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    宏基因測序檢出耶氏肺孢子菌的非HIV患者的臨床分析

    2023-08-11 06:01:06徐如意曾麗云陳輝鄭琳於學(xué)嬋虞亦鳴莊起東陳眾博鄧在春
    中國現(xiàn)代醫(yī)生 2023年21期

    徐如意 曾麗云 陳輝 鄭琳 於學(xué)嬋 虞亦鳴 莊起東 陳眾博 鄧在春

    [摘要]?目的?總結(jié)并分析支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar?lavage?fluid,BALF)宏基因組二代測序(metagenomic?next-generation?sequencing,mNGS)檢出低序列耶氏肺孢子菌(Pneumocystis?jirovecii,PJ)的非HIV患者的危險因素、臨床特點、治療及預(yù)后。方法?回顧性分析2018年5月至2022年6月在寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院因不明原因肺炎行氣管鏡檢查且BALF-mNGS檢出PJ的13例非HIV患者的臨床資料。結(jié)果?13例患者中,危險因素以使用糖皮質(zhì)激素最為常見,最常見的癥狀是咳嗽、咳痰,12例患者有血感染指標(biāo)異常,影像學(xué)特點以兩肺彌漫性病變、多發(fā)磨玻璃影為主。12例患者接受抗PJ治療,其中11例患者在治療期間病情好轉(zhuǎn),1例因重癥感染治療無效死亡;1例患者未接受抗PJ治療,在經(jīng)驗性抗感染治療后好轉(zhuǎn)。結(jié)論?經(jīng)BALF-mNGS檢出PJ的非HIV患者臨床特點不典型,結(jié)合mNGS結(jié)果與宿主因素綜合判斷,有助于早診、早治,改善患者的預(yù)后。

    [關(guān)鍵詞]?非HIV患者;肺孢子菌肺炎;宏基因組二代測序;低序列

    [中圖分類號]?R519??????[文獻標(biāo)識碼]?A??????[DOI]?10.3969/j.issn.1673-9701.2023.21.003

    Clinical?analysis?of?non-HIV?patients?with?Pneumocystis?jirovecii?detected?by?metagenomic?sequencing

    XU?Ruyi1,?ZENG?Liyun2,?CHEN?Hui1,?ZHENG?Lin3,?YU?Xuechan1,?YU?Yiming1,?ZHUANG?Qidong1,?CHEN?Zhongbo1,?DENG?Zaichun1

    1.Department?of?Respiratory?and?Critical?Care?Medicine,?the?First?Affiliated?Hospital?of?Ningbo?University,?Key?Laboratory?of?Respiratory?Disease?of?Ningbo,?Ningbo?315010,?Zhejiang,?China;?2.Department?of?Technology,?Hangzhou?Matridx?Biotechnology?Co.,?Ltd,?Hangzhou?310030,?Zhejiang,?China;?3.Microbiology?Department,?the?First?Affiliated?Hospital?of?Ningbo?University,?Ningbo?315010,?Zhejiang,?China

    [Abstract]?Objective?To?summarize?and?analyze?the?risk?factors,?clinical?characteristics,?treatment,?and?prognosis?of?non-HIV?patients?with?low-sequence?Pneumocystis?jirovecii?(PJ)?detected?by?metagenomic?next-generation?sequencing?(mNGS)?of?bronchoalveolar?lavage?fluid?(BALF).?Methods?The?clinical?data?of?13?non-HIV?patients?with?PJ?detected?by?BALF-mNGS?who?underwent?bronchoscopy?due?to?unexplained?pneumonia?in?the?First?Affiliated?Hospital?of?Ningbo?University?from?May?2018?to?June?2022?were?retrospectively?analyzed.?Results?Among?the?13?patients,?the?use?of?glucocorticoids?was?the?most?common?risk?factor,?the?most?common?symptom?was?cough?and?expectoration,?12?patients?had?abnormal?blood?infection?indicators,?and?the?main?imaging?features?were?diffuse?lesions?in?both?lungs?and?multiple?ground?glass?shadows.?12?patients?received?anti-PJ?treatment,?of?which?11?patients?were?improved?during?treatment,?and?one?patient?died?due?to?ineffective?treatment?of?severe?infection.?One?patient?did?not?receive?anti-PJ?therapy?and?improved?after?empirical?anti-infective?therapy.?Conclusion?The?clinical?characteristics?of?non-HIV?patients?with?PJ?detected?by?BALF-mNGS?are?not?typical.?The?combination?of?mNGS?results?and?host?factors?is?helpful?for?early?diagnosis,?treatment?and?improving?the?prognosis?of?patients.

