MMP15、PICK1基因在山羊睪丸中的表達研究

汪艷妃 張艷 惠茂茂 陳祥

摘要：MMP15、PICK1基因均是哺乳動物性腺組織中影響性腺生理功能正常發(fā)揮的重要影響因子，但它們在黔北麻羊睪丸組織中的表達規(guī)律尚不明晰。為研究黔北麻羊不同月齡的睪丸中MMP15、PICK1基因的表達情況，本試驗以黔北麻羊為研究對象，通過qRT-PCR技術(shù)分別檢測MMP15與PICK1基因在1、3、6、9、12月齡的黔北麻羊睪丸中的表達水平并建立基因表達的標準曲線。結(jié)果顯示：MMP15、PICK1基因在黔北麻羊不同月齡睪丸組織中均有表達；MMP15基因在黔北麻羊不同月齡睪丸中的表達量從高到低排列為：12月齡＞1月齡＞9月齡＞3月齡＞6月齡；12月齡與1月齡的表達差異不顯著（P>0.05），二者表達量均極顯著高于3月齡、6月齡、9月齡（P<0.01）；9月齡表達顯著高于3月齡（P<0.05），極顯著高于6月齡（P<0.01）；3月齡表達極顯著高于6月齡（P<0.01）。PICK1基因在黔北麻羊不同月齡睪丸中的表達量從高到低排列分別是：3月齡＞6月齡＞12月齡＞9月齡＞1月齡；3、6月齡其表達量極顯著高于9、12月齡（P<0.01）；1月齡與其他幾個月齡相比，其表達量均極顯著低于其他月齡（P<0.01）。結(jié)合黔北麻羊的生理機能發(fā)育情況，黔北麻羊在6月齡時已經(jīng)基本達到性成熟，所以此時睪丸內(nèi)細胞活動增強，睪丸機能活躍。本次試驗結(jié)果表明，黔北麻羊睪丸生精功能的正常發(fā)揮或與MMP15及PICK1基因的表達量有關(guān)。

關(guān)鍵詞：黔北麻羊；MMP15；PICK1；相對表達量；睪丸

中圖分類號：S827

文獻標識碼：A

文章編號：1008－0457（2023）04－0018－08

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2023.04.003

黔北麻羊（Caprahircus）是極具有貴州本土特色的地方山羊品種，具有肉質(zhì)細嫩味美、耐粗飼、繁殖力高等優(yōu)良特性［1］。在繁殖性能表現(xiàn)方面，黔北麻羊性成熟較早，公母羊4月齡基本性成熟，公羊6月齡配種，母羊8月齡左右配種，全年可發(fā)情［2］。有研究發(fā)現(xiàn)，黔北麻羊公羊一年四季均可配種，但其精液品質(zhì)在很大程度上受環(huán)境影響［3］。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）是一類需要在金屬離子的輔助下才能正常發(fā)揮生理作用的蛋白酶，細胞外基質(zhì)（ECM）中的各種蛋白成分幾乎都能被MMPs降解［4］。在早期研究中，基質(zhì)金屬蛋白酶15基因（matrixmetalloproteinases15，MMP15）即MT2-MMP，作為MMPs家族中第二個被發(fā)現(xiàn)的成員，首次是在人類肺的cDNA文庫中被發(fā)現(xiàn)；其表達產(chǎn)物由669個氨基酸組成，不同于在多種組織中呈現(xiàn)低表達，它在腫瘤組織中呈高表達水平，不僅參與細胞外基質(zhì)的降解，控制著細胞外基質(zhì)的連接，還可以通過激活MMP-2參與腫瘤細胞對周圍正常細胞的侵襲和腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移［5］，且MMP15基因的高表達還與疾病發(fā)展晚期或病變的侵襲性具有強相關(guān)性［6］。Tao等［7］研究發(fā)現(xiàn)，具有催化活性的MMP15促進了細胞的運動而不是轉(zhuǎn)化；Fortunato等［8］研究發(fā)現(xiàn)，人類羊絨毛膜有一個完整的MMP系統(tǒng)，內(nèi)源性基質(zhì)金屬蛋白酶在人胎膜中被激活有助于膜弱化并導致胎膜破裂。MMP15在哺乳動物性腺中也呈現(xiàn)高表達，它是參與卵泡破裂過程的蛋白酶中的唯一LH（促黃體素）誘導蛋白酶［9］。目前有關(guān)MMP15基因在山羊方面的研究還未見報道，在其不同年齡階段睪丸的表達情況尚不明確。

