NGF/TrkA信號(hào)通路在膀胱功能障礙疾病中表達(dá)的研究進(jìn)展

龐磊，邊曉東，雙衛(wèi)兵,

（1.山西省人民醫(yī)院 泌尿外科，山西 太原 030012；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030012；3.山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，山西 太原 030012）

1 NGF/TrkA 通路的組成

NGF 是一種可溶性肽，是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白家族的創(chuàng)始成員，NGF 的成熟形式是一種同源二聚體，其中每個(gè)亞基由118 個(gè)氨基酸組成［1］。NGF 二聚體與兩類(lèi)不同的受體結(jié)合：高親和力原肌球蛋白受體激酶A（TrkA）和低親和力的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子p75 受體［2］。前者是具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的經(jīng)典生長(zhǎng)因子受體，而后者屬于TNFa 相關(guān)的死亡域受體。根據(jù)它們的相應(yīng)結(jié)構(gòu)，有研究顯示TrkA 與磷脂酶C（PLC），絲裂原活化蛋白（MAP）激酶偶聯(lián)，和磷酰胺基肌醇-3（PI3）激酶途徑并介導(dǎo)NGF 和存活促進(jìn)反應(yīng)，而p75 促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3］。然而，有研究表明了一個(gè)更復(fù)雜的情況，NGF 與p75 的結(jié)合增強(qiáng)了NGF-TrkA 的親和力并刺激了TrkA 誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，而后形成信號(hào)復(fù)合物，隨后內(nèi)化并逆行從外圍運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核［4］，此過(guò)程組成了NGF/TrkA 信號(hào)通路。

2 NGF 系統(tǒng)在正常膀胱中廣泛表達(dá)

Skaper 的研究表明，NGF 及其受體在膀胱中mRNA 和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 測(cè)定，在大鼠和人類(lèi)的膀胱組織中檢測(cè)到NGF mRNA［5］。通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和免疫印跡，NGF 蛋白在大鼠的膀胱組織中以及人類(lèi)淺表膀胱活檢中被發(fā)現(xiàn)［6］。最初，NGF/TrkA信號(hào)通路表達(dá)在大鼠膀胱平滑肌中，也可以在嚙齒動(dòng)物的背根神經(jīng)節(jié)（DRG）和盆腔神經(jīng)節(jié)（MPG）中檢測(cè)到，但是，膀胱尿路上皮卻是NGF/TrkA 表達(dá)的突出部位［7］。在正常大鼠中，尿路上皮中有豐富的NGF/TrkA 表達(dá)，逼尿肌中的NGF/TrkA 表達(dá)信號(hào)則較弱，只可見(jiàn)在黏膜下區(qū)域出現(xiàn)散發(fā)染色［8］。在人體膀胱組織中，間質(zhì)性膀胱炎患者的尿路上皮NGF/TrkA 信號(hào)通路表達(dá)增加，NGF 受體在膀胱中的表達(dá)主要局限于神經(jīng)纖維，大多數(shù)NGF 反應(yīng)細(xì)胞同時(shí)表達(dá)TrkA 和p75受體，NGF 激活的結(jié)果取決于這兩個(gè)受體之間的相互作用［9］。TrkA 表達(dá)的免疫組化證據(jù)出現(xiàn)在L4-5 及L6-S1 DRG 的傳入神經(jīng)元中表達(dá)［10］。在對(duì)照大鼠膀胱中，TrkA 表達(dá)主要在尿路上皮和固有層中觀察到，偶爾有尿路上皮下神經(jīng)纖維陽(yáng)性，而在膀胱平滑肌細(xì)胞（BSMC）中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)表達(dá)［11］。在雌性小鼠中，TrkA 免疫反應(yīng)性也僅限于黏膜。p75mRNA 也表達(dá)于大鼠膀胱，其中受體免疫反應(yīng)性局限于尿路上皮、神經(jīng)纖維位于尿路上神經(jīng)叢、血管系統(tǒng)神經(jīng)纖維和逼尿肌中的神經(jīng)纖維［12］。在生理?xiàng)l件下，尿路上皮是嚙齒動(dòng)物和人類(lèi)膀胱中NGF 及其受體表達(dá)豐富的部位。此外，膀胱平滑肌表達(dá)NGF，傳入和傳出神經(jīng)纖維都顯示NGF 受體。