    [Key?words]?Non-HIV?patients;?Pneumocystis?pneumonia;?Metagenomic?next-generation?sequencing;?Low?sequence

    耶氏肺孢子菌肺炎(Pneumocystis?jirovecii?pneumonia,PJP)是一種致命的機會性真菌感染,近年來,PJP在非HIV感染者中的發(fā)病率有所升高[1-2]。在非HIV感染者中,PJP的死亡率也在增加,HIV陰性的PJP患者的死亡率為25%~50%[3-6]。以往研究表明,在感染耶氏肺孢子菌(Pneumocystis?jirovecii,PJ)的患者中,與HIV陽性患者相比,HIV陰性患者的癥狀不典型,疾病進展更快,并發(fā)感染的風(fēng)險更高,預(yù)后更差,且死亡率更高[7]。這就要求臨床上對PJ應(yīng)早檢出、早治療。作為一種檢測手段,宏基因組二代測序(metagenomic?next-generation?sequencing,mNGS)無須事先根據(jù)臨床表現(xiàn)來預(yù)測可能的病原體,其診斷肺部真菌感染性疾病的敏感性和特異性優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)方法[8-9]。本研究對13例由mNGS檢出PJ陽性的非HIV患者的臨床資料進行回顧性分析和總結(jié),現(xiàn)報道如下。

    1??資料與方法

    1.1??資料

    回顧性分析2018年5月至2022年6月于寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院治療的13例經(jīng)支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar?lavage?fluid,BALF)-mNGS檢出PJ陽性的非HIV患者。從住院患者信息中提取每位病例的基本信息、危險因素、臨床特征、實驗室檢查結(jié)果和胸部CT表現(xiàn),并收集患者的治療方案及隨訪治療效果。本研究經(jīng)寧波大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批號:倫審2023研第082RS號),所有研究對象均被充分告知檢查內(nèi)容及相關(guān)風(fēng)險。

    1.2??支氣管肺泡灌洗液收集

    患者在全身麻醉下,由專業(yè)醫(yī)生進行支氣管鏡檢查,支氣管肺泡灌洗3次(每次20ml)。根據(jù)胸部CT顯示的病灶位置確定灌洗區(qū)域。若雙肺有彌漫性病變,則在右肺中葉進行灌洗,并立即密封兩管3ml?BALF,送至杭州杰毅生物技術(shù)有限公司用于mNGS檢測[10-11]。

    1.3??mNGS的操作步驟

    取1.2ml磷酸緩沖鹽溶液加入標(biāo)本管,置于渦旋震蕩儀震蕩混勻10min。吸取1.2ml標(biāo)本管中液體于2ml震蕩管中。將震蕩管置于生物樣本勻質(zhì)儀中,勻質(zhì)9min,利用高效三維高速碰撞破碎細胞,對樣品進行研磨、裂解、均質(zhì)。取出震蕩管放入離心機中,以12?000轉(zhuǎn)/min離心3min,吸取上清液400μl至小體積基因組核酸提取或純化試劑盒中,放入NGS?master全自動建庫儀進行核酸提取及文庫構(gòu)建。使用DNA降解和環(huán)化將雙鏈DNA文庫轉(zhuǎn)化為單鏈環(huán)狀DNA。最后在Illumina測序平臺進行高通量測序[12-13]。

    2??結(jié)果

    2.1??患者的基本特征及患PJP的危險因素

    共13例非HIV患者通過BALF-mNGS檢測到PJ,男11例,女2例,年齡53~82歲;其中9例患者有兩種或以上基礎(chǔ)疾病,8例有全身糖皮質(zhì)激素使用史,5例有糖尿病,4例有實體器官惡性腫瘤病史,3例有血液系統(tǒng)惡性腫瘤,2例有肝硬化病史,1例有腎臟疾病,1例無感染PJ的危險因素,見表1。

    2.2??臨床癥狀

    在患病過程中,11例有咳嗽癥狀,8例出現(xiàn)勞力性呼吸困難,6例出現(xiàn)發(fā)熱,4例出現(xiàn)乏力,1例有胸痛表現(xiàn),見表2。

    2.3??實驗室檢查及影像學(xué)特點

    在患病過程中,4例患者出現(xiàn)白細胞計數(shù)升高,12例患者出現(xiàn)C反應(yīng)蛋白升高,11例患者出現(xiàn)淋巴細胞計數(shù)下降,8例患者的乳酸脫氫酶水平升高。胸部CT提示多發(fā)磨玻璃影8例,滲出影4例,實變3例,胸腔積液2例。mNGS檢出的PJ序列數(shù)從1至962不等,3例患者僅檢出PJ,10例患者同時檢出其他病原體,見表3。

    2.4??治療及效果

    入院后,因呼吸道癥狀及肺部炎癥,所有患者均接受經(jīng)驗性抗生素治療。在BALF-mNGS檢出PJ后,12例患者在原抗感染治療方案基礎(chǔ)上加用磺胺甲唑–甲氧芐啶(sulfamethoxazole-trimethoprim,SMZ-TMP)治療,1例患者未接受針對PJ的治療??筆J治療后,11例患者癥狀好轉(zhuǎn),其中8例患者在復(fù)查胸部CT時觀察到病灶吸收(典型胸部CT表現(xiàn)見圖1);1例患者基礎(chǔ)狀態(tài)差,有肺惡性腫瘤、2型糖尿病、腦梗死病史,因“咳嗽咳痰伴氣促1周,加重1d”入院,雖在抗PJ治療后患者癥狀曾一度好轉(zhuǎn),但后續(xù)因嚴(yán)重感染,經(jīng)多種抗生素治療后癥狀仍進一步惡化,出現(xiàn)呼吸衰竭、急性左心衰、肝功能異常等表現(xiàn),住院期間因嚴(yán)重感染及多器官損傷經(jīng)治療無效后死亡。1例未接受抗PJ治療的患者在莫西沙星治療后癥狀明顯好轉(zhuǎn),見表4。

