.0%。結論?半枝蓮水提液對4種供試菌有良好的體外抑菌活性和抑菌穩(wěn)定性。

[關鍵詞]?半枝蓮；紙片擴散法；瓊脂稀釋法；最小抑菌濃度；抑菌穩(wěn)定性

[中圖分類號]?R945??????[文獻標識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.21.015

Study?on?antibacterial?activity?and?stability?of?Scutellaria?barbata?aqueous?extract?in?vitro

QIAN?Zhiyao1，?LUO?Yongdi1，?LI?Liqiong1，?QIN?Ronggui2

1.School?of?Public?Health，?Guizhou?Medical?University，?Guiyang?550025，?Guizhou，?China;?2.School?of?Pharmaceutical，?Guizhou?Medical?University，?Guiyang?550025，?Guizhou，?China

[Abstract]?Objective?To?explore?the?antibacterial?activity?and?stability?of?Scutellaria?barbata?aqueous?extract?on?Escherichia?coli，?Staphylococcus?aureus，?Pseudomonas?aeruginosa?and?Mycobacterium?smegmatis?in?vitro.?It?provides?the?research?basis?for?clinical?application?and?the?development?of?phyto-bacteriostatic?drugs.?Methods?The?antibacterial?activity?of?Scutellaria?barbata?aqueous?extract?was?determined?by?the?disk?diffusion?method，?and?the?minimum?inhibitory?concentration?（MIC）?was?determined?by?the?agar?dilution?method.?At?the?same?time，?the?diameter?of?the?inhibition?zone?was?taken?as?an?indication，?and?the?effects?of?salt?concentration，?ultraviolet?irradiation?and?different?pH?on?the?antibacterial?activity?of?Scutellaria?barbata?aqueous?extract?were?investigated.?Results?The?Scutellaria?barbata?aqueous?extract?had?antibacterial?activity?against?the?four?tested?bacteria.?The?diameter?of?the?inhibition?zone?was?（18.27±0.25），?（18.0±0.50），?（17.7±0.26），?and?（18.0±0.00）?mm?respectively，?which?were?highly?sensitive，?and?the?MICs?were?5.41，?6.08，?6.08，?5.41mg/ml?respectively.?The?results?of?the?bacteriostatic?stability?test?showed，?Salt?concentration，?UV?irradiation?and?pH?had?no?significant?effect?（P>0.05）?on?the?external?antibacterial?activity?of?the?aqueous?extract，?and?the?retention?rates?of?antibacterial?activity?were?greater?than?95.0%.?Conclusion?The?Scutellaria?barbata?aqueous?extract?showed?good?antibacterial?activity?and?stability?in?vitro?against?the?four?tested?bacteria.

[Key?words]?Scutellaria?barbata;?Disk?diffusion;?Agar?dilution?method;?MIC;?Stability

半枝蓮屬唇形科黃芩屬多年生草木植物，其名最早見于《外科正宗》，是一種被少數民族廣泛應用的清熱解毒類中草藥，臨床上用于大腸癌、卵巢癌、食管癌等的治療[1-2]。近年來，國內外學者對半枝蓮水提物的研究越發(fā)深入，美國加州大學的一項研究報道，半枝蓮水提物對早期激素敏感或晚期激素不敏感的乳腺癌、前列腺癌細胞系有抗增殖作用[3]。濟南市第四人民醫(yī)院美容整形燒傷外科團隊利用半枝蓮水提物合成一種納米銀離子，能有效抑制耐藥菌株和敏感菌株生物膜的形成，并能有效對抗革蘭陽性菌、革蘭陰性菌和真菌，是有效的傷口愈合藥物[4]。