3 NGF/TrkA 信號(hào)通路形成機(jī)制及在膀胱發(fā)育中的作用

在膀胱當(dāng)中，與炎癥相關(guān)的多種病理表現(xiàn)可調(diào)節(jié)體內(nèi)NGF/TrkA 信號(hào)通路水平，與其他非神經(jīng)元細(xì)胞類(lèi)型相比，炎癥細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）或白細(xì)胞介素-1b 對(duì)大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞的NGF 釋放只有輕微的影響［13］。對(duì)于b-腎上腺素能激動(dòng)劑異丙腎上腺素，可以抑制和刺激大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞對(duì)NGF/TrkA 信號(hào)通路的釋放［14］。而且這個(gè)過(guò)程可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)的鈣離子升高。關(guān)于控制NGF/TrkA 信號(hào)通路的表達(dá)機(jī)制，研究尿路上皮表達(dá)的調(diào)控可能非常重要，尿路上皮是膀胱中NGF 表達(dá)豐富的細(xì)胞類(lèi)型［15］。另外，NGF/TrkA 參與膀胱神經(jīng)支配的發(fā)生和發(fā)展。事實(shí)上，許多研究已經(jīng)證實(shí)了NGF/TrkA 信號(hào)通路在膀胱支配DRG 神經(jīng)元的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的促生存和促分化的誘導(dǎo)作用［16］。在大鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中，膀胱中的NGF/TrkA 水平持續(xù)增加，在出生前達(dá)到峰值。在一些物種中，排尿反射在早期發(fā)育中經(jīng)歷了實(shí)質(zhì)性的重塑［17］。從最初對(duì)脊柱排尿反射的依賴(lài)逐漸轉(zhuǎn)化成成年動(dòng)物排尿的脊柱反射通路［18］。LIU［19］的研究表明，NGF 可能參與調(diào)節(jié)這種產(chǎn)后排尿通路的重塑，因?yàn)樾∈蟪錾驨GF mRNA 和蛋白質(zhì)水平在大鼠的2～3 周齡達(dá)到峰值，這與棘球脊髓反射的出現(xiàn)一致。

4 NGF/TrkA 信號(hào)通路在膀胱功能障礙中的作用

在成人中，NGF/TrkA 信號(hào)通路對(duì)膀胱和脊髓排尿通路沿線(xiàn)神經(jīng)元的影響似乎遠(yuǎn)比神經(jīng)支配、神經(jīng)密度增加和神經(jīng)元萌芽要復(fù)雜得多。NGF/TrkA 信號(hào)通路不斷調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能表型，從而來(lái)響應(yīng)生理刺激和有害刺激，這一過(guò)程稱(chēng)為神經(jīng)元重塑。對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元的體外研究表明，NGF/TrkA信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放，誘導(dǎo)突觸重組，通過(guò)降低激活閾值增加神經(jīng)元興奮性，并使傷害感受神經(jīng)元對(duì)有害刺激（超敏反應(yīng)）敏感［20］。雖然NGF 誘導(dǎo)的膀胱中感覺(jué)傳入物的超興奮性和致敏的分子機(jī)制目前還沒(méi)有得到很好的驗(yàn)證，但它們可能包括疼痛相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)（如物質(zhì)P 和CGRP）的TrkA 依賴(lài)性基因表達(dá)上調(diào)卻被多次證明，例如TRPV1 通道的磷酸化增加可能在NGF/TrkA 信號(hào)通路調(diào)用的感覺(jué)神經(jīng)元致敏中起作用［21］。所有這些機(jī)制都可能參與眾多病理性疼痛感的增加，使NGF/TrkA 信號(hào)通路成為內(nèi)臟和炎癥性疼痛的關(guān)鍵通路［22］。在膀胱中，NGF/TrkA 信號(hào)通路介導(dǎo)的沿著排尿途徑的細(xì)胞變化可以轉(zhuǎn)化為膀胱過(guò)度收縮，甚至導(dǎo)致膀胱區(qū)疼痛［23］。CHUANG 等［24］的數(shù)據(jù)表明，在膀胱中存在的NGF/TrkA 信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致膀胱功能的變化，包括膀胱反射亢進(jìn)及膀胱區(qū)疼痛。LIANG 等［25］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些影響類(lèi)似于與膀胱過(guò)度活動(dòng)和炎癥性疼痛相關(guān)的病理，如膀胱過(guò)度活動(dòng)綜合征（OAB）和間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征。TYAGI等［26］學(xué)者提出，大多數(shù)有害過(guò)程都是由TrkA 介導(dǎo)的，外周的NGF/TrkA 信號(hào)通路亦可能引起中樞排尿通路的變化。這些小鼠由于尿路上皮細(xì)胞中明顯的神經(jīng)纖維擴(kuò)張而表現(xiàn)出膀胱容量增大。這種組織學(xué)表型與膀胱功能的明顯變化是與牽涉性軀體盆超敏反應(yīng)增加有關(guān)的。此外，在NGF 轉(zhuǎn)基因小鼠的尿路上皮下觀察到過(guò)多的肥大細(xì)胞表達(dá)［27］。SCHNEGELSBERG 等［28］描述了NGF/TrkA信號(hào)通路對(duì)肥大細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)作用，并可能參與炎癥性疼痛的介導(dǎo)。這些發(fā)現(xiàn)暗示了NGF 誘導(dǎo)的膀胱變化可能涉及神經(jīng)元以外的細(xì)胞類(lèi)型。MICHEL等學(xué)者表明，NGF 被建議作為人類(lèi)原發(fā)性尿路上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)因子，通過(guò)TrkA 起作用［29］。另一方面，在沒(méi)有配體的情況下，p75 的過(guò)度表達(dá)會(huì)減弱膀胱上皮細(xì)胞的增殖，這種效應(yīng)被NGF 抵消［30］。雖然NGF 可能控制尿路上皮增殖，但尚不清楚它是否也調(diào)節(jié)尿路上皮功能性表型。QIAO 等［31］的研究結(jié)果表明，NGF/TrkA 信號(hào)通路過(guò)表達(dá)上調(diào)尿路上皮和膀胱平滑肌細(xì)胞中的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和VEGF 受體，提示NGF/TrkA 信號(hào)通路參與介導(dǎo)膀胱血管生成和炎癥。