    3??討論

    PJP是一種致命的機會性肺部感染性疾病,在非HIV患者中,PJ常定植于肺部,當(dāng)基礎(chǔ)疾病加重或全身情況惡化時,PJ可由定植轉(zhuǎn)為侵襲性感染,繼而出現(xiàn)肺部病灶擴大及發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難等非特異性表現(xiàn)[1,5,14]。與HIV患者相比,非HIV患者感染PJ后癥狀更嚴(yán)重,疾病進展更快,呼吸衰竭比例更高,這使得非HIV患者感染PJ后面臨更高的死亡風(fēng)險[7]。

    六胺銀(gomori?methenamine?silver,GMS)染色檢出PJ的特異性很高,有研究證明特異性達到100%,但敏感度低導(dǎo)致GMS染色在診斷PJP時非常容易漏診[15-16]。目前,BALF-mNGS技術(shù)廣泛用于PJ的檢測,在診斷肺部感染性疾病時,敏感度高是mNGS的一個重要優(yōu)勢。研究顯示,BALF-mNGS的敏感度、特異性均顯著高于血清(1,3)-β-D-葡聚糖試驗[17-18]。Jiang[19]等發(fā)現(xiàn)BALF-mNGS診斷PJP的敏感度明顯高于GMS染色。

    有研究表明,PJP患者易出現(xiàn)其他致病菌的合并感染,如巨細胞病毒、EB病毒、單純皰疹病毒1型、念珠菌及細環(huán)病毒[17,?19]。在本研究的13例患者中,有10例患者mNGS檢出其他病原體的序列,以巨細胞病毒、EB病毒、單純皰疹病毒1型為主,這與之前的研究結(jié)果一致。由于PJP患者常有其他病原體的混合感染,mNGS因其診斷混合感染的優(yōu)勢,相比其他微生物學(xué)檢查更適用于PJP的診斷。

    過去,臨床上主要根據(jù)mNGS檢出病原菌的序列數(shù)判斷是否需要治療,但序列數(shù)并不能完全真實反映患者體內(nèi)病原微生物的含量;在mNGS技術(shù)中,微生物讀數(shù)會隨著樣本中宿主細胞濃度的增加而降低[20]。mNGS檢出的PJ序列數(shù)變化很大(2~1?665?693)[21-24]。在本文回顧性研究的13例BALF-mNGS檢出PJ的非HIV患者中,同樣也觀察到低序列數(shù)的PJ,最小序列數(shù)為1。由于PJ在自然界廣泛存在并可能在呼吸道定植,故mNGS檢出PJ并不等同于感染,但目前仍沒有準(zhǔn)確的閾值來判斷BALF-mNGS檢出的PJ是定植還是侵襲性感染[17]。對這些低序列數(shù)患者是否需要抗PJ治療?首先,雖然PJ可定植于肺部,但臨床上在免疫功能正?;蚣韧鶝]有肺部疾病的患者中很少見到PJ感染。本研究納入的患者中,免疫抑制狀態(tài)及肺部基礎(chǔ)疾病十分常見,這一特點與之前報道的PJ感染病例大致相同[1,?4,?25-27]。一項關(guān)于mNGS診斷疑似感染病灶的研究數(shù)據(jù)顯示,對免疫正?;颊叩臉颖具M行mNGS檢測時,很少報告PJ陽性[24]。其次,雖然定植在肺部的PJ有時不直接產(chǎn)生癥狀,但仍可參與激活炎癥反應(yīng),造成肺部損傷,甚至導(dǎo)致其他肺部疾病的惡化[28]。最后,對免疫功能低下的非HIV患者,PJ定植轉(zhuǎn)為侵襲感染時,疾病進展快,預(yù)后差[3,?7]。所以筆者認為對有肺部基礎(chǔ)疾病或免疫損傷危險因素的非HIV患者,即使檢出的PJ序列數(shù)低,預(yù)防性抗PJ治療也非常重要。

    綜上所述,BALF-mNGS檢出PJ陽性的非HIV患者臨床特點不典型,mNGS可幫助檢出PJ,并有助于發(fā)現(xiàn)混合感染的病原體。對mNGS檢出PJ陽性的低序列患者,若有肺部基礎(chǔ)疾病或免疫功能受損等危險因素,應(yīng)盡早開始抗PJ治療,以期改善患者的預(yù)后。

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