抗生素的過度使用與濫用導致微生物對抗生素耐藥性問題日趨嚴重，現(xiàn)已成為全球公共衛(wèi)生危機，而加快新型抗菌藥物的研發(fā)是解決抗生素耐藥性問題的途徑之一[5]。藥用植物在治療由病毒、細菌、真菌等引起的感染性疾病方面的歷史源遠流長，其來源廣泛，具有高安全性、多靶向作用、廣譜抑菌、耐藥率低等優(yōu)點，可減緩微生物耐藥性的產生甚至消除耐藥性[6]。英國南丁格爾醫(yī)院公共衛(wèi)生實驗室的一項研究也表明，隨著抗生素耐藥性的持續(xù)出現(xiàn)，進一步探討藥用植物制劑潛在的抗菌特性，是天然新型抗菌劑的主要來源[7]。

半枝蓮的臨床用藥以膠囊劑、片劑為主，學者們對其關注的領域主要集中在抗腫瘤方面，在抑菌活性方面的相關研究報道則相對較少。但有研究者將半枝蓮水提液制備成抑菌凝膠，復配其他中藥可用于久經不愈的皮膚外傷治療，進一步拓寬其應用與研究領域，藥用價值得以提高[8]。因此，半枝蓮水提液作為傳統(tǒng)中藥制劑，本文對其體外抑菌作用及抑菌穩(wěn)定性進行研究，以期為臨床應用價值的研究及新型植源性抑菌藥物的開發(fā)提供研究基礎。

1??材料與方法

1.1??藥材、菌株、試劑與儀器

半枝蓮中藥飲片購自貴陽道生健康產業(yè)藥材飲片生產有限公司。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、恥垢分枝桿菌購自云南登樓生物科技有限公司。營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、酪蛋白瓊脂（mueller-hinton，MH）培養(yǎng)基均購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司。頭孢呋辛購自蘇州二葉制藥有限公司。鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉試劑均購自上海山浦化工有限公司。GR60DA高壓蒸汽滅菌器購自美國Zealway公司。WGZ-XT細菌濁度儀購自杭州齊威儀器有限公司。JB-CJ-2FC潔凈工作臺購自蘇州佳寶凈化工程設備有限公司。GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱購自上海齊欣科學儀器有限公司。RE-52AA旋轉蒸發(fā)器購自上海亞榮生化儀器廠。

1.2??實驗方法

1.2.1??樣品制備??稱取適量半枝蓮中藥飲片，加入20倍蒸餾水，浸泡30min后置電熱套上加熱，保持微沸30min，提取兩次，濾去藥渣，合并濾液置旋轉蒸發(fā)儀中減壓干燥成浸膏。稱取適量浸膏，加蒸餾水制成適宜濃度樣品溶液用于定性考察半枝蓮水提液是否具有抑菌活性。

1.2.2??菌懸液制備??無菌條件下，用接種環(huán)從活化的含菌平板中挑取單個菌落接種于已滅菌的營養(yǎng)肉湯中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h。增菌完成，無菌蒸餾水將各菌分別稀釋至3×105CFU/ml，濁度儀測定。因稀釋后的菌液中營養(yǎng)物質較少，菌體的活性逐漸降低，各稀釋菌懸液控制在15min內使用。