5 膀胱功能障礙中的NGF 表達(dá)

考慮到NGF 在控制膀胱感覺(jué)功能和通過(guò)外源性NGF 給藥誘導(dǎo)膀胱功能障礙方面的關(guān)鍵作用，發(fā)現(xiàn)NGF 對(duì)膀胱病變的貢獻(xiàn)是巨大的。實(shí)際上，在測(cè)試NGF 對(duì)膀胱的影響之前，人類(lèi)和大鼠膀胱出口梗阻（BOO）中已經(jīng)報(bào)道了NGF 水平的變化［32］。從那時(shí)起，NGF 的產(chǎn)生在動(dòng)物模型和各種疾病，如間質(zhì)性膀胱炎、慢性盆腔疼痛及OAB 患者中反復(fù)表達(dá)。KLINGER 等［33］研究人員提出，尿NGF 水平可以作為區(qū)分膀胱功能障礙病因的診斷生物標(biāo)志物。此外，有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，對(duì)NGF系統(tǒng)的干預(yù)改善了多種類(lèi)型的膀胱過(guò)度活動(dòng)，使NGF 成為治療人類(lèi)膀胱功能障礙的重要目標(biāo)［34］。

6 NGF/TrkA 信號(hào)通路與膀胱過(guò)度活動(dòng)征

膀胱過(guò)度活動(dòng)癥主要以尿急為主，且伴有逼尿肌過(guò)度活動(dòng)（DO），伴或不伴尿失禁、尿頻和夜尿癥，這說(shuō)明膀胱過(guò)度活動(dòng)癥的感覺(jué)性膀胱通路存在缺陷［35］。OAB 癥狀存在多種原因。包括BOO，最常見(jiàn)的原因是良性前列腺增生（BPH），糖尿病導(dǎo)致的膀胱疾病，神經(jīng)源性DO（通常由于脊髓損傷）和特發(fā)性DO［36］。CHARRUA 等［37］指出，NGF/TrkA 信號(hào)通路很可能參與OAB 的發(fā)病機(jī)制。RANA 等［38］提出，NGF/TrkA 信號(hào)通路是BOO 相關(guān)排尿功能障礙的關(guān)鍵通路，它影響感覺(jué)傳入/交感神經(jīng)傳出物的生長(zhǎng)和表型，與肥厚膀胱中的膀胱平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)相協(xié)調(diào)。有趣的是，NGF/TrkA 信號(hào)通路的表達(dá)量可能是由鈣通道拮抗劑來(lái)調(diào)節(jié)。在顯示不穩(wěn)定排尿模式的大鼠中，膀胱NGF 表達(dá)的升高持續(xù)存在，包括較短的排尿收縮間隔和非排尿收縮［39］。YOSHIMURA 等［40］提出，NGF/TrkA 信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)由脊髓損傷（SCI）誘導(dǎo)的脊髓排尿通路的重塑。在大鼠中，SCI 導(dǎo)致NGF mRNA 急性升高，但在SCI 初期，膀胱組織中的NGF 蛋白含量降低，而在數(shù)周之內(nèi)mRNA 和蛋白均升高。在慢性SCI 中的L6-S1-膀胱傳入DRG 及MPG 中，TrkA 表達(dá)和磷酸化似乎增強(qiáng)［41］。小鼠研究暗示了NGF/TrkA 在SCI 誘導(dǎo)的排尿通路重塑性的因果關(guān)系：在SCI 減少不受抑制的膀胱收縮及最大排尿壓力和逼尿肌-括約肌協(xié)同失調(diào)后，鞘內(nèi)連續(xù)遞送NGF 單克隆抗體2 周，不影響膀胱收縮間隔、基線(xiàn)膀胱內(nèi)壓力、排尿壓力閾值及膀胱容量［42］。這與脊髓和DRG 中的NGF/TrkA 水平降低有關(guān)，而與膀胱中的NGF/TrkA 水平無(wú)關(guān)［43］。除SCI 外，外周膀胱去神經(jīng)支配也會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)源性膀胱過(guò)度活動(dòng)，根據(jù)一個(gè)經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證的概念，靶標(biāo)去神經(jīng)支配可能導(dǎo)致神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的過(guò)度產(chǎn)生［44］。因此，單側(cè)神經(jīng)節(jié)切除術(shù)（膀胱去神經(jīng)支配）或節(jié)后膀胱神經(jīng)元與成年大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)分離（膀胱和神經(jīng)節(jié)分離）導(dǎo)致膀胱NGF 水平增加10 倍之多，這與供應(yīng)膀胱和膀胱平滑肌細(xì)胞肥大的盆腔神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元肥大相關(guān)［45］。NGF 蛋白和mRNA 水平在受神經(jīng)結(jié)扎后影響體細(xì)胞和內(nèi)臟膀胱感覺(jué)通路的雌性大鼠的膀胱組織中也升高［46］。這種情況與漏點(diǎn)壓力的降低、排尿頻率增加以及排尿量的減少有關(guān)。更有研究表示，在神經(jīng)源性DO 患者中，膀胱NGF/TrkA 信號(hào)通路蛋白水平通過(guò)3 個(gè)月的膀胱內(nèi)A 型肉毒桿菌毒素治療得到改善，同時(shí)尿失禁發(fā)作次數(shù)減少以及尿動(dòng)力學(xué)參數(shù)有所改善，包括最大逼尿肌壓力和最大膀胱容量等［47］。