蛋白激酶C相互作用蛋白1基因（proteinthatinteractswithCkinase1，PICK1）在哺乳動物各種組織內(nèi)均有表達，其作為一種外周膜蛋白基因，特別在大腦、睪丸等組織中有著較高水平的表達，PICK1蛋白上有一個PDZ結(jié)構(gòu)域，Xu等［10］經(jīng)過研究已經(jīng)證實，該結(jié)構(gòu)有著與配體蛋白結(jié)合力強的特點，具有能特異性結(jié)合脂質(zhì)分子以及促進精子頂體的正常形成等功能。有研究表明，雄性PICK1基因敲除的小鼠是完全不育的，其表現(xiàn)類型類似于人類疾病球形精子癥［11］。同時，He等［12］已經(jīng)證實，PICK1在精子細胞中缺乏會導致異常高爾基體囊泡轉(zhuǎn)移到頂體，破壞頂體的正常形成導致畸形精子，使雄性動物不育。也有研究表明，PICK1基因在睪丸組織中下調(diào)可能是導致雄性生精功能障礙的重要原因之一［13］。此外，PICK1蛋白可以作為一個錨定蛋白，與各種膜蛋白受體的亞基結(jié)合并且使該受體磷酸化［14］。如果能夠充分利用PICK1蛋白的這些特性，將PICK1蛋白PDZ結(jié)構(gòu)域上的靶點用生物小分子搶先占領(lǐng)，就可以達到阻礙其與配體蛋白結(jié)合的效果，達到阻止PICK1蛋白發(fā)揮作用的目的，從而發(fā)揮藥物治療疾病的作用［15-16］。由此可知PICK1基因是很有前景的疾病治療及雄性繁殖障礙治療的靶基因，極具研究意義。但現(xiàn)有關(guān)PICK1基因在山羊睪丸中的表達情況還未見報道，故以黔北麻羊為研究對象，探究MMP15、PICK1基因在黔北麻羊不同月齡睪丸組織中的表達規(guī)律，以期為研究山羊繁殖力提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗動物

黔北麻羊公羊睪丸組織由貴州省習水縣富興畜牧業(yè)開發(fā)公司提供，閹割后迅速采集1、3、6、9、12月齡各3只羊的睪丸組織，置于液氮中運回實驗室于-80℃冰箱妥善保存。

1.2試驗試劑

TRIzol@Reagent試劑盒（貴州綠盟英創(chuàng)生物科技有限公司）；熒光定量試劑2×SYBRPremixExTaqTMq-PCRMix（擎科生物科技有限公司）；StarScriptII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Genstar）（貴州西寶生物有限公司）。DEPC水、丙三醇（貴州艾瑞特生物有限公司）。

1.3試驗儀器

移液槍由德國Eppendprf公司購入；超微量分光光度計（NANODROP2000型）采購自美國ThermoFisher公司；水平電泳儀（DYCP-31C）購自北京六一儀器廠；PCR擴增儀（C1000TouchTM）、實時熒光定量PCR儀（型號為CFX96RealTimeSystem）、凝膠成像系統(tǒng)（UniversalHoodⅡ）均從美國BIO-RAD有限公司購入。高溫高壓滅菌鍋（HRLM-80）購自青島海爾集團；超凈工作臺（SW-CJ-2D）購自蘇州江東精密儀器有限公司。

1.4試驗方法

1.4.1引物設(shè)計

根據(jù)GenBank公布的山羊MMP15基因序列（登錄號：XM_018062063.1）以及PICK1基因的基因序列（登錄號：XM_018048745.1），利用PrimerPremier5.0軟件進行引物設(shè)計，以β-actin作為內(nèi)參基因，設(shè)計引物后交由上海生工生物工程技術(shù)服務股份有限公司合成。引物基本信息見表1。

1.4.2RNA的提取及cDNA第一鏈合成

使用TRIzo1@Reagent試劑盒分別提取黔北麻羊不同月齡（1、3、6、9、12月齡）睪丸組織中的RNA。使用超微量分光光度計測定其濃度與純度并記錄數(shù)值，將峰圖單一、曲線平滑、OD260/OD280比值在1.8～2.1間的RNA使用TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。將不同月齡睪丸提取的RNA分別定量為1000ng/μL，反轉(zhuǎn)錄體系為20μL：dNTPmix（2.5mmol/LEach）4μL，Primermix2μL，RNA模板2μL，5xRTBuffer4μL，DTT（0.1mol/L）2μL，HiFiScript1μL，RNase-FreeddH2O5μL。PCR程序：42℃孵育50min，85℃孵育5min，4℃保存產(chǎn)物。程序結(jié)束后將其產(chǎn)物于-20℃冰箱保存以備后續(xù)試驗使用。