1.2.3??體外抑菌活性測定??①紙片擴散法測定抑菌圈：稱取適宜半枝蓮水提液浸膏，加蒸餾水配制成0.05、0.10、0.50、1.00、1.50、2.00g/ml各濃度試樣。制直徑為6mm的圓濾紙片，滅菌，烘干，備用。制直徑90mm無菌MH培養(yǎng)基平板，備用。取濃度3×105CFU/ml菌懸液100μl于MH培養(yǎng)基平板上，涂布棒涂抹均勻，制成含菌平板。將滅菌圓濾紙片按“品”字形分布貼于含菌平板上，無菌蒸餾水為空白對照、頭孢呋辛為陽性對照、半枝蓮水提液為試樣，每片圓濾紙片對應滴加20μl溶液。處理后將各平板置于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18h后觀察有無抑菌圈，并用直尺測量直徑大小（mm）。結果判讀：紙片邊緣無菌生長，形成透明的抑菌圈，則判斷有抑菌活性，以抑菌圈直徑大小判斷藥物對供試菌的敏感度高低，≥20mm為極敏、15mm≤高敏<20mm、10mm≤中敏<15mm、<10mm為低敏。重復平行三次試驗。②瓊脂稀釋法測定最小抑菌濃度：預實驗分別考察半枝蓮水提液在83.33、41.67、20.83、10.42、5.21、2.60、1.30mg/ml濃度范圍對4種供試菌的抑菌情況，初步確定半枝蓮水提液對各菌的MIC區(qū)間10.42～5.21mg/ml。制備直徑35mm含藥MH培養(yǎng)基平板：將半枝蓮水提液與MH培養(yǎng)基以一定比例混合，制得含藥MH培養(yǎng)基平板，含藥濃度分別為10.42、8.75、8.08、7.42、6.75、6.08、5.41、5.21mg/ml。同時設置不含藥MH培養(yǎng)基平板為空白對照，頭孢呋辛為陽性對照。用1μl定量接種環(huán)取濃度3×105CFU/ml菌懸液，于含藥平板四等分區(qū)域內分別接種1點，置37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h。結果判讀：將各平板置于暗色、無反光的表面上觀察，無菌落生長的最低藥物濃度判定為該藥對供試菌的MIC。重復平行三次試驗。

1.2.4??抑菌穩(wěn)定性試驗??分別以質量分數2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的氯化鈉溶液為溶劑配制適宜濃度半枝蓮水提液試樣，考察鹽濃度對試樣抑菌活性的影響。將適宜濃度半枝蓮水提液試樣分別紫外光照射20、30、40、50和60min，考察紫外光照射對試樣抑菌活性的影響。以鹽酸、氫氧化鈉配制pH分別為5、6、7、8、9的溶液，以此為溶劑配制不同pH適宜濃度半枝蓮水提液試樣，考察pH對試樣抑菌活性的影響。以相應影響因素試液為溶劑空白，蒸餾水配制的樣品溶液為對照，以上文“①”中所述方法測定不同因素影響下半枝蓮水提液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、恥垢分枝桿菌的抑菌圈大小，計算抑菌活性保留率[9]。抑菌活性保留率（%）=[1–（d0–d1）/d0]×100%；其中d0為對照抑菌圈直徑，d1為試樣抑菌圈直徑。

1.3??統(tǒng)計學方法

采用GraphPad?prism?9.0統(tǒng)計學軟件對數據進行處理分析，所有數據先進行正態(tài)性和方差齊性檢驗，其中計量資料若符合正態(tài)分布以均數±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用例數（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗或秩和檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2??結果

2.1??半枝蓮水提液抑菌活性

試藥紙片邊緣均無細菌生長，具有明顯的抑菌圈（圖1）。隨著半枝蓮水提液濃度的增加，4種供試菌的抑菌圈直徑逐漸增大，濃度為1.00～1.50g/ml時，抑菌圈直徑變化趨勢不明顯，濃度>1.50g/ml時，抑菌圈直徑有變小趨勢（圖2）；經單因素方差分析，不同濃度半枝蓮水提液分別對4種供試菌的抑菌圈直徑均有顯著影響（P<0.05），綜合考慮選擇濃度1.00g/ml作為考察半枝蓮水提液抑菌敏感度高低的作用濃度。實驗結果表明，半枝蓮水提液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、恥垢分枝桿菌的敏感度較高，即對4種供試菌的抑菌活性較強，抑菌圈直徑大小見表1。

2.2??半枝蓮水提液對供試菌的MIC

藥物對供試菌的MIC可作為評價抑菌藥物體外抑菌活性強弱的指標，MIC值越小，表明該藥物對供試菌的抑菌活性越強；半枝蓮水提液對4種供試菌的MIC分別為：大腸埃希菌5.41mg/ml、金黃色葡萄球菌6.08mg/ml、銅綠假單胞菌6.08mg/ml、恥垢分枝桿菌5.41mg/ml，見表2。