7 NGF/TrkA 信號(hào)和間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征

NGF 可由各種炎癥細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞和肥大細(xì)胞）合成，并可能作為將超敏反應(yīng)和疼痛反應(yīng)與各種炎癥狀態(tài)（包括氣道，過(guò)敏或神經(jīng)源性炎癥）聯(lián)系起來(lái)的重要因素［48］。在人類(lèi)膀胱組織中，間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征（IC/PBS）表現(xiàn)為尿急、尿頻、夜尿癥以及重度恥骨上以及盆腔疼痛［49］。這歸因于膀胱的感覺(jué)超敏反應(yīng)，臨床上表現(xiàn)為少量尿液即產(chǎn)生嚴(yán)重的疼痛或排尿急迫感，從而導(dǎo)致尿急尿頻，但這種情況的原因尚未明確［50］。有研究顯示，大鼠的膀胱炎癥與NGF/TrkA信號(hào)通路產(chǎn)生增加有關(guān)，但是與炎癥刺激的類(lèi)型無(wú)關(guān)［51］。所有形式的炎癥由于NGF 活性過(guò)高也伴隨著感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)膀胱神經(jīng)元的形態(tài)變化［52］。在大腸桿菌LPS 滴注小鼠中觀察到NGF 免疫染色和蛋白水平存在短暫的增加以及NGF mRNA 的表達(dá)穩(wěn)步升高。而且發(fā)現(xiàn)，在膀胱內(nèi)滴注LPS 后，NGF是mRNA 微陣列中最早的上調(diào)基因之一［53］。到目前為止，最廣泛使用的間質(zhì)性膀胱炎模型是通過(guò)腹腔注射大劑量環(huán)磷酰胺（CYP）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這是因?yàn)镃YP 代謝物丙烯醛濃縮之后在膀胱中形成，產(chǎn)生膀胱組織刺激、單核細(xì)胞浸潤(rùn)、DO 以及膀胱重量增加等情況，并在CYP 注射后4 h 后產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏［54］。CYP 間質(zhì)性膀胱炎大鼠的膀胱組織、DRG 組織及MPG 組織中，可見(jiàn)NGF/TrkA 信號(hào)通路表達(dá)增加［55］。SIMONETTI 等［56］的研究證實(shí)，隨著DRG 神經(jīng)元中的NGF/TrkA 信號(hào)通路的增加，整個(gè)膀胱組織中的NGF 蛋白表達(dá)降低，而有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CYP 注射大鼠的膀胱黏膜和逼尿肌中的NGF免疫反應(yīng)性增加。炎癥刺激在NGF/TrkA 信號(hào)通路中的作用也因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)血管活性腸肽（VIP）敲除小鼠的CYP 間質(zhì)性膀胱炎的膀胱組織中NGF 的升高而提出，因?yàn)閂IP 暗示在膀胱中具有抗炎特性［57］。