1.4.3qRT-PCR檢測睪丸組織中PICK1、MMP15表達情況

以β-actin為內(nèi)參基因，檢測PICK1、MMP15基因在不同月齡黔北麻羊睪丸組織中的表達量。qRT-PCR反應體系為（10μL）：cDNA模板0.5μL，2×SYBRPremixExTaqTM酶5μL，上、下游引物（10pmol/μL）各0.4μL，ddH2O3.7μL。qRT-PCR反應程序：95℃預變性2min，95℃變性15s，退火30s，72℃延伸30s，40個循環(huán)，熔解曲線由機器自動設(shè)置，每個試驗設(shè)置3個重復。

1.4.4建立基因標準曲線

1.4.4.1熒光產(chǎn)物凝膠回收

將收集得到的qRT-PCR產(chǎn)物，按照qRT-PCR產(chǎn)物∶DNALoadingBuffer=5∶1的體積比進行混合，再將混合物以120V的電壓進行凝膠電泳35min。根據(jù)膠回收試劑盒說明書進行目的基因片段大小部分凝膠的回收，使用超微量分光光度計測定其濃度與純度并記錄數(shù)值，并將回收得到的目的DNA片段置于-20℃冰箱保存以備使用。

1.4.4.2目的基因的連接與轉(zhuǎn)化

在超凈工作臺內(nèi)，使用T克隆試劑盒，將回收得到的純化DNA片段先進行T載體的連接。將連接液短暫離心充分混勻后于金屬浴16℃過夜連接，再將連接好的載體轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)細胞。轉(zhuǎn)化體系為10μL：膠回收產(chǎn)物5.7μL，PTOPO-TⅡVector（20ng/μL）1μL，10×Enhancer1μL，sterilizedddH2O2.3μL；陽性對照組組分為：800bpControl（20ng/μL）1μL，PTOPO-TⅡVector（20ng/μL）1μL，10×Enhancer1μL，sterilizedddH2O7μL。

1.4.4.3單菌落的培養(yǎng)與擴繁

將培養(yǎng)得到的菌落平板進行單菌落的繼續(xù)培養(yǎng)，每個離心管中組分為：3μL氨芐青霉素、3mL液體培養(yǎng)基及單個菌落，37℃震蕩培養(yǎng)12h后進行菌液PCR驗證；將驗證的陽性菌液在50mL離心管內(nèi)再次擴繁，其體系為：20mL液體培養(yǎng)基、菌液20μL、氨芐青霉素20μL，37℃震蕩培養(yǎng)12h。培養(yǎng)完成后再次做菌液PCR，確定為擴繁的目的基因菌液。

1.4.4.4目的基因質(zhì)粒提取

使用Endo-freePlasmidMiniKitⅡ試劑盒說明書提取陽性菌液質(zhì)粒，測其濃度記錄數(shù)據(jù)，將得到的質(zhì)粒置于-20℃冰箱保存。

1.4.4.5基因的標準曲線建立

將陽性質(zhì)粒稀釋為6個不同濃度梯度，每一個濃度梯度濃度值與上一個梯度濃度相差10倍。將不同梯度濃度進行標準曲線qRT-PCR檢測，反應體系為（10μL）：2×SYBRPremixExTaqTM酶5μL，上、下游引物各（10pmol/μL）0.4μL，不同濃度的質(zhì)粒0.5μL，ddH2O3.7μL。各基因退火溫度見表1，qRT-PCR程序與實時熒光定量檢測基因表達量一致。

1.4.5數(shù)據(jù)分析

利用2-△△Ct相對定量計算目的基因的相對表達量。使用SPSS20.0軟件中One-WayANOVA進行單因素方差分析，使用LSD法進行差異顯著性檢驗，試驗結(jié)果采用平均值±標準差來表示，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準，P<0.01作為差異極顯著性的判斷標準。

2結(jié)果與分析

2.1MMP15、PICK1基因在各組織中PCR擴增產(chǎn)物的檢測

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行普通PCR擴增，再用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增的DNA片段，結(jié)果如圖1所示。MMP15基因片段大小為168bp，PICK1基因片段大小為127bp，與預測擴增片段大小一致，且擴增目的基因產(chǎn)物條帶清晰，特異性較強，引物特異性良好，可用于進行下一步試驗。

2.2qRT-PCR的擴增曲線與熔解曲線

由圖2、圖3可知，在黔北麻羊不同月齡睪丸中，MMP15、PICK1基因的擴增曲線均呈現(xiàn)出“S”型，曲線走勢一致。熔解曲線也均呈現(xiàn)單峰，條帶緊密且無雜帶、無雙峰的出現(xiàn)，無引物二聚體，特異性強。

2.3MMP15與PICK1基因在黔北麻羊不同月齡睪丸中的表達規(guī)律分析

2.3.1黔北麻羊不同月齡睪丸中MMP15基因的表達分析

如圖4所示，MMP15在黔北麻羊不同月齡睪丸中均有表達，且在5個不同月齡睪丸中表達量從高到低依次是：12月齡＞1月齡＞9月齡＞3月齡＞6月齡；其中MMP15基因在12月齡中表達量最高，12月齡與1月齡的表達不顯著（P>0.05），二者表達量均極顯著高于3月齡、6月齡、9月齡（P<0.01）；9月齡顯著表達高于3月齡（P<0.05），極顯著表達高于6月齡（P<0.01）；3月齡極顯著表達高于6月齡（P<0.01）；在6月齡中表達量最低。

2.3.2黔北麻羊不同月齡睪丸組織中PICK1基因的表達量分析

如圖5所示，PICK1基因在黔北麻羊不同月齡睪丸中均有著不同程度的表達。在5個不同月齡睪丸中的表達量從高到低排列依次是：3月齡＞6月齡＞12月齡＞9月齡＞1月齡。其中3月齡表達量最高，1月齡表達量最低；3、6月齡其表達量極顯著高于9、12月齡（P<0.01）；1月齡表達量均極顯著低于其他月齡（P<0.01）。

2.3.3MMP15、PICK1、β-actin基因菌液PCR驗證結(jié)果

將經(jīng)過qRT-PCR擴增的MMP15、PICK1、β-actin基因產(chǎn)物進行膠回收，回收后根據(jù)T克隆試劑盒進行目的基因的連接、轉(zhuǎn)化，隨后挑取單菌落進行擴繁，將擴繁的菌液進行PCR驗證（圖6）。凝膠條帶較清晰、干凈，重復孔條帶一致，菌液擴繁成功，所得擴繁菌液可用于質(zhì)粒提取，進行下一步試驗。

2.3.4成功建立MMP15、PICK1、β-actin基因標準曲線

由圖7、8、9可見，MMP15、PICK1、β-actin基因的質(zhì)粒經(jīng)過質(zhì)粒qRT-PCR后，得到了清晰、平滑的擴增曲線及“S”型熔解曲線，其曲線平滑且僅有單一波峰，整體趨勢一致，擴增性良好。其標準曲線平直，引物擴增效率良好，提示各基因的標準曲線建立成功。

3結(jié)論與討論

本試驗以黔北麻羊為研究對象，利用qRT-PCR技術(shù)，圍繞黔北麻羊不同月齡睪丸中MMP15、PICK1基因的表達情況展開試驗，結(jié)果顯示MMP15、PICK1基因在黔北麻羊5個不同月齡的睪丸中均有不同程度表達。通過對MMP15基因及PICK1基因在黔北麻羊不同月齡睪丸中的表達量進行分析，發(fā)現(xiàn)MMP15基因在6月齡中表達量最低，1月齡與12月齡的表達量最高，MMP15基因的表達整體呈現(xiàn)先下降后提高的趨勢。PICK1基因在1月齡表達量最低，后出現(xiàn)上調(diào)，并在后面幾個月齡均保持高表達。

有研究表明，許多哺乳動物，如大鼠的生精上皮中能夠產(chǎn)生調(diào)節(jié)血睪屏障的生物活性肽；如F5多肽，它是一種能夠調(diào)控頂端胞外特化結(jié)構(gòu)（apicalectoplasmicspecialization，apicalES）連接蛋白的物質(zhì)，它在基質(zhì)金屬蛋白酶的作用下水解產(chǎn)生；正常生理狀態(tài)下F5多肽能夠誘導血睪屏障的重塑，增加屏障的滲透性，以此促進前細線期精子細胞跨越血睪屏障進入近腔室，進而促進精子的成熟［17］。已有研究證實，基質(zhì)金屬蛋白酶基因通過切割多種細胞外基質(zhì)（ECM）和非ECM靶點，對胚胎、睪丸等器官組織發(fā)育進程發(fā)揮重要作用［4］。此外，在敲除PICK1基因的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)與人圓頭精子癥相似的表型，因缺乏頂體而無法與卵子相結(jié)合而導致不孕；并首次將PICK1基因作為圓頭精子癥候選基因，證實了PICK1基因?qū)S持睪丸精子正常發(fā)育有著重要影響［18］。Xiao等［19］也發(fā)現(xiàn)PICK1基因敲除的小鼠表現(xiàn)出不育、睪丸縮小、精子數(shù)量下降、死精子增多、精子形態(tài)表現(xiàn)為圓頭精子癥等癥狀；更嚴重的還出現(xiàn)生精小管加速凋亡及精子活力嚴重下降的現(xiàn)象，故此推測PICK1基因不僅影響精子頂體的正常形成，還可能作用于其他途徑從而影響精子的發(fā)生［20］。雄性動物的睪丸發(fā)育狀況能夠直接影響雄性動物的性成熟時間及其精液品質(zhì)，同時決定著其繁殖性能的發(fā)揮［21］。山羊睪丸曲精細管的橫截面細胞總數(shù)隨年齡增長而增多，且6月齡顯著高于1、3月齡［22］，且有研究表明，睪丸生精小管的橫截面積決定了睪丸的生精效率［23］，這都表明，睪丸發(fā)育越好，其生精效率越高，與器官發(fā)育有關(guān)的MMP15基因以及與生精活動有關(guān)的PICK1基因在山羊睪丸中的表達應該隨山羊年齡的增長而呈現(xiàn)出不同的表達水平。

山羊出生后睪丸發(fā)育過程就是器官由生長發(fā)育到生精階段，薄東東［24］對山羊睪丸發(fā)育階段的研究發(fā)現(xiàn)，山羊睪丸發(fā)育的高峰期有兩個，分別是出生前后及初情期；還發(fā)現(xiàn)山羊睪丸組織發(fā)育在120～180d時由睪丸發(fā)育期進入睪丸生精期。根據(jù)MMP15基因及PICK1基因的生理作用，再結(jié)合山羊睪丸的發(fā)育規(guī)律及性成熟時期來看，在出生前山羊睪丸進入第一次發(fā)育期，器官發(fā)育速度提高，與器官發(fā)育有關(guān)的MMP15基因呈現(xiàn)高表達，而與生精功能緊密相關(guān)的PICK1基因的表達量并不高，與本試驗結(jié)果基本一致。睪丸發(fā)育后期，睪丸逐步進入精子發(fā)生期，此階段，與器官生長相關(guān)基因的表達量會出現(xiàn)降低趨勢，與生精相關(guān)基因表達量呈上調(diào)趨勢［25］。這反向證明了山羊在6月齡左右MMP15基因的表達應該呈現(xiàn)下降趨勢，而PICK1基因的表達應該出現(xiàn)上調(diào)。在6月齡之后，山羊睪丸會逐漸進入第二次快速發(fā)育期，精子細胞活動增強，逐漸從生精小管上皮細胞向管腔移動，而基質(zhì)金屬蛋白酶能促進細胞遷移［26］，所以MMP15基因在山羊的睪丸兩次快速發(fā)育期時表達量應呈現(xiàn)高水平。PICK1基因是參與調(diào)控精子頂體形成的重要基因，因此在睪丸生精機能活躍時應呈現(xiàn)較高水平的表達，即在6月齡及6月齡后都維持高水平的表達。本試驗結(jié)果與前人的研究結(jié)論相一致，提示MMP15、PICK1基因可能也是影響黔北麻羊睪丸發(fā)育及生精功能正常發(fā)揮的重要影響因子。

本次試驗結(jié)果顯示，MMP15、PICK1基因在不同月齡黔北麻羊公羊睪丸組織中均有表達，MMP15在1～3月齡（睪丸發(fā)育期）及9～12月齡（精子發(fā)生期）表達相對較高，在性成熟初期表達量最低；PICK1在1月齡表達量最低，在3～6月齡表達量高，并在9～12月齡表達較高且趨于穩(wěn)定，故表明MMP15、PICK1基因可能對維持睪丸正常的生長發(fā)育及精子生成均有著重要作用，本次結(jié)果可為后續(xù)研究山羊的高繁殖性能提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，但MMP15、PICK1基因影響黔北麻羊睪丸功能的具體機制還有待深入研究。

（責任編輯：胡吉鳳）

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