2.3??半枝蓮水提液的抑菌穩(wěn)定性

如圖3所示，與對照組相比，隨著氯化鈉濃度的增加，半枝蓮水提液對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、恥垢分枝桿菌的抑菌圈直徑大小改變均不明顯；同時，隨著紫外光照射時間的延長，各試驗組抑菌圈直徑基本未發(fā)生較大變化（圖4），半枝蓮水提液在pH?5.0～9.0范圍內的抑菌圈直徑變化趨勢平緩（圖5）。經單因素方差分析，經不同濃度氯化鈉、紫外光照射、pH處理的半枝蓮水提液的抑菌圈直徑與對照組抑菌圈直徑大小比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），各處理組的抑菌活性保留率均>95.0%。結果表明，半枝蓮水提液在一定鹽濃度范圍內，抑菌活性保持相對穩(wěn)定；紫外光照射對半枝蓮水提液的抑菌活性影響不大；半枝蓮水提液對4種供試菌在較寬的pH范圍內均有較高的抑菌活性。

3??討論

本研究對半枝蓮水提液是否具有體外抑菌活性及對其抑菌穩(wěn)定性進行基礎考察，實驗結果表明半枝蓮水提液體外抑菌效果較好。半枝蓮水提液的抑菌活性隨濃度的增加而增強，但在其濃度>1.50g/ml時抑菌活性有下降趨勢，原因可能是藥物濃度過大，溶解度達到飽和，部分藥物未能溶解而影響藥物在瓊脂培養(yǎng)基中擴散所致。

MIC常作為藥效活性物質體外抑菌效果的評價指標，其值越小，抑菌活性越強。據不完全統(tǒng)計，部分藥用植物水提液對大腸埃希菌的MIC為：倒扣草125mg/ml、綠茶18.6mg/ml、桑葉150mg/ml、臭黃荊葉300mg/ml、葎草31.25mg/ml、酢漿草50mg/ml；對金黃色葡萄球菌的MIC為：綠茶9.4mg/ml、桑葉75mg/ml、臭黃荊葉300mg/ml、葎草3.91mg/ml、酢漿草6.25mg/ml、天門冬500mg/ml；對銅綠假單胞菌的MIC為：葎草125mg/ml、酢漿草25mg/ml、魚腥草250mg/ml，其中，天門冬水提液對大腸桿菌與銅綠假單胞菌的抑菌活性不明顯，同時，大薊水提液對恥垢分枝桿菌未表現(xiàn)出抑菌活性，其索氏提取物和超聲提取物表現(xiàn)出一定的抑菌活性，MIC均為8mg/ml[10-16]。本研究以瓊脂稀釋法探究半枝蓮水提液對大腸埃希菌、恥垢分枝桿菌的MIC為5.41mg/ml，對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的MIC為6.08mg/ml。與以上藥用植物水提液相比，半枝蓮水提液對4種供試菌有較強的抑菌活性?。

臨床用藥的安全性和有效性與藥物的穩(wěn)定性密切相關。中藥制劑在制備與儲存過程中，易受多種因素綜合作用的影響，從而引起藥效的降低或完全喪失甚至產生毒副作用[17]。本研究結果表明鹽濃度在一定范圍內對半枝蓮水提液的抑菌活性影響較小，提示半枝蓮水提液在一定鹽濃度條件下使用仍具有較強抑菌活性。從文獻中了解到，部分藥用植物水提液隨著溶劑pH的改變，其抑菌活性會發(fā)生變化，而半枝蓮水提液在pH5～9范圍內均能表現(xiàn)出良好的抑菌活性，提示半枝蓮水提液中可能含有較為豐富的抑菌活性物質，能在不同的pH環(huán)境下發(fā)揮抑菌作用[12，18]。紫外光照射對半枝蓮水提液的抑菌活性無影響，提示紫外光照射可能未對半枝蓮水提液中的抑菌活性物質造成破壞。

[參考文獻][1] 李娜，?王平，?孫鐵鋒，?等.?半枝蓮化學成分、藥理作用及質量控制研究進展[J].?中國藥用植物雜志，?2020，?45（21）：?5117–5128.