LEE 等［58］及其團(tuán)隊(duì)的實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（MIF）的全身抑制阻止了CYP大鼠膀胱中的排尿變化以及NGF 蛋白的升高。隨著NGF 在膀胱組織中的表達(dá)，CYP 間質(zhì)性膀胱炎報(bào)道了神經(jīng)中兩種NGF 受體的空間表達(dá)的上調(diào)和變化［59］。在CYP 注射之后，TrkA 似乎在DRG、MPG 及BSMC 中都有上調(diào)。與實(shí)驗(yàn)性間質(zhì)性膀胱炎模型類(lèi)似，在IC/PBS 患者中也報(bào)告了NGF/TrkA信號(hào)通路系統(tǒng)的改變。膀胱功能障礙（包括膀胱過(guò)度活動(dòng)癥、慢性膀胱炎或IC/PBS）的女性對(duì)膀胱NGF 的免疫反應(yīng)性大于對(duì)照組癥狀［60］。GIANNANTONI 等［61］得出結(jié)論，IC/PBS 患者被發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)出更強(qiáng)的膀胱NGF 免疫染色和升高的mRNA 水平，這可以通過(guò)用膀胱內(nèi)肉毒桿菌A 毒素注射來(lái)減輕疼痛。

8 慢性盆腔疼痛綜合征中的NGF/TrkA 信號(hào)通路和內(nèi)臟反射誘導(dǎo)的膀胱功能障礙

膀胱功能障礙通常是IC/PBS 以外的慢性盆腔疼痛綜合征的一部分。這些綜合征涉及過(guò)度炎癥或者是涉及多個(gè)盆腔器官的功能障礙［62］。FALL等［63］的研究表明，對(duì)一個(gè)盆腔器官的持續(xù)刺激和傳入刺激可能導(dǎo)致另一個(gè)盆腔器官的神經(jīng)源性刺激和交叉致敏，具有交叉輸入的特點(diǎn)，例如膀胱。在實(shí)驗(yàn)設(shè)置中，直腸滴注三硝基苯磺酸引起的結(jié)腸刺激使排尿量減少，排尿頻率增加，這與膀胱肥大細(xì)胞大量涌入和NGF mRNA 水平升高有關(guān)。又例如，前列腺內(nèi)注射福爾馬林會(huì)導(dǎo)致膀胱反射亢進(jìn)、水腫以及膀胱和L6/S1 脊髓中NGF 蛋白和mRNA 的增加。這兩項(xiàng)研究都表明，NGF/TrkA 信號(hào)通路可能是神經(jīng)源性?xún)?nèi)臟-內(nèi)臟反射途徑的介質(zhì)之一，誘導(dǎo)其他盆腔器官刺激后膀胱交叉致敏。

9 結(jié)論

縱觀以上的基礎(chǔ)和臨床研究，發(fā)現(xiàn)膀胱中的NGF/TrkA 信號(hào)通路不僅僅是控制發(fā)育，生長(zhǎng)和損傷期間器官神經(jīng)支配的經(jīng)典生長(zhǎng)因子，而且在患病狀態(tài)下可以調(diào)節(jié)排尿反射和疼痛感，至少在嚙齒動(dòng)物中，其活性似乎是排尿反射正常功能所必需的。在不久的將來(lái)，使用新的實(shí)驗(yàn)方式，如尿路上皮特異性NGF 轉(zhuǎn)基因小鼠或更特異性的低分子量NGF 受體調(diào)節(jié)劑，來(lái)解決更多的科學(xué)問(wèn)題，包括TrkA/p75 之間的相互作用，排尿通路中的外周與中樞NGF/TrkA 信號(hào)通路的效應(yīng)，或NGF 與其他神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的相互作用，都可以更好